pemfiguslu hastaların sağlıklı birinci derece akrabalarında pemfigus ...

İNDİREKT NDİREKT İMMÜNOFLORESAN TETKİK (İİF)
1:10 1:20 1:40 1:80 1:160...
seri serum dilüsyonları
Floresan ile işaretlenmiş
antihuman immünoglobulin
+ Epitelyal substrat
Epitelyal substrat +
serum dilüsyonlarından
biri
Şekil 12. İndirekt immünofloresan yönteminin uygulanışı
Yıkama
Yıkama UV Mikroskop
Spesifik antikorların tespiti için ELISA yöntemi kullanıldı. Bu yöntemde
sırasıyla şu işlemler uygulandı (Şekil 13); 1) Dsg kaplı 48 adet çukurcuğun 46’sına
1/101 oranında sulandırılan serumlardan ve ilk ikisine pozitif ve negatif kontrolleri
oluşturmak üzere kalibratör 1 ve kalibratör 2’den 100’er µl eklendi ve oda sıcaklığında
60 dakika enkübe edildi. 2) Sodyum dihidrojen fosfat+ sodyum klorid+ Tween-20
içeren yıkama solüsyonu ile 10 kat sulandırılıp 4 kez otomatik olarak yıkandı. 3) Fare
kaynaklı peroksidaz ile konjuge monoklonal anti-human IgG, bromphenol blue, p-
hidroksifenilasetik asit, proclin150, HEPES, BSA içeren dilüent ile 100 kat
sulandırıldıktan sonra 48 çukurcuğa 100’er µl ilave edilerek 60 dakika enkübe edildi.
4) 2‘de anlatıldığı şekilde yıkandı. 5) Kullanıma hazır substrat solüsyonu yani
trimetilbenzidin/hidrojen peroksit (TMB/H2O2)’den 48 kuyucuğa da 100’er µl ilave
edilip 30 dakika enkübe edildi. 6) Kullanıma hazır durdurma solüsyonu yani 1.0 N
sülfirik asit solüsyonu ilave edildi ve reaksiyon durduruldu. 7) Enzimin etki ettiği
substrat kromojenden oluşan renk indeksi fotometrik olarak 450 nm dalga boyunda
ölçüldü, anti-Dsg otoantikoru çukurcuktaki Dsg antijenine bağlanınca son aşamada sarı
renk görüldü. 8) İndex değerleri hesaplandı.
20