Williams-Beureni sündroomi kromosoomi regiooni 22 valgu ...

TARTU ÜLIKOOL
LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND
MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT
MIKROBIOLOOGIA JA VIROLOOGIA ÕPPETOOL
Markko Salumäe
Williams-Beureni sündroomi kromosoomi regiooni 22 valgu
lokalisatsioon rakus
Bakalaureusetöö
Juhendajad: M. Sc Liisi Võsa
Ph. D Reet Kurg
Tartu 2011

SISUKORD
SISUKORD ............................................................................................................................................. 2
KASUTATUD LÜHENDID ................................................................................................................... 3
SISSEJUHATUS ..................................................................................................................................... 4
1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE ............................................................................................................. 5
1.1 Williams-Beureni sündroom ................................................................................................... 5
1.2 Williams-Beureni sündroomi geneetilised alused ................................................................... 6
1.3 Williams-Beureni sündroomi lookusest ekspresseeritavad valgud ......................................... 7
1.4 WBSCR22 iseloomustus ja ülevaade funktsiooni uuringutest .............................................. 10
1.5 Tuuma lokalisatsiooni signaal ning valkude transport raku tuuma ....................................... 12
2. EKSPERIMENTAALNE OSA ......................................................................................................... 14
2.1 Töö eesmärgid ............................................................................................................................. 14
2.2 Materjal ja metoodika.................................................................................................................. 15
2.2.1 Plasmiidid ............................................................................................................................. 15
2.2.2 Eukarüootsete rakkude kasvatamine .................................................................................... 15
2.2.3 Eukarüootsete rakkude transfektsioon .................................................................................. 16
2.2.4 Western blot analüüs ............................................................................................................ 17
2.2.5 Immunofluorestsentsanalüüs ................................................................................................ 17
2.3 Tulemused ja arutelu ................................................................................................................... 19
2.3.1 WBSCR22 täispika valgu ja deletantide ekspressioon SiHa rakkudes ................................ 19
2.3.2 WBSCR22 C-terminaalne domeen on vajalik valgu transpordiks tuuma ............................ 20
KOKKUVÕTE ...................................................................................................................................... 24
RESÜMEE ............................................................................................................................................ 25
KIRJANDUSE LOETELU ................................................................................................................... 27
KASUTATUD VEEBIAADRESSID ................................................................................................... 30
2

KASUTATUD LÜHENDID
DAPI – 4’,6-diamidino-2-fenüülindool (4’,6-diamidono-2-phenylindole)
IF – immunofluorestsentsanalüüs
LCR – madalakoopiaarvulised kordusjärjestused (low copy repeats)
Merm1 – metastaaside moodustumisega seotud metüültransferaas 1 (metastasis-related
methyltransferase 1)
MTD – metüültransferaasne domeen (methyltransferase domain)
NAHR – mittealleelne homoloogne rekombinatsioon (non-allelic homologous
recombination)
NLS – tuuma lokalisatsiooni signaal (nuclear localization signal)
NPC – tuuma poori kompleks (nuclear pore complex)
SAM – S-adenosüül-L-metioniin (S-adenosyl-L-methionine)
WBS – Williams-Beureni sündroom (Williams-Beuren syndrome)
WBSCR22 – Williams-Beureni sündroomi kromosoomi regioon 22 (Williams Beuren
syndrome chromosome region 22)
WBSCR22CTD – Williams-Beureni sündroomi kromosoomi regiooni 22 produkti C-
terminaalne domeen (Williams Beuren syndrome chromosome region 22 C-terminal domain)
WBSCR22NTD – Williams-Beureni sündroomi kromosoomi regiooni 22 produkti N-
terminaalne domeen (Williams Beuren syndrome chromosome region 22 N-terminal domain)
3

SISSEJUHATUS
Williams-Beureni sündroom (WBS) on haruldane kromosomaalne häire, mis on põhjustatud
hemisügootsest 28 geeni hõlmavast mikrodeletsioonist inimese kromosoomis 7q11.23.
Esimene geen, mis WBS lookuses kindlaks tehti, oli elastiini geen (ELN), mille hemisügootne
deletsioon põhjustab kardiovaskulaarseid haiguseid. WBS on multisüsteemne arenguhäire,
mille üheks väljenduseks on spetsiifiline kognitiivne ja käitumuslik fenotüüp. Oma unikaalse
käitumuslike häirete profiili tõttu on WBS pikka aega olnud neuroteadlaste huviorbiidis. WBS
tõstatab fundamentaalseid küsimusi sotsiaalse käitumise neuroloogilistest alustest, aju ja
teadvuse arengu modulaarsusest ning pakub võimalust avastada geneetilisi mõjusid
kompleksele ajutööle lähenedes probleemile „alt üles“ põhimõttel ehk kirjeldades kõigepealt
probleemi põhjustajat.
Haigusi põhjustavate geenide identifitseerimine ja nende poolt kodeeritud valkude uurimine
on tähtis etapp vajaliku ravi väljatöötamisel. WBS lookusest ekspresseeritavaid valke on
hetkel vähe uuritud, kuid see on käimasolev protsess. Peale ELN geeni on suuremat
tähelepanu pööratud sellistele geenidele nagu BAZ1B, CLIP2, LIMK1, GTF2I ja GTF2IRD2.
Aju arenguga on nendest omakorda seostatud geene CLIP2, LIMK1, GTF2I ja GTF2IRD2.
Meie uurimisrühmas on käimas WBSCR22 valgu funktsionaalsuse uuringud. On näidatud, et
vaatlusalune valk lokaliseerub rakutuumas. Antud töö eesmärgiks oli uurida WBSCR22 valgu
tuuma lokalisatsiooni signaali (NLS – nuclear localization signal) sisaldava C-terminaalse
domeeni vajalikkust tuuma transpordil, et jõuda lähemale WBSCR22 valgu tuuma transpordi
mehhanismile.
4

1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE
1.1 Williams-Beureni sündroom
Williams-Beureni sündroomi kirjeldasid esmalt 1950ndatel Fancon, Lightwood ja Payne kui
idiopaatilist infatiilset hüperkaltseemiat koos kasvujõuetusega. WBS patsiendid omavad
kergesti eristatavat omapärast näo kuju, neil esineb kasvupeetus ning südame-ja
veresoonkonna haigused. Näo tunnusjoonteks on lai suu, ümarad põsed, täidlased huuled, lai
otsaesine ja tähnilised silmaiirised (joonis 1). Iseloomulik on ka kognitiivne ja käitumuslik
profiil. Käitumuslikud tunnusjooned - ülisõbralikkus, seltsivus, empaatia ning suutmatus
hoida sotsiaalseid kontakte - püsivad lapseeast kuni täiskasvanueani. Selgelt on näha nõrkusi
igapäevategevustega toimetulekus ning motoorses võimekuses. Lisaks on esindatud
enneaegne vananemine, hüpertoonia, neeruanomaaliad, hambumushäire (maloklusioon),
kõverselgsus ja liigeste liikuvuse häired (Schubert, 2009). Veel võib esineda endokriinseid
probleeme nagu hüperkaltseemia ja halvenenud glükoositaluvus (Meyer-Lindenberg jt.,
2006). Tüüpilisteks sümptomiteks on supravalvulaarne aordi stenoos ehk aordi kitsenemine
75 % juhtudest (Schubert, 2009), leebe kuni mõõdukas intellektuaalne puue ja õpiraskused.
Suhteliselt heal tasemel on arenenud verbaalne lühimälu ja keelelised võimed, samas on
visuaalne ruumitaju nõrgalt arenenud. Lisaks avalduvad WBS patsientidel mittesotsiaalne
ärevushäire spetsiifilise foobia kujul ning tähelepanu puudulikkuse ja hüperaktiivsuse häire
(Osborne ja Mervis, 2010). WBS esinemistõenäosus on umbes 1/20 000 kuni 1/7500,
moodustades kuni 6% geneetilise põhjusega vaimsete alaarengute juhtumitest (Meyer-
Lindenberg jt., 2006).
Joonis 1. Piltidel on näha WBS patsientidele iseloomulikke näojooni: lai suu, ümarad põsed,
täidlased huuled, lai otsaesine, tähnilised silmaiirised ja väikesed normaalsest laiemate
vahedega hambad (Järvinen-Pasley jt., 2008).
5

