Williams-Beureni sÃ¼ndroomi kromosoomi regiooni 22 valgu ...

More documents

Recommendations

Info

Joonis 3. Täispikka WBSCR22 kodeeriva plasmiidi pCG-WBSCR22 skeem koos restriktsiooniliste lõikesaitidega. Kodeeritava valgu N-terminuses paikneb E2Tag, mis võimaldab vaktu detekteerimist anti-E2Tag antikeha abil. Valgu ekspressioon imetajarakkudes toimub CMV kontrolli alt. 2.2.3 Eukarüootsete rakkude transfektsioon Eukarüootsete rakkude tranfektsioon viidi läbi elektroporatsiooni meetodil. Selleks aspireeriti koekultuuri tassidel kasvanud rakkudelt sööde, rakke pesti ühe korra PBS-iga, võeti seejärel trüpsiini abiga plastikult lahti ning koguti koekultuuri tuubi, millesse oli eelnevalt lisatud 5 ml söödet. Rakud tsentrifuugiti 5 minutit 1000 rpm 20ºC juures (Eppendorf Centrifuge 5810 R) ning suspendeeriti söötmes, mis sisaldas 5 mM Na-BES puhvrit (pH 7,5). Seejärel segati küvetis 250 µl rakususpensiooni sobivas koguses vastava(te) plasmiidi(de) ning 50 µg carrier DNA-ga (lõhe spermi DNA). Elektroporatsioon viidi läbi BioRad Gene Pulser II aparaadiga parameetrite 975 µF ja 220 V juures. Pärast elektroporatsiooni kanti rakud küvetist 3 ml söödet sisaldavasse koekultuuri tuubi ning tsentrifuugiti 5 minutit 1000 rpm 20ºC juures. Sööde aspireeriti, rakud suspendeeriti värskes söötmes ning kanti koekultuuri tassidele. Immunofluorestsentsanalüüsi jaoks oli eelnevalt tassidele asetatud 18x18 mm läbimõõduga katteklaasid. 16
2.2.4 Western blot analüüs 24 tundi pärast poratsiooni rakke pesti PBS-ga ning võeti PBS/3mM EDTA abiga plaatidelt lahti. Rakud koguti 1,5 ml tsentrifuugituubidesse ja tsentrifuugiti 5 minuti jooksul põhja 4 °C lauatsentrifuugis (Biofuge fresco) pööretel 4000 rpm-i. Rakusade suspendeeriti 50 µl PBS-s ning lüüsiti ja denatureeriti 50 µl 2xLaemmli puhvri + DTT (4% SDS, 20% glütserool, 120 mM Tris pH 6,8; 0,01% broomfenoolsinine, 100 mM DTT) lisamise ning 10 minuti vältel 100 °C juures kuumutamisega. Valgud lahutati SDS-PAAG elektroforeesil 1xSDS puhvris ning kanti PVDF membraanile (Immobilon-P Millipore 0,45 µm) semy-dry blotting meetodil (Trans-Blot® SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell, Bio-Rad). Pärast ülekannet asetati membraan üleöö 4 °C juurde blokeerimislahusesse (1xTBS; 0,05% Tween 20; 5% lõssipulber). Järgmisel päeval inkubeeriti membraani 1 tund peroksüdaasiga konjugeeritud antikehi (5E11-HRP, anti-E2Tag) sisaldavas lahuses (1xTBS; 0,05% Tween 20; 1% lõssipulber; 1:10 000 5E11-HRP) ning pesti tund aega pesulahusega [100 mM Tris (pH 7,5); 170 mM NaCl; 0,1% Tween 20], vahetades iga 20 minuti möödudes pesulahust. Peroksüdaasiga konjugeeritud antikehade signaal detekteeriti ECL lahustega (Amersham Pharmacia Biotech), järgides tootjapoolset protokolli. 2.2.5 Immunofluorestsentsanalüüs SiHa rakkudesse transfekteeriti 1000 ng WBSCR22 või WBSCR22NTD või 3000 ng WBSCR22CTD ekspressioonivektorit, 24 tundi hiljem rakud fikseeriti alusklaasidel -20 °C 1:1 metanool:atsetoon seguga -20 °C juures 15 minuti jooksul. Seejäral segu aspireeriti ning rakkudega alusklaase hoiti kuni järgnevate etappideni -20 °C külmkapis. Klaase pesti 3 korda PBS-ga ning blokeeriti 30 minutit 1 ml 0,1 % BSA-PBS-ga. Seejärel inkubeeriti klaase 1 tund toatemperatuuril primaarse antikehaga 0,1% BSA-PBS lahuses. Pärast seda pesti klaase 3x5 minutit PBS-ga, ning inkubeeriti 1 tund pimedas toatemperatuuril sekundaarse antikehaga 0,1% BSA-PBS lahuses. Alusklaase pesti 3x4 minutit PBS-ga ning rakutuumade visualiseerimiseks lisati PBS lahusele DNA-seoselist propiidiumjodiidi (fluorestsents punane) ning inkubeeriti 10 minutit. Klaasid asetati tagurpidi alusklaasidele 10 µl sulunduslahusesse (0,5 M Tris pH 8,0; 50% glütserool). Juhul kui propiidiumjodiidi ei kasutatud, sisaldas sulundusvedelik DNA-värvi DAPI (fluorestsents roheline) (Slowfade GOLD antifade reagent with DAPI, Invitrogen), mida lisati alusklaasile 6 µl. 17
Page 1 and 2: TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TEHNOLOOG
Page 3 and 4: KASUTATUD LÜHENDID DAPI - 4’,6-d
Page 5 and 6: 1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE 1.1 William
Page 7 and 8: 320 kb. Noolte abil on näidatud LC
Page 9 and 10: EIF4H LAT2 RFC2 CLIP2 GTF2IRD1 WBSC
Page 11 and 12: Edasised uuringud näitasid, et Mer
Page 13 and 14: sel moel, et ta seostub otse tuuma
Page 15: 2.2 Materjal ja metoodika 2.2.1 Pla
Page 19 and 20: 2.3 Tulemused ja arutelu 2.3.1 WBSC
Page 21 and 22: antikeha kui ka kommertsiaalset pol
Page 23 and 24: IF III - WBSCR22NTD DAPI Anti-WBSCR
Page 25 and 26: RESÜMEE Cellular localization of W
Page 27 and 28: KIRJANDUSE LOETELU 1. Bilanges B, V
Page 29 and 30: wingless protein and is in the Will

Williams-Beureni sÃ¼ndroomi kromosoomi regiooni 22 valgu ...

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?