TARTU ÜLIKOOL

LISADLisa 1. PCR’i protokollPCR’i reaktsioon viidi läbi mahus 50 μl, mis sisaldas 5 μl 10x PCR puhvrit, 1.5 mM MgCl 2 ,0.2 desoksünukleosiid-trifosfaadi segu (dATP, dGTP, dTTP and dCTP), 10 μmol mõlematpraimerit, 1,25 U Taq DNA polümeraasi ja 2 μl eraldatud DNA’d. Proovid amplifitseeritikasutades Eppendorf Mastercycler gradientPCR masinat (Eppendorf AG, Hamburg,Germany) järgmistel tingimustel:1. Esmane denaturatsioon 94°C 5 min2. Denaturatsioon 94°C 30 sek3. Praimerite seondumine 50°C 30 sek4. Ekstensioon 72°C 1 min5. Korrata alates 2. punktist 34 tsüklit6. Lõppekstensioon 72°C 5 min7. Hoida 4°C juures Joonis 3. PCR’i produktide geelelektroforees*Kokku tehti 35 tsüklit. Seejärel kanti PCRi produktid etiidiumbromiidi (0.1 μl/ml) sisaldavale1,2% agaroosgeelile ning lisati 1 kb suurusmarker (Fermentas, Leedu). Forees toimuskonstantse 150 V pinge juures, saadud mustreid võrreldi ultraviolettvalguses.*Joonisel 3 on märgitud latter praimeritega läbi viidud PCR’i reaktsiooni produktid geelil 1 kb suurusmarkeriga.30