1.2 Williams-Beureni sündroomi geneetilised alused
WBS on põhjustatud umbes 28 geeni hõlmava 1,5 - 1,8 Mb suuruse ala hemisügootse
deletsiooni poolt 7. kromosoomis. WBS regioon koosneb ühekoopialisest kodeerivast alast
(~1,2 Mb), millega külgneb kolm madalakoopiaarvulist kordusjärjestust (LCR – low copy
repeats). Levinud deletsioon WBS-i patsientide hulgas hõlmab 1,5 Mb suurust genoomi ala
arvatavate murdumispunktidega tsentromeerses ja mediaalses LCR B-plokis (joonis 2).
Tavaliselt tekib WBS juhuslikult, kuid mõnedel juhtudel on kirjeldatud autosoomdominantset
pärilikkust (Schubert, 2009). LCR-id on üksteisele väga sarnased ja kui toimub
nende korduste valepaardumine meioosi ajal, viib see ebavõrdse ristsiirdeni, põhjustades
korduste vahele jääva ala deleteerumise (Doll ja Grzechik, 2001; Schubert, 2009). Umbes 5%
inimese genoomist sisaldab suhteliselt pikkasid (> 10 kb) ja üksteisele sarnaseid (> 95%)
LCR-i järjestusi. Kõrge sarnasusega ja kindla pikkusega täielikult paardunud järjestused
võivad viia mittealleelse homoloogilise rekombinatsiooni tekkeni (NAHR – non-allelic
homologous recombination). Interkromosomaalne või interkromatiidne NAHR valepaardunud
kõrge sarnasusega ja sama orientatsiooniga kromosoomi LCR plokkide Bm ja Bc vahel WBS
regioonis viib deletsioonini ja korduste vahele jääva regiooni retsiprookse duplikatsioonini.
Intrakromatiidne NAHR LCR plokkide Bm ja Bc vahel tekitab WBS regiooni deletsiooni ja
retsiprookse atsentrilise rõngaskromosoomi (Schubert, 2009).
Joonis 2. Skemaatiline ülevaade WBS piirkonna deletsioonisündmustest mittealleelsel
homoloogsel rekombinatsioonil. Ala keskel on halliga tähistatud geene sisaldav piirkond, mis
on mõlemalt poolt piiratud LCR-i plokkidega. Kolm erinevat LCR-i on tähistatud erineva
värvi ning tähega (A, B ja C); väikese tähega on tähistatud ploki paiknemine WBS lookuse
suhtes kas tsentromeerselt (c), mediaalselt (m) või telomeerselt (t). Iga ploki suurus on umbes
6

320 kb. Noolte abil on näidatud LCR-i plokkide orientatsioon ning nende kohal punase, sinise
või rohelise kirjaga on tähistatud vastavasse piirkonda jäävad geenid. Kujutatud on
sagedamini esindatud 1,5 Mb (>95%) ja 1,8 Mb (3-5 %) deletsioonid (Marla et al., 2010).
1.3 Williams-Beureni sündroomi lookusest ekspresseeritavad valgud
Enim uuritud geen WBS lookuses on elastiini geen. Selle geeni produkt tropoelastiin
eksporditakse ekstratsellulaarsesse maatriksisse, kus tropoelastiini molekulid agregeeruvad
üksteisega ning seotakse ensümaatiliselt ristsildade abil suureks polümeeriks elastiiniks.
Lisaks struktuursele funktsioonile interakteerub elastiin ekstratsellulaarset maatriksit
ümbritsevate rakkudega. Ebapiisav elastogenees põhjustab silelihasrakkude vohamist ning
migreerumist. Üheks tagajärjeks on veresoonte kitsenemine ning elastsuse vähenemine, mis
põhjustab südameveresoonkonna haiguseid nagu aordi kitsenemine (Gimpel ja Schaefer,
2010).
Ülejäänud WBS piirkonnas olevaid geene on uuritud vähem. Järgnevalt toon tabelis 1 välja
WBS ühekoopialises regioonis (joonis 2) asuvate geenide nimed, nende poolt kodeeritavate
valkude nimed ning võimalusel lühikese iseloomustuse kasutades UniProtKB andmebaasi.
Tabel 1. Ülevaade WBS lookuses paiknevatest geenidest, nende poolt kodeeritavatest
valkudest ning teadaolevatest valgu funktsioonidest UniProtKB andmebaasi andmetel.
Geeni nimi Valgu nimi Iseloomustus
FZD9 Frizzled-9 Retseptor WNT valkudele.
BAZ1B Türosiin-proteiin kinaas
Põhiline komponent WICH kompleksis, mis
reguleerib paljude geenide transkriptsiooni, näiteks
polümeraasi I ja III transkriptsiooni, fosforüleerib
H2AX histooni Tyr 142 DNA vigastuse korral, osaleb
kromatiini struktuuri säilitamisel DNA
replikatsiooni protsessis, on seotud vitamiin D-ga
ning transrepresseerib geeni CYP27B1.
BCL7B
B-raku CLL/lümfoom 7
valgu perekonna liige B
Võib osaleda kopsuvähi arengus ja kasvus.
TBL2
Transdutsiin beeta Peale DNA kahjustust fosforüleeritakse ATM ja
sarnane valk 2
ATR kinaaside poolt.
7

Heeliks-ling-heeliks motiiviga transkriptsiooni
Williams-Beuren
MLXIPL,
repressor. Seondub kanoonilisele või
sündroomi kromosoomi
WBSCR14
mittekanoonillisele B-box järjestusele 5'-CACGTGregiooni
14 valk
3'.
ESCRT-I kompleksi komponent, mis reguleerib
Vaskulaarne valkude
vesikulaarset transpordiprotsessi. Vajatakse
VPS37D sorteerimisega seotud
endotsütootiliste ubikvitineeritud molekulide
valk 37D
toimetamiseks multivesikulaarsetesse kehadesse.
DnaJ homoloog, Ekspresseeritakse ajus, südames, neerudes, maksas,
DNAJC30 alamperekond C, liige kopsudes, põrnas, kõhus ja testistes. Seotud valkude
30
pakkimisega.
Võib olla seotud sünaptiliste vesiikulite dokkimises
presünapsi aktiivsetes tsoonides. Võib omada
STX1A Süntaksiin-1A
kriitilist rolli neurotransmitterite eksotsütoosis ning
vahendada Ca 2+ reguleeritud akrosomaalset
reaktsiooni spermis.
WBSCR26 - -
Alfa/beeta hüdrolaasi
Üle organismi ekspresseeritud . Kuulub AB
ABHD11 domeeni sisaldav valk
hüdrolaaside superperekonda.
11
CLDN3 Klaudiin 3 Tiheliiduste integraalne komponent
CLDN4 Klaudiin 4 Tiheliiduste integraalne komponent
Williams-Beuren
WBSCR27 sündroomi kromosoomi Võib omada metüültransferaasset aktiivsust.
regiooni 27 valk
Williams-Beuren
WBSCR28 sündroomi kromosoomi Tegemist võib olla membraanivalguga.
regiooni 28 valk
Proteiini kinaas, mis reguleerib aktiini filamentide
dünaamikat. Fosforüleerideb aktiini
LIM domeeniga kinaas seondumis/depolümeriseerimis faktorit kofiliini,
LIMK1
1
stabiliseerides sellega aktiini tsütoskeletti.
Stimuleerib neuriidi väljakasvu ja võib osaleda aju
arengus.
8

