Untersuchungen zur Kapazitation und Hyperaktivierung equiner ...

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Literaturübersicht mehr oder weniger einzelne Durchfließen der Spermien einer Messkammer. Das Gerät erkennt vorbeifließende Zellen entweder an einer vorübergehenden Spannungsänderung oder schließt über Änderungen der Vorwärts- und Seitwärtsstreuung des einfallenden Laserlichts auf Größe und Granularität der Partikel und ermöglicht so die Unterscheidung der Spermien von anderen Partikeln. Vor der Messung werden die Spermien mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt (s.u.). Mit Hilfe eines Lasers werden die Fluoreszenzfarbstoffe zur Fluoreszenz angeregt. Das emittierte Licht wird elektronisch verstärkt und von Fotozellen registriert. Durch die Auswahl geeigneter Filter empfängt jeder Detektor nur Licht einer bestimmten Wellenlänge. 2.6. Fluoreszenzfarbstoffe Durch Kopplung des Fluoreszenzfarbstoffes Fluorescein-isothiocyanate (FITC) an ein Lektin der Erdnuss Arachis hypogea entsteht FITC-PNA. Das Lektin (Peanut- Agglutinin) bindet an die Innenseite der äußeren akrosomalen Membran (FLESCH et al. 1998) und zeigt dadurch die Akrosomreaktion an. Bei Anregung zeigt der Fluoreszenzfarbstoff grüne Fluoreszenz. Für den Fluoreszenzmarker Propidiumiodid (PI) stellt die intakte Zellmembran ein impermeables Hindernis dar, so dass nur membrandefekte Zellen mit PI gefärbt werden können. Propidiumiodid bindet an doppelsträngige DNA und RNA (TAS u. WESTERNENG 1981) und emittiert nach Anregung rotes Fluoreszenzlicht. Merocyanin 540 ist ein hydrophober gelber Fluoreszenzfarbstoff, der Zellmembranen stärker anfärbt, wenn die Zelllipide weniger geordnet vorliegen (WILLIAMSON et al. 1983). RATHI et al. (2001) nutzten diese Eigenschaft, um durch Hydrogenkarbonat ausgelöste Änderungen der Phospholipidzusammensetzung der Zellmembran während der Kapazitation darzustellen. YoPro als grüne Gegenfärbung zu Merocyanin ist wie auch PI ein Farbstoff für den die intakte Zellmembran ein impermeables Hindernis darstellt (KAVAK et al. 2003, RATHI et al. 2001). 12
Literaturübersicht Der Mitochondrienfarbstoff 5,5´,6,6´-Tetrachloro-1,1´,3,3´-tetraethylbenzimidazolyl- carbocyanin iodid (JC-1) ermöglicht die Unterscheidung von Spermien mit hohem und niedrigem Mitochondrienmembranpotential, also zwischen hochleistenden und wenig leistungsfähigen Mitochondrien. JC-1 ist ein lipophiler Farbstoff, der in alle Mitochondrien aufgenommen wird und dort grün fluoresziert. In hochleistenden Mitochondrien steigt die Menge des aufgenommenen JC-1, welches in der Organelle Aggregate formt und dann orange Fluoreszenz emittiert (GARNER et al. 1997; GILLAN et al. 2005). 13
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