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2.2.2 Enzymimmunoassays Das Prinzip eines Immunoassays soll am Beispiel des kompetitiven heterogenen Enzymimmunoassays verdeutlicht werden. Die Trennung des gebundenen vom ungebundenen Material, die in heterogenen Verfahren vorgenommen wird, kann am einfachsten durch Immobilisierung einer Komponente (Antikörper oder Analyt-Analogon) an einer Festphase erreicht werden. Wird der Antikörper immobilisiert, handelt es sich um einen direkt-kompetitiven, bei Immobilisierung eines Analyt-Analogons wird von einem indirekt-kompetitiven Enzymimmunoassay gesprochen. Die Bindung der Reagenzien (Antikörper bzw. Analyt-Analogon) an den Festphasen erfolgt durch Adsorption (hydrophobe Wechselwirkungen) oder durch kovalente Kopplung an funktionelle Gruppen an der Oberfläche des Trägermaterials. Ein bewährter Festphasenträger ist Polystyrol, das z.T. oberflächenbehandelt als Material für Mikrotiterplatten und Röhrchen eingesetzt wird. Statt an den Wandungen des Reaktionsgefäßes, können die Reagenzien auch an Partikeln oder Mikropartikeln (ID
Im ersten Schritt, der Immobilisierung, wird im direkt-kompetitiven heterogenen ELISA der Antikörper an die Festphase gebunden. Die nicht gebundenen Anteile werden im Anschluß daran durch einen Waschschritt entfernt. In kommerziellen Test- Kits liegen die Antikörper im allgemeinen schon in gebundener Form vor. Zur Kompetition wird die Probe zusammen mit dem Enzymtracer (enzymmarkiertes Analyt-Analogon) zugegeben und inkubiert. Der Analyt und der Tracer konkurrieren um die limitierte Anzahl an Antikörperbindungsstellen. Nach einer bestimmten Inkubationszeit erfolgt die Trennung, d.h. die nicht durch den Antikörper gebundenen Reagenzien werden entfernt. Es schließt sich ein Waschschritt an, der für eine vollständige Entfernung des ungebundenen Materials sorgt. In der Substratreaktion setzt das Enzym ein geeignetes Substrat zu einem Produkt um, welches detektiert werden kann. In vielen ELISA hat sich die Anwendung von Meerrettichperoxidase (Enzym), Wasserstoffperoxid (Substrat) und 3,3’,5,5’- Tetramethylbenzidin (TMB) als Chromogen bewährt. Im Verlauf der Substratreaktion wird TMB zu einem blau gefärbten Produkt umgesetzt. Die Substratreaktion wird beim Einsatz des Systems Meerrettichperoxidase/ Wasserstoffperoxid durch Zugabe von Schwefelsäure gestoppt. Es findet ein Farbumschlag von blau nach gelb statt. Die Lichtabsorption der Probe bei 450 nm wird photometrisch detektiert und gegen einen Standard ausgewertet. Die Menge des entstehenden Farbstoffes ist dabei umgekehrt proportional zur vorhandenen Analytmenge, d.h. je kleiner die Analytkonzentration, um so mehr Farbstoff wird gebildet. Zur Verdeutlichung des Prinzips ist in Abbildung 2 das Schema eines direktkompetitiven heterogenen ELISA anhand von unterschiedlichen Analytkonzentrationen dargestellt. Ist in der Probe kein Analyt vorhanden, werden alle Antikörperbindungsstellen durch den Enzymtracer besetzt. In der Substratreaktion werden alle Moleküle des Chromogens umgesetzt, es wird maximale Färbung erhalten. Bei einer mittleren Analytkonzentration wird ein Teil der Antikörperbindungsstellen vom Analyt und der anderer Teil vom Enzymtracer besetzt. Liegt in der Probe eine maximale Analytkonzentration vor, werden alle Bindungsstellen des Antikörpers von Analytmolekülen besetzt. Der Enzymtracer kann nicht vom Antikörper gebunden werden, weshalb in der Substratreaktion kein Farbstoff gebildet wird. 17
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Tabelle 20: Ris c Soil Test, Unters
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Testergebnis [ppm] 14 12 10 8 6 4 2
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Tabelle 22: PAH RaPID Assay, Inter-
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Tabelle 23: DTech PAH Test, Untersu
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Tabelle 24: Tabelle: Ris c Soil Tes
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des Methanolextraktes dieser Probe
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Dotierung mit 16 PAH Alle Proben, d
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wurde bei der Untersuchung des Bode
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Tabelle 30: PAH RaPID Assay, Standa
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(Dotierung 2.5 ppm) außerhalb des
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Im DTech PAH Test wurde der Boden K
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Die Testergebnisse und die entsprec
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Für den DTech PAH Test wurde auf d
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Testergebnis [ppm] 10 8 6 4 2 0 n.n
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Im Ris c Soil Test wurde die PAH-St
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Testergebnis [ppm] 14 12 10 8 6 4 2
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die niedermolekularen PAH (besonder
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Verbindungen häufig in höheren Au
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Für die dotierten Böden wurden Au
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Pipetten oder Extraktionsgefäße v
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Mit Ausnahme des DTech PAH Tests, d
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Tabelle 48: Ris c Soil Test, Übers
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Tabelle 49: PAH RaPID Assay, Übers
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Unterbefunde zu erwarten, da der Te
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In Abbildung 19 sind die Ergebnisse
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4.4 Ergebnisse der zweckspezifische
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Anteil [%] Summe 15 PAH 35% 30% 25%
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Vor den Untersuchungen im PAH RaPID
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Testergebnis [ppm] 600 500 400 300
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4.4.1.2 Felduntersuchungen In einer
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Anteil [%] Summe 15 PAH 35% 30% 25%
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Tabelle 57: Ris c Soil Test, Realpr
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Tabelle 58: PAH RaPID Assay, Realpr
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Inhomogenitäten, wie in den Proben
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Die Felduntersuchung der Proben von
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Tabelle 61: DTech PAH Test, Realpro
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Tabelle 62: Stadtallendorf, Referen
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(Methanolextrakt der Tests, Extrakt
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Entsprechend der PAH-Verteilung in
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4.5 Übersicht der zweckspezifische
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Dennoch wurden auch in der auf den
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die Konzentration der Proben mit >1
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Keepers, teilweise Verluste für di
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der PAH (jede Verbindung in gleiche
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Bei der Untersuchung von hochkontam
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Der Ris c Soil Test eignet sich fü
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Mit dem DTech PAH Test wurden mehrh
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7 Literaturverzeichnis Abraham, G.E
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Chen, G.S., Schramm, K.-W., Klimm,
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Chromatography Atmospheric Pressure
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gaschromatographischer Analyse. GIT
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StLMU. (1997). Probenahme von Böde
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8 Anhang 8.1 Verwendete Geräte, Ch
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8.2 Statistische Kenngrößen Zur B
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8.3 Datenanhang Tabelle A 1: Refere
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Tabelle A 4: Risc Soil Test Standar
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Tabelle A 6: PAH RaPID Assay, Stand
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Tabelle A 6: PAH RaPID Assay, Stand
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Tabelle A 8: Ris c Soil Test, Dotie
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Tabelle A 9: Risc Soil Test, Dotier
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Tabelle A 18: DTech PAH Test, Dotie
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Tabelle A 33: Ris c Soil Test, Feld
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Tabelle A 35: PAH RaPID Assay, Feld
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Tabelle A 37: DTech PAH Test, Feldu
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Tabelle A 39: Sanierungsgelände St
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