EIF4H
LAT2
RFC2
CLIP2
GTF2IRD1
WBSCR23
Eukarüootne
translatsiooni
initsiatsioonifaktor 4H
T-rakkude perekonna
aktivatsiooni linker,
liige 2
Replikatsioonifaktori C
alaühik 2
CAP-Gly domeeni
sisaldav linkerproteiin 2
Üldine
transkriptsioonifaktor II-
I kordusdomeeni
sisaldav proteiin 1
Williams-Beuren
sündroomi kromosoomi
regiooni 23 valk
Stimuleerib EIF4A RNA helikaalset aktiivsust
translatsiooni initsiatsiooni kompleksis. Seob
nõrgalt mRNA-d.
Osaleb FCER1 (high affinity immunoglobulin
epsilon receptor)-vahendatud signaliseerimises
nuumrakkudes. Võib samuti osaleda BCR (B-cell
antigen receptor)-vahendatud signaliseerimises ja
FCGR1(high affinity immunoglobulin gamma Fc
receptor I)-vahendatud signaliseerimises
müeloidsetes rakkudes. Fosforüleeritult
interakteerub GRB2-ga.
Vajalik praimeeritud DNA matriitsi elongatsiooniks
delta- ja epsilon DNA polümeraaside poolt
Näib ühendavat mikrotuubuleid DLB-le (dendritic
lamellar body). Võib osaleda neuronites
spetsiifiliste organellide translokatsiooni kontrollis.
Defitsiit põhjustab motoorseid ja kognitiivseid
häireid (van Hagen jt., 2007)
Omab potentsialset heeliks-ling-heeliks (HLH)
domeeni. Võib interakteeruda teiste HLH valkudega
ja funktsioneerida transkriptsioonifaktorina. On
seostatud spetsiifiliste näojoonte ja kognitiivse
profiili kujunemisega WBS patsientidel.
Valgu olemasolu ei ole kindel. Ennustatud
membraanset lokalisatsiooni.
WB sündroomi genotüüp–fenotüüp seoste identifitseerimine on raskendatud, sest
ebatüüpiliste deletsioonidega patsiente on äärmiselt vähe. Selliseid indiviide on kirjeldatud
vaid umbes 30 (Morris, 2006). Lisaks sellele omavad patsiendid erinevat geneetilist tausta
ning uuringuid viivad läbi erinevad arstid. Paljudel juhtudel pole kindlat deletsiooni
murdumispunkti määratletud ning isegi kui see on määratud, pole enamustel juhtudel uuritud
deletsioonipunkti naabruses olevate geenide ekspressioonimuutust. Seetõttu on kindlasti
mõistlik uurida WBS lookuse geenide funktsioone mudelorganismide, nagu näiteks hiire,
9

peal. 28 WBS lookuse geenist on erinevaid ühe geeni knock-out hiire mudeleid 11 (Osborne,
2010).
1.4 WBSCR22 iseloomustus ja ülevaade funktsiooni uuringutest
WBSCR22 geen koosneb 45 kb pikkusele DNA alale jaotunud 12 eksonist ja kodeerib 281
aminohappelist valku molekulmassiga 31,8 kDa ning isolektrilise punktiga pH 8,95 (Doll ja
Grzeschik, 2001). Bioinformaatiliselt on ennustatud, et vaatluse all olevas valgus esineb S-
adenosüül-L-metioniini (SAM) sõltuv metüültransferaasi domeen (MTD) (Wang jt., 1997) ja
kaheosaline tuuma lokalisatsiooni signaal (NLS – nuclear localization signal). On teada, et
SAM-sõltuvad metüültransferaasid omavad sarnast seitsmest β-lehest koosnevat
põhistruktuuri tuntud kui SAM-sõltuv MTaasne β-lehtstruktuur, kuid on võimelised
metüleerima erinevaid substraate alates väikestest molekulidest nagu katehool (1,2-
dihüdrobenseen) ja glütsiin kuni makromolekulideni nagu DNA, RNA ja valgud (Cheng ja
Roberts, 2001). WBSCR22 valgu täpne roll rakus on küll teadmata, kuid UniProtKB
andmetel on ennustatud, et see võiks olla seotud DNA metüleerimisega. DNA metülatsioon
omab suurt tähtsust transkriptsiooni regulatsioonil.
Paljude inimese geenide funktsioon on ennustatud mudelorganismide uurimisest (Bassett jt.,
1995; Clayton jt., 1997). Sekveneeritud Saccharomyces cerevisiae genoom on laialt kasutatav
mudelorganism eukarüootse raku uurimiseks (Goffeau jt., 1996). WBSCR22 valgu
homoloogidest on iseloomustatud vaid S. cerevisiae SAM-i seondav metüültransferaas
Bud23. 2008. aastal ilmunud artiklis näitasid Joshua White ja kolleegid, et Bud23 valk
metüleerib ribosoomides tugevalt konserveerunud 18S rRNA jääki G1575 ja on vajalik pre-
40S subühiku efektiivseks ekspordiks tuumast (White jt., 2008).
2011. aastal vähiuurigute ajakirjas avaldatud artiklis näitasid Nakazawa ja kolleegid, et
WBSCR22 SAM-sõltuv MTD on tähtis edendamaks vähi metastaaside moodustumist ning et
WBSCR22 geeni knock-down vähirakkudes vähendab metastaaside moodustumist.
Eesmärgiks oli identifitseerida uusi metastaaside moodustumisel osalevaid faktoreid. Selleks
viidi läbi in vivo geneetiline sõeluuring, mille käigus loodi kõrgelt metastaatilisest hiire
melanoomi rakuliini B16-BL6 geneetilisest materjalist retroviiruspõhine cDNA raamatukogu
ning viidi see normaalse rakutsükliga CHO rakkudesse. Veenisiseselt süstiti
CHO/raamatukogu hiirde. 28 päeva pärast koguti kopsudest ellujäänud rakud ning
inokuleeriti uuesti veenisiseselt. Ellujäänud rakkudest identifitseeriti WBSCR22 geeni
järjestus, mis nimetati ümber Merm1-ks (Merm1 - metastasis-related methyltransferase 1).
10

