TARTU ÜLIKOOL

2.2.3. Korüneformsete bakterite samastamineUuritavaid baktereid kasvatati esmalt värskelt valmistatud veriagaril 24 h 37°C juuresvastavalt iga konkreetse tüve kasvueelistusele mikroaeroobses või aeroobses termostaadisning seejärel tehti puhta bakterimassi saamiseks ümberkülv Gouldi meetodil veriagarile, midainkubeeriti samuti 24 h. Järgneval päeval vaadeldi agarsöötmel välja kasvanud erinevaidpesatüüpe: hinnati nende puhtust ning hulka. Erinevat tüüpi pesadest tehti Grami meetodilvärvitud äigepreparaat bakterikultuuri puhtuse kontrollimiseks. Mikroskoobis hinnatimikroobi põhivormi – värvumust Grami järgi, morfoloogiat ja asetust. Vajadusel korrati külviveriagarplaadile.DNA eraldamiseks kasvatati korüneformseid baktereid veriagarplaadil 24 h 37°C juures.Bakterite genoomne DNA eraldati QIAamp DNA Mini Kit’iga vastavalt tootja protokollile(Qiagn, GmbH, Saksamaa) ning säilitati -80 °C juures.Korüneformsete bakterite samastamine toimus sekveneerimismeetodil. PCR reaktsiooniteostamisel kasutati kaht erinevat praimerite paari 16S rRNA geenide amplifitseerimiseks:1) broad-range bakteriaalsed praimerid (5’-GTTAAGTCCCGCAAGGA-3’ ja 5’-AGGAGGTGATCCAGCC-3’) 440 bp pikkuse 16S rRNA produkti valmistamiseks lisas 1kirjeldatud PCR tingimuste järgi;2) latter praimerid (5’-CGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCG-3’ ja 5’-CGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTC-3’) 516 bp 16S rRNA produkti valmistamiseks(Adderson et al., 2008).Sekveneerimisreaktsioon viidi läbi kasutades Sequenase Sequencing kit’i (Amersham,Slough, UK) vastavalt tootja ettekirjutustele. Sekveneerimistulemuste abil määrati bakteriteliigid kasutades BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) programmi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/index.html [3]).2.2.4 Statistiline analüüsStatistiliseks analüüsiks kasutati arvutiprogramme Excel (Microsoft Corp., Redmond, OR,USA) ja SigmaStat (Systat Software, Inc., CA, USA). Gruppidevaheliste erinevustearvutamiseks kasutati Fisher exact testi.14