Edasised uuringud näitasid, et Merm1 surub alla tuumori supressorgeeni Zac1 transkriptsiooni
selle promootorpiirkonnas oleva H3 histooni Lys 9 jäägi metüleerimise kaudu ning selleks on
funktsionaalselt oluline Merm1 SAM-sõltuv MTD. Merm1 ja H3 histooni Lys 9 metülatsiooni
vaheline seos jäi siiki ebaselgeks, sest puhastatud Merm1 valk ei suutnud in vitro katses
metüleerida rekombinantset H3 histooni. Eeldati, et Merm1 võib selleks vajada loomulikke
tingimusi või funktsionaalselt tähtsate valkude juuresolekut (Nakazawa jt., 2011). Varasemalt
on näidatud, et H3 histooni Lys 9 ja Lys 27 metülatsioon viib transkriptsioonilise repressioonini
reguleerides kromatiini modelleerivate ensüümide seondumist (Daniel jt., 2005; Li ja Zhao,
2008; kim jt., 2008). Selline epigeneetiline geeniekspressiooni regulatsioon on väga laialt
levinud tuumori supressorgeenide ja tuumori moodustumist edendavate geenide hulgas (Kim
jt., 2008; Gao jt., 2009; Yang jt., 2010). Zac1 on C2H2 tsink-sõrme motiiviga
transkriptsioonifaktor, mis on p53 transkriptsiooni koaktivaatoriks, osaledes rakkudes G1
aresti ning apoptoosi indutseerimisel (Huang jt., 2001; Varrault jt., 1998; Bilanges jt., 1999).
Merm1 poolt vahendatud Zac1 transkriptsiooni mahasurumise näol oleks tegemist uudse
mehhanismiga, mis aitab vähirakkudel ellu jääda ning metastaase moodustada. Õppides seda
paremini tundma, liigutakse lähemale efektiivse metastaatilise vähi ravi väljatöötamisele.
Meie laboris läbi viidud uuringud näitavad, et WBSCR22 valgu funktsioon võiks Bud23-le
sarnaselt olla seotud ribosoomide biogeneesiga. On uuritud WBSCR22 valgu ja tuumakese
kolokalisatsiooni kasutades tuumakese markerit fibrillariini (Õunap, 2010). Mõndadel
WBSCR22 valku transientselt ekspresseerivate rakkude immunofluorestsentsanalüüsi (IF)
piltidel nähti WBSCR22 valgu sarnast lokalisatsiooni fibrillariiniga, kuid oli ka rakke, kus
nende lokalisatsioon ei kattunud ning kus valk lokaliseerus ühtlaselt üle tuuma. Loodi
WBSCR22 valku madalal tasemel ekspresseerivad püsiliinid ning nendes oli WBSCR22 valk
lokaliseerunud ühtlaselt üle tuuma. Tulemustest järeldati, et WBSCR22 valk võib tugeva
üleekspressiooni korral agregeeruda ja moodustunud agregaadid võivad seonduda
tuumastruktuuridele. Üleekspressioonist tulenevat WBSCR22 agregeerumist ja kinnitumist
tuumastruktuuridele kinnitas ka alusklaasidel tehtud rakkude fraktsioneerimine (Õunap,
2010). WBSCR22 valgu võimalik funktsioon ribosoomide biogeneesil on hetkel uurimise all.
On näidatud, et WBSCR22 valk lokaliseerub rakutuumas (Õunap, 2010; Nakazawa jt., 2011),
kuid bioinformaatiliselt C-terminusse ennustatud NLS-i funktsionaalsust pole
molekulaarbioloogiliste meetoditega kinnitatud.
11

1.5 Tuuma lokalisatsiooni signaal ning valkude transport raku tuuma
Eukarüootses rakus on tuuma geneetiline materjal ja transkriptsiooni masinavärk eraldatud
tsütoplasma translatsioonilisest ja metaboolsest süsteemist kaksikmembraaniga (Lange jt.,
2007), milles esinevad nukleoporiinidest oktagonaalselt organiseeritud tuuma poori
kompleksid (NPC- nuclear pore complex). NPC koosneb umbes 30 erinevast valgust ühise
nimetusega nukleoporiinid. Funktsioneeriv NPC on kokku pandud 500-1000 nukleoporiinist.
Tuumapoori valgud seovad tuumapoori servadel tuuma sise- ja välismembraani kokku. Läbi
NPC toimub transport kas passiivse difusiooni (ioonid, väikesed valgumolekulid) või aktiivse
transpordi teel, mis vajab energiat ning lubava signaali olemasolu (Hoelz jt., 2011; Wente ja
Rout, 2010) Tuuma transpordil on selleks signaaliks teatud aminohappelise järjestusega NLS,
mis sisaldab tavaliselt positiivselt laetud aminohappeid Lys ja Arg ja on kodeeritud vastavas
geenis, kusjuures NLS signaali asukoht geenis ei ole kindlalt määratud. NLS järjestused
võivad varieeruda suurel määral ning neid võib jaotada kahte klassi: lühikesed 4-8-st
aluselisest aminohappest koosnevad järjestused või pikemad kaheosalised NLS-id, mis
koosnevad 2-st aluseliste aminohapete blokist, mida eraldab 10-12 aminohapet. NLS kirjeldati
esmakordselt SV40 viiruse poolt kodeeritud T-antigeenil, mis on vajalik viirusliku DNA
replikatsiooniks rakutuumas. T-antigeeni NLS koosneb aminohapetest Pro-Lys128-Lys-Lys-
Arg-Lys-Val-Glu (Kaldero jt., 1984). Erinevalt teistest membraantranspordi mehhanismidest,
ei lõigata NLS järjestust pärast tuuma sisenemist valgu küljest ära, sest NLS-i läheb korduvalt
tarvis. Raku jagunemisel tuumamembraan laguneb ning tuumavalgud satuvad tsütoplasmasse.
Kui tütarrakkudes moodustub uus tuumaümbris, on vaja tuumavalgud uuesti tsütoplasmast
tuuma paigutada (Nelson ja Cox, 2004).
Kõige paremini tuntakse klassikalist NLS-sõltuvat tuuma impordi mehhanismi. Esimeses
etapis tunneb tsütoplasmas oleva vastsünteesitud tuumavalgu NLS-i ära importiinα, millega
seondub importiinβ. Moodustunud kompleks transporditakse läbi tuumapoori
nukleoplasmasse, kus RanGTP seondub importiinβ-ga, mille tagajärjel kompleks laguneb.
Importiinα ning importiinβ-RanGTP kompleks transporditakse tuumast välja tsütoplasmasse,
kus Ran GAP katalüüsib RanGTP muutumise RanGDPks ja see vabaneb importiinβ küljest.
RanGDP transporditakse tagasi tuuma (Gorlich ja Kutay, 1999).
On näidatud, et osa valke on võimelised sisenema tuuma ka ilma klassikalise NLS-järjestuse
ja importiini abita. Siin võib olla tegemist sellega, et valk interakteerub karüofiilse valguga
ning satub tuuma viimasega kompleksi moodustades. Välistatud pole ka muud võimalused
valkude tuuma importimiseks. Näiteks onkogeenne valk β-kateniin arvatakse sattuvat tuuma
12

sel moel, et ta seostub otse tuuma poori kompleksi valkudega ning seejärel toimub valgu
sisenemine tuuma (Gorlich ja Kutay, 1999).
Kuna peale klassikalise tuuma transpordi esineb ka teisi mehhanisme, ei saa
bioinformaatiliselt ennustaud NLS-i koheselt funktsionaalseks lugeda. Funktsinaalne NLS
peab vastama neljale kriteeriumile: (1) leitud järjestus peab olema vajalik tuuma transpordiks,
tähendades seda, et vaatluse all oleva valgu transport tuuma väheneb oluliselt kui NLS
deleteerida või muteerida; (2) NLS järjestusest peab piisama, et suunata mõni teine mitte
suguluses olev valk tuuma (näiteks GFP); (3) vaatluse all olev proteiin peab otseselt
interakteeruma identifitseeritud järjestuse kaudu oma oletatava impordiretseptoriga; (4)
oletatava transpordimehhanismi rikkumisel peaks valgu transport tuuma olema häiritud
(Lange jt., 2007).
13

2. EKSPERIMENTAALNE OSA
2.1 Töö eesmärgid
Teadlikkus Williams-Beureni sündroomist kui distinktsest vaimsest häirest on aegamööda
kasvanud, kuid WBS-i põhjustava deletsioonipiirkonna poolt kodeeritavate geeniproduktide
kirjeldamine ning valgufunktsioonide uurimine on leidnud vähest käsitlust.
Bioinformaatiliste meetoditega on ennustatud, et WBSCR22 ekspresseerib 281
aminohappelist valku (isoelektriline punkt pH 8,95 juures) suurusega 31,8 kDa ning sarnasuse
alusel on ennustatud, et WBSCR22 omab S-adenosüül-L-metioniinist (SAM) sõltuvat
metüültransferaasi domeeni (MTD) valgu N-terminuses (Wang jt., 1997) ning kaheosalist
NLS-i valgu C-terminaalses osas.
Varasemalt on Reet Kure töörühmas näidatud, et WBSCR22 lokaliseerub raku tuumas.
Selle bakalaureusetöö eksperimentaalse osa eesmärgiks on analüüsida WBSCR22 valgu
ennustusliku NLS-i funktsionaalsust, uurides NLS-ga varustatud C-terminaalse domeeni
vajalikkust tuuma transpordil.
14

2.2 Materjal ja metoodika
2.2.1 Plasmiidid
Kõik antud töös kasutatud ekspressioonivektorid põhinevad pCG vektoril, milles huvipakkuva
järjestuse transkriptsioon toimub CMV promootori kontrolli all ning mis kodeerib valku
kodeeriva järjestuse ees N-terminaalset BPV1 E2 epitoopi E2Tag (ah 199 to 208),
võimaldades valkude detekteerimist anti-E2Tag antikeha abil (Kurg jt., 1999). Täispika
WBSCR22 valgu ja N-terminaalse domeeni (NTD) ekspressioonivektoritena kasutati Kadri
Õunapi konstrueeritud vektoreid pCG-WBSCR22 ja pCG-WBSCR22NTD. Lisaks
konstrueeriti antud bakalaureusetöö raames WBSCR22 C-terminaalse domeeni (CTD)
ekspressioonivektor pCG-WBSCR22CTD. Selleks lõigati pCG-WBSCR22 konstrukti (joonis
3) ning pCG vektorit restriktsiooniliste endonukleaasidega BamH1 ja Acc651 ning pCG
vektorit töödeldi aluselise fosfataasiga. DNA lahutati elektroforeesil agaroosgeelis ning
vajalikud järjestused eraldati geelist kasutades Jetspin Plasmid Midiprep Kit’i (Genomed).
WBSCR22 CTD-d kodeeriv järjestus ja lõigatud vektor ligeeriti T4 DNA ligaasi abil.
Restriktsiooni- ja ligeerimisreaktsioonid viidi läbi Fermentas ensüümide ja puhvritega
järgides tootjapoolseid soovitusi.
Plasmiidide paljundamiseks kasutati E. Coli tüve DH5α ning plasmiidid eraldati kasutades
Jetspin Plasmid Midiprep Kit’i (Genomed) ning juhindudes tootjapoolsest protokollist.
Konstruktide õigsust kontrolliti restriktsioonianalüüsi ja sekveneerimise teel. DNA
kontsentratsiooni määramiseks kasutati NanoDrop spektromeetrit.
2.2.2 Eukarüootsete rakkude kasvatamine
Töös kasutati inimese emakakaelavähi põhist rakuliini SiHa. Rakke kasvatati IMDM (Iscove’s
Modified Dulbecco’s Medium) söötmes, mis sisaldas penitsilliini (100 U/ml), streptomütsiini
(100 ng/ml) ja 10% veise loote seerumit. Rakke inkubeeriti tingimustel 37º C ja 5% CO 2
(Galaxy R CO2 Incubator).
15

Joonis 3. Täispikka WBSCR22 kodeeriva plasmiidi pCG-WBSCR22 skeem koos
restriktsiooniliste lõikesaitidega. Kodeeritava valgu N-terminuses paikneb E2Tag, mis
võimaldab vaktu detekteerimist anti-E2Tag antikeha abil. Valgu ekspressioon
imetajarakkudes toimub CMV kontrolli alt.
2.2.3 Eukarüootsete rakkude transfektsioon
Eukarüootsete rakkude tranfektsioon viidi läbi elektroporatsiooni meetodil. Selleks aspireeriti
koekultuuri tassidel kasvanud rakkudelt sööde, rakke pesti ühe korra PBS-iga, võeti seejärel
trüpsiini abiga plastikult lahti ning koguti koekultuuri tuubi, millesse oli eelnevalt lisatud 5 ml
söödet. Rakud tsentrifuugiti 5 minutit 1000 rpm 20ºC juures (Eppendorf Centrifuge 5810 R)
ning suspendeeriti söötmes, mis sisaldas 5 mM Na-BES puhvrit (pH 7,5). Seejärel segati
küvetis 250 µl rakususpensiooni sobivas koguses vastava(te) plasmiidi(de) ning 50 µg carrier
DNA-ga (lõhe spermi DNA). Elektroporatsioon viidi läbi BioRad Gene Pulser II aparaadiga
parameetrite 975 µF ja 220 V juures. Pärast elektroporatsiooni kanti rakud küvetist 3 ml
söödet sisaldavasse koekultuuri tuubi ning tsentrifuugiti 5 minutit 1000 rpm 20ºC juures.
Sööde aspireeriti, rakud suspendeeriti värskes söötmes ning kanti koekultuuri tassidele.
Immunofluorestsentsanalüüsi jaoks oli eelnevalt tassidele asetatud 18x18 mm läbimõõduga
katteklaasid.
16

2.2.4 Western blot analüüs
24 tundi pärast poratsiooni rakke pesti PBS-ga ning võeti PBS/3mM EDTA abiga plaatidelt
lahti. Rakud koguti 1,5 ml tsentrifuugituubidesse ja tsentrifuugiti 5 minuti jooksul põhja 4 °C
lauatsentrifuugis (Biofuge fresco) pööretel 4000 rpm-i. Rakusade suspendeeriti 50 µl PBS-s
ning lüüsiti ja denatureeriti 50 µl 2xLaemmli puhvri + DTT (4% SDS, 20% glütserool, 120
mM Tris pH 6,8; 0,01% broomfenoolsinine, 100 mM DTT) lisamise ning 10 minuti vältel 100
°C juures kuumutamisega. Valgud lahutati SDS-PAAG elektroforeesil 1xSDS puhvris ning
kanti PVDF membraanile (Immobilon-P Millipore 0,45 µm) semy-dry blotting meetodil
(Trans-Blot® SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell, Bio-Rad). Pärast ülekannet asetati
membraan üleöö 4 °C juurde blokeerimislahusesse (1xTBS; 0,05% Tween 20; 5%
lõssipulber). Järgmisel päeval inkubeeriti membraani 1 tund peroksüdaasiga konjugeeritud
antikehi (5E11-HRP, anti-E2Tag) sisaldavas lahuses (1xTBS; 0,05% Tween 20; 1%
lõssipulber; 1:10 000 5E11-HRP) ning pesti tund aega pesulahusega [100 mM Tris (pH 7,5);
170 mM NaCl; 0,1% Tween 20], vahetades iga 20 minuti möödudes pesulahust.
Peroksüdaasiga konjugeeritud antikehade signaal detekteeriti ECL lahustega (Amersham
Pharmacia Biotech), järgides tootjapoolset protokolli.
2.2.5 Immunofluorestsentsanalüüs
SiHa rakkudesse transfekteeriti 1000 ng WBSCR22 või WBSCR22NTD või 3000 ng
WBSCR22CTD ekspressioonivektorit, 24 tundi hiljem rakud fikseeriti alusklaasidel -20 °C
1:1 metanool:atsetoon seguga -20 °C juures 15 minuti jooksul. Seejäral segu aspireeriti ning
rakkudega alusklaase hoiti kuni järgnevate etappideni -20 °C külmkapis. Klaase pesti 3 korda
PBS-ga ning blokeeriti 30 minutit 1 ml 0,1 % BSA-PBS-ga. Seejärel inkubeeriti klaase 1 tund
toatemperatuuril primaarse antikehaga 0,1% BSA-PBS lahuses. Pärast seda pesti klaase 3x5
minutit PBS-ga, ning inkubeeriti 1 tund pimedas toatemperatuuril sekundaarse antikehaga
0,1% BSA-PBS lahuses. Alusklaase pesti 3x4 minutit PBS-ga ning rakutuumade
visualiseerimiseks lisati PBS lahusele DNA-seoselist propiidiumjodiidi (fluorestsents punane)
ning inkubeeriti 10 minutit. Klaasid asetati tagurpidi alusklaasidele 10 µl sulunduslahusesse
(0,5 M Tris pH 8,0; 50% glütserool). Juhul kui propiidiumjodiidi ei kasutatud, sisaldas
sulundusvedelik DNA-värvi DAPI (fluorestsents roheline) (Slowfade GOLD antifade reagent
with DAPI, Invitrogen), mida lisati alusklaasile 6 µl.
17

Primaarsete antikehadena kasutati anti-E2Tagi antikeha 3F12 (lõppkontsentratsioon 5 µg/ml)
ja polüklonaalset WBSCR22 valgu vastast antikeha (lõppkontentratsioon 2 µg/ml) (Abcam).
Sekundaarse antikehana kasutati hiire IgG vastast antikeha (lahjendusega 1:1000), millele oli
lisatud roheline fluorestsentsmärgis (anti-mouse Alexa 488, Invitrogen).
3F12 antikeha kasutades värviti tuumad propiidiumjodiidiga, anti-WBSCR22 korral DAPI-ga.
Preparaatide visualiseerimiseks kasutati Nikon Eclipse TE2000-U konfokaalmikroskoopi.
18

2.3 Tulemused ja arutelu
2.3.1 WBSCR22 täispika valgu ja deletantide ekspressioon SiHa rakkudes
Antud töö eesmärk oli uurida WBSCR22 valgu NLS signaali sisaldava C-terminaalse
domeeni vajalikkust tuuma transpordil. Selleks konstrueeriti erinevad WBSCR22 täispika
valgu ja deletantide ekspressiooniplasmiidid. Täispika WBSCR22 valgu ning NTD
ekspressioonivektor olid eelnevalt konstrueeritud; selle töö raames tehti WBSCR22 CTD-d
kodeeriv plasmiid. Joonisel 4 on toodud antud töös kasutatud ekspressioonivektorite poolt
kodeeritud valkude skemaatiline kujutis ning vastavate valkude ennustatav molekulmass.
Valkude N-terminusse on liidetud BPV1 E2 epitoop E2Tag (aa 199 - 208), tänu millele on
võmalik valkude visualiseerimiseks kasutada anti-E2Tag antikehasid.
WBSCR22
MT domeen
E2Tag MTD NLS
31,8 kDa
WBSCR22
NTD
E2Tag
MTD
17,3 kDa
WBSCR22
CTD
E2Tag
NLS
14,5 kDa
Joonis 4. Skeem illustreerimaks ekspressioonivektoritelt transleeritavate valkude eeldatavaid
funktsionaalseid domeene ning E2Tag-i asukohta.
Valkude ekspressiooni kontrolliti SiHa rakkudes. Selleks transfekteeriti rakkudesse võrdses
koguses erinevaid ekspressiooniplasmiide. Järgmisel päeval rakud lüüsiti ning lüsaadid
analüüsiti western blot meetodil. Katse tulemus on toodud joonisel 5A. Kuigi rakkudesse viidi
võrdses koguses DNA-d, on tulemustest näha, et erinevate valkude signaalide tugevused
erinevad. WBSCR22CTD signaal on võrreldes WBSCR22 ja WBSCR22NTD-ga oluliselt
madalam. See võib olla tingitud valkude erinevast stabiilsusest. Näiteks valkude vale
konformatsioon võib viia nende ubikvitineerimise ning lagundamiseni proteosoomis. Ühtlasi
võib tegemist olla sellega, et WBSCR22NTD kaudu toimuvad interaktsioonid teiste rakuliste
valkudega, mis stabiliseerivad valku ning antud domeeni eemaldamine ühtlasi elimineerib
need stabiliseerivad interaktsioonid. Välistada ei saa ka seda, et madalam ekpressioonitase on
tingitud erinevustest transkriptsiooni või translatsiooni efektiivsuses. Kuigi plasmiidi
19

WBSCR22 kodeeriv osa kontrolliti sekveneerimise teel, ei kontrollitud kogu plasmiidset
järjestust ning ei saa välistada mutatsioonide esinemist transkriptsiooniks või translatsiooniks
olulistes järjestustes.
Järgnevaks immunofluorestsentsanalüüsi läbiviimiseks oli vaja, et valgud ekspresseeruks
optimaalsel ning võrdsel määral. Selleks viidi läbi järgnev ekspressioonikatse, kus kasutati
erinevaid DNA koguseid. Tulemused on näha joonisel 5B. Kui WBSCR22CTD plasmiidi
poreeriti rakkudesse kolma korda rohkem kui WBSCR22NTD konstrukti, olid saadud
signaalide intensiivsused võrreldavad. Immunofluorestsentsanalüüsil otsustati western blot
tulemuste alusel kasutada 1000 ng WBSCR22- ja WBSCR22NTD vektorit ning 3000 ng
WBSCR22CTD vektorit.
Joonis 5. WBSCR22 konstruktide ekspressioon SiHa rakkudes. A. SiHa rakke transfekteeriti
4500 ng plasmiidse DNAga. Järgmisel päeval rakud lüüsiti ning valkude signaal detekteeriti
western blot meetodil peroksüdaasiga konjugeeritud anti-E2Tag antikehaga (5E11-HRP).
B. SiHa rakke transfekteeriti 500 ng pCG-WBSCR22, 1000 ng pCG-WBSCR22NTD ning
3000 ng pCG-WBSCR22CTD plasmiidse DNA-ga. Järgmisel päeval rakud lüüsiti ning
valkude signaal detekteeriti western blot meetodil peroksüdaasiga konjugeeritud anti-E2Tag
antikehaga (5E11-HRP). Tärniga on joonisel tähistatud ebaspetsiifiline signaal; täispikk
WBSCR22 valk liigub ebaspetsiifilise signaaliga samal kõrgusel.
2.3.2 WBSCR22 C-terminaalne domeen on vajalik valgu transpordiks tuuma
Immunofluorestsentsanalüüsiks transfekteeriti rakke erinevate WBSCR22
ekspressioonivektoritega. Järgmisel päeval rakud fikseeriti ning viidi läbi inkubeerimised
primaarse ja sekundaarse antikehaga. Tuumad visualiseeriti propiidiumjodiidi või DAPI-ga.
IF tulemused on toodud joonistel 6, 7 ja 8. Primaarsete antikehadena kasutati nii anti-E2Tag
20

antikeha kui ka kommertsiaalset polüklonaalset anti-WBSCR22 antikeha. Antikehadest
tulenevaid signaalide erinevusi analüüsis ei täheldatud.
Täispikka WBSCR22 valku ekspresseerivate rakkude (joonis 6) vaatlemisel on näha, et valk
lokaliseerub tuumas ning on seal ühtlaselt jaotunud, kinnitades varasemaid tulemusi (Õunap,
2010; Nakazawa jt., 2011). WBSCR22 valgu C-terminaalset domeeni ekspresseerivates
rakkudes (joonis 7) on näha sarnast lokalisatsiooni. WBSCR22CTD on ühtlaselt üle tuuma
jaotunud. Rakkudes, mis ekspresseerivad WBSCR22NTD-d on aga signaal peaasjalikult
tsütoplasmas (joonis 8), moodustades seal iseloomuliku mustri. IF tulemuste alusel võib
öelda, et WBSCR22 C-terminaalne domeen, kus on ennustatud kaheosalise NLS-i olemasolu,
on vajalik valgu transpordiks rakutuuma.
IF I – WBSCR22
DAPI Anti-WBSCR22 Ühendatud
A)
Propiidiumjodiid Anti-E2Tag Ühendatud
B)
Joonis 6. WBSCR22 valgu lokalisatsioon SiHa rakkudes. SiHa rakke transfekteeriti 1000 ng
WBSCR22 ekspressiooniplasmiidiga, järgmisel päeval rakud fikseeriti ning viidi läbi IF
analüüs. A) Valgu detekteerimiseks kasutati polüklonaalset anti-WBSCR22 antikeha ning
rakutuumad värviti DAPI-ga. B) Valgu detekteerimiseks kasutati anti-E2Tag antikeha 3F12
ning tuumade visualiseerimiseks propiidiumjodiidi. Sekundaarse antikehana kasutati IgG
vastast antikeha anti-mouse Alexa-488 (roheline).
21

IF II – WBSCR22CTD
DAPI Anti-WBSCR22 Ühendatud
A)
Propiidiumjodiid Anti-E2Tag Ühendatud
B)
Joonis 7. WBSCR22CTD valgu lokalisatsioon SiHa rakkudes. SiHa rakke transfekteeriti
3000 ng WBSCR22CTD ekspressiooniplasmiidiga, järgmisel päeval rakud fikseeriti ning
viidi läbi IF analüüs. A) Valgu detekteerimiseks kasutati polüklonaalset anti-WBSCR22
antikeha ning rakutuumad värviti DAPI-ga. B) Valgu detekteerimiseks kasutati anti-E2Tag
antikeha 3F12 ning tuumade visualiseerimiseks propiidiumjodiidi. Sekundaarse antikehana
kasutati IgG vastast antikeha anti-mouse Alexa-488 (roheline).
WBSCR22 puhul on ennustatud kaheosalise NLS-i järjestusega RKSRAWVLEKKERHRRQ
(ah 246-262) olemasolu valgu C-terminuses. Kui vastavat järjestust sisaldav domeen
eemaldada, lokaliseerub valk tsütoplasmas, kuid selleks, et kindlaks teha, kas tõepoolest
ennustatud järjestus funktsioneerib NLS-ina tuleks läbi viia täiendavaid katseid. Edasisteks
analüüsideks võiks olla NLS järjestuse liitmine mõne teise mitte suguluses oleva valguga
nagu GFP ning uurida, kas sellest piisab GFP tuuma transpordiks. Samuti võiks NLS
järjestust muteerida ning uurida selle mõju valgu lokalisatsioonile. Kui nende katsete käigus
ilmneb, et NLS järjestus on vajalik tuuma transpordiks, peaks järgmisena uurima, kas
WBSCR22 valk interakteerub identifitseeritud NLS järjestuse kaudu otseselt oma oletatava
impordiretseptoriga. Selleks tuleks puhastatud valkudega läbi viia in vitro seondumise katse
RanGDP või RanGTP juuresolekul.
22

IF III – WBSCR22NTD
DAPI Anti-WBSCR22 Ühendatud
A)
Propiidiumjodiid Anti-E2Tag Ühendatud
B)
Joonis 8. WBSCR22NTD valgu lokalisatsioon SiHa rakkudes. SiHa rakke transfekteeriti
1000 ng WBSCR22NTD ekspressiooniplasmiidiga, järgmisel päeval rakud fikseeriti ning
viidi läbi IF analüüs. A) Valgu detekteerimiseks kasutati polüklonaalset anti-WBSCR22
antikeha ning rakutuumad värviti DAPI-ga. B) Valgu detekteerimiseks kasutati anti-E2Tag
antikeha 3F12 ning tuumade visualiseerimiseks propiidiumjodiidi. Sekundaarse antikehana
kasutati IgG vastast antikeha anti-mouse Alexa-488 (roheline).
Ennustuse kohaselt on WBSCR22 näol tegemist metüülrühma ülekandva ensüümiga ning
meie uurimisrühma hüpoteesiks on, et WBSCR22 valk osaleb RNA metüleerimise kaudu
ribosoomide biogeneesis, täpsemalt pre-rRNA protsessingus rakutuumas. Hetkel avaldamata
uuringutes on meie laboris näidatud, et kui WBSCR22 ekspressioon rakkudes siRNA abil
maha suruda, leiavad aset muutused ribosoomide profiilis. WBSCR22 mahasurumine
põhjustab ribosoomi 40S subühiku osakaalu vähenemist ning selle koostises oleva 18S rRNA
protsessingu vahevormi akumuleerumist. Seega viitavad meie labori andmed sellele, et
sarnaselt WBSCR22 homoloogile Bud23-le, osaleb ka WBSCR22 18S rRNA protsessingus.
23

KOKKUVÕTE
WBSCR22 on üks geenidest, mis multisüsteemse arenguhäirega Williams-Beureni
sündroomiga patsientidel on deleteerunud 7. kromosoomi suure õla regioonist 11.23.
Bioinformaatiliste meetoditega on WBSCR22 valgule ennustatud SAM-sõltuvat
metüültransferaasset aktiivsust ning kaheosalist NLS-i valgu C-terminaalses osas. SAMsõltuvad
metüültransferaasid võivad metüleerida nii DNA-d, RNA-d, valke, polüsahhariide,
lipiide kui rida väiksemaid molekule. Vaatlusaluse ennustusliku metüültransferaasi sihtmärki
pole veel kindlaks tehtud, kuid üheselt on näidatud selle lokaliseerumist tuumas. Käimas on
kaks eraldi uurimissuunda. Reet Kure töörühm uurib WBSCR22 valgu seotust RNA
metüleerimisega rRNA biogeneesil ning Jaapani vähiuurungute keskuses seostasid Nakazawa
ja kolleegid WBSCR22 valgu funktsiooni tuumori supressorgeeni Zac1 transkriptsiooni alla
surumisega Zac1 promootorpiirkonnas oleva H3 histooni Lys 9 jäägi metüleerimise kaudu.
Metüülrühma ülekandega on reguleeritud paljud tähtsad bioloogilised protsessid nagu geenide
ekspressioon, signaliseerimine, kromosoomide jaotumine raku jagunemisel ja metabolism,
mistõttu tuleb kindlasti WBSCR22 valgu funktsiooni uuringuid jätkata.
Selle bakalaureusetöö eksperimentaalse osa eesmärgiks oli uurida WBSCR22 valgu NLS-i
sisaldava C-terminaalse domeeni vajalikkust tuuma transpordil. Selleks konstrueeriti täispika
valgu ja deletantide ekspressioonivektorid ning uuriti ekspressiooni ja lokalisatsiooni SiHa
rakkudes. Tulemustest oli näha, et ilma C-terminaalse domeenita ei toimu WBSCR22 valgu
transporti tuuma. Põhjalikumaks WBSCR22 NLS-i iseloomustamiseks tuleks läbi viia
täiendavaid katseid, näiteks uurida NLS-i muteerimise mõju valgu lokalisatsioonile või liita
vastav NLS muu valguga ning analüüsida, kas NLS on vastava valgu koosseisus samuti
funktsionaalne. Lõppeesmärgiks on välja selgitada WBSCR22 valgu tuuma transpordi
mehhanism.
24

RESÜMEE
Cellular localization of Williams-Beuren syndrome chromosome region 22 protein
Markko Salumäe
Resume
Williams-Beuren syndrome (WBS) is a rare chromosomal disease caused by hemizygous
deletion of 1.5-1.8 Mb from the long arm of chromosome 7 region 11.23 encompassing
approximately 28 genes. WBS individuals have mild mental retardation including very
deficient visuo-spatial abilities but relatively good verbal skills. Associated physical
abnormalities are characteristic dysmorphic face, short stature and heart abnormalities. They
are also described as overly sociable.
Out of the 28 genes encoded by WBS chromosome region a clear genotype–phenotype
correlation has been established only for the elastin gene, which was the first to be described
from WBS locus. Haploinsufficiency of elastin gene causes heart diseases like supravalvular
aortic stenosis. The precise contribution of the other genes to the phenotype is yet to be
determined.
The aim of this study was to examine the functionality of nuclear localization signal at the C-
terminal end of WBSCR22 protein. WBSCR22 gene contains 12 exons extending over 45
kilobases of genomic DNA. With bioinformatical tools it has been predicted that WBSCR22
protein comprises of S-adenosyl-L-methionine binding motif suggesting the methyltransferase
activity and a bipartite nuclear localization signal at C-terminal end. The SAM-dependent
methyltransferases act on a wide variety of target molecules, including DNA, RNA, proteins,
polysasaccharides, lipids and a range of small molecules indicating that they play a major role
in the regulation of various biological functions, such as gene expression, signaling, nuclear
division and metabolism. The target molecule for WBSCR22 has not yet been determined.
There are two different research directions. The workgroup under Reet Kurg is studying
WBSCR22 protein involvement in ribosomal RNA processing. Nakazawa and colleagues
from Japan Cancer Chemotherapy Center have associated WBSCR22 protein function to
suppression of Zac1 expression by a mechanism that involves histone H3 methylation at Lys 9
in the Zac1 promoter region.
25

It is clear that WBSCR22 protein localizes in the nucleus but nobody has demonstrated that
the predicted NLS at C-terminus of WBSCR22 protein is functional. Based on my study, I
found that C-terminal domain is needed for nuclear transport giving free road to do further
experiments, such as mutating NLS sequence and studying the effect of such mutations on the
protein localization. It would also be interesting to fuse WBSCR22 NLS to the terminus of an
unrelated protein, such as GFP, to see if the sequence is sufficient to target the protein to the
nucleus. The final goal would be to determine the transport machinery that is involved in the
transport of WBSCR22 to the cell nucleus, which would further help to elucidate WBSCR22
functions and possibly its role in the development of disease in humans.
26

KIRJANDUSE LOETELU
1. Bilanges B, Varrault A, Basyuk E, Rodriguez C, Mazumdar A, Pantaloni C,
Bockaert J, Theillet C, Spengler D ja Journot L (1999). Loss of expression of the
candidate tumor suppressor gene ZAC in breast cancer cell lines and primary tumors.
Oncogene 18, 3979–3988.
2. Cheng X ja Roberts RJ (2001). AdoMet-dependent methylation, DNA
methyltransferases and base flipping. Nucleic Acids Research 29(18), 3784-3795.
3. Daniel JA, Pray-Grant MG ja Grant PA (2005). Effector proteins for methylated
histones: an expanding family. Cell Cycle 4, 919–926.
4. Doll A. ja Grzeschik KH (2001). Characterization of two novel genes, WBSCR20
and WBSCR22, deleted in Williams-Beuren syndrome. Cytogenet Cell Genet 95:20–
27.
5. Gao SB, Feng ZJ, Xu B, Wu Y, Yin P, Yang Y, Hua X ja Jin GH (2009).
Suppression of lung adenocarcinoma through menin and polycomb gene-mediated
repression of growth factor pleiotrophin. Oncogene 28, 4095– 4104.
6. Gorlich D ja Kutay U (1999). Transport between the cell nucleus and the cytoplasm.
Annu Reb Cell Dev Biol 15, 607-660.
7. Hoelz A, Debler EW ja Blobel G (2011). The Structure of the Nuclear Pore
Complex. Annual Review of Biochemistry 80, 20.1–20.31
8. Huang SM, Schonthal AH ja Stallcup MR (2001). Enhancement of p53-dependent
gene activation by the transcriptional coactivator Zac1. Oncogene 20, 2134–43.
9. Järvinen-Pasley A, Bellugi U, Reilly J, Mills DL, Galaburda A, Reiss AL ja
Korenberg JR (2008). Defining the social phenotype in Williams syndrome: A model
for linking gene, the brain, and behavior. Development and Psychopathology 20 , 1–
35.
10. Kalderon D, Roberts BL, Richardson WD, Smith AE (1984). A short amino acid
sequence able to specify nuclear location. Cell 39, 499–509.
11. Kalderon D, William DR, Alexander FM ja Alan ES (1984). Sequence
requirements for nuclear location of simian virus 40 large-T antigen. Nature 311, 33 –
38.
12. Kim JY, Kee HJ, Choe NW, Kim SM, Eom GH, Baek HJ, Kook H, Kook H ja
Seo SB (2008). Multiplemyeloma-related WHSC1/MMSET isoform RE-IIBP is a
27

histone methyltransferase with transcriptional repression activity. Mol Cell Biol 28,
2023–2034.
13. Lange A, Mills RE., Lange CJ., Stewart M, Devine SE. ja Corbett AH. (2007).
Classical Nuclear Localization Signals: Definition, Function, and Interactions with
Importin α. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, VOL. 282, NO. 8,
pp. 5101–5105.
14. Li X ja Zhao X (2008). Epigenetic regulation of mammalian stem cells. Stem Cells
Dev 17, 1043–1052 .
15. Meyer-Lindenberg A, Mervis CB. ja Berma KF (2006). Neural mechanisms in
Williams syndrome: a unique window to genetic influences on cognition and
behaviour. NATURE REVIEWS | NEUROSCIENCE 381, volume 7.
16. Nakazawa Y, Arai ja Fujita N (2011).The Novel Metastasis Promoter
Merm1/Wbscr22 Enhances Tumor Cell Survival in the Vasculature by Suppressing
Zac1/p53-Dependent Apoptosis. Cancer Res 71 1146-1155
17. Nelson DL. ja Cox MM. (2004). Lehninger Principles of Biochemistry, Fourth
Edition, 1071-1072
18. Osborn LR. (2010). Animal Models of Williams Syndrome. Am J Med Genet C
Semin Med Genet. 154C, 209-219.
19. Osborne LR. ja Mervis CB. (2010). Rearrangements of the Williams–Beuren
syndrome locus: molecular basis and implications for speech and language
development. Expert Rev Mol Med. ; 9(15): 1–16.
20. Schubert C. (2009). The genomic basis of the Williams – Beuren syndrome. Cell.
Mol. Life Sci. 66, 1178 – 1197.
21. Varrault A, Ciani E, Apiou F, Bilanges B, Hoffmann A, Pantaloni C, Bockaert J,
Spengler D ja Journot L (1998). hZAC encodes a zinc finger protein with
antiproliferative properties and maps to a chromosomal region frequently lost in
cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 8835–8840.
22. van Hagen JM, van der Geest JN, van der Giessen RS, Lagers-van Haselen GC,
Eussen HJ, Gille JJ, Govaerts LC, Wouters CH, de Coo IF, Hoogenraad CC,
Koekkoek SK, Frens MA, van Camp N, van der Linden A, Jansweijer MC,
Thorgeirsson SS, De Zeeuw CI (2007). Contribution of CYLN2 and GTF2IRD1 to
neurological and cognitive symptoms in Williams Syndrome. Neurobiology of
Disease 26, 112-124.
23. Wang YK, Samos CH, Peoples R, Pérez-Jurado LA, Nusse R ja Francke U
(1997). A novel human homologue of the Drosophila frizzled wnt receptor gene binds
28

wingless protein and is in the Williams syndrome deletion at 7q11.23. Hum Mol
Genet 6, 465-472.
24. Wente SR. ja Rout MP. (2010). The Nuclear Pore Complex and Nuclear Transport.
Cold Spring Harb Perspect Biol 2, a000562.
25. White J, Li Z, Sardana R, Bujnicki JM., Marcotte EM. ja Johnson AW. (2008).
Bud23 methylates G1575 of 18S rRNA and is required for efficient nuclear export of
pre-40S subunits. Molecular and Cellular Biology 28, 3151-3161.
26. Õunap Kadri (2010). Inimese WBSCR22 ja WBSCR27 valkude iseloomustamine.
TÜMRI, magistritöö.
27. Yang YJ, Han JW, Youn HD ja Cho EJ (2010). The tumor suppressor,
parafibromin, mediates histone H3 K9 methylation for cyclin D1 repression. Nucleic
Acids Res 38, 382–390.
29

KASUTATUD VEEBIAADRESSID
http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html
http://www.uniprot.org/uniprot/O43709
http://psort.hgc.jp/form2.html
30