Untersuchungen zur Kapazitation und Hyperaktivierung equiner ...

Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zur
Kapazitation und Hyperaktivierung equiner Spermatozoen
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Florian Ortgies
Hannover
Hannover 2011

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. H. Sieme
1. Gutachter: Prof. Dr. H. Sieme
2. Gutachter: Prof. Dr. C. Wrenzycki
Klinik für Pferde
Tag der mündlichen Prüfung: 14.11.2011
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken

Meiner Familie und Christin

Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
2. Literaturübersicht 2
2.1. Spermatogenese und Fertilisation 2
2.2. Kapazitation und Hyperaktivität 4
2.3. Medien und Chemikalien 7
2.4. Computer-assistierte Spermienanalyse (CASA) 10
2.5. Durchflusszytometrie 11
2.6. Fluoreszenzfarbstoffe 12
3. Material und Methode 14
3.1. Tiere 14
3.2. Samengewinnung und –aufbereitung 14
3.3. Medien 15
3.4. Chemikalien 15
3.5. Durchflusszytometie 16
3.5.1. FITC-PNA/PI –Messung 17
3.5.2. Merocyanin-540-Messung 19
3.5.3. JC-1-Messung 19
3.6. Computer-assistierte Spermienanalyse (CASA) 20
3.7. Statistik 20
4. Ergebnisse 22
4.1. Chapter 1: Effect of procaine, pentoxifylline and trolox on capacitation
and hyperactivatio of stallion spermatozoa 22
4.2. Chapter 2: Procaine-induced sperm hyperactivation and in vitro
capacitation properties show differences amongst stallions 23
4.2.1. Abstract 24
4.2.2. Introduction 25
4.2.3. Materials and methods 27
4.2.3.1 Semen collection and dilution 27
4.2.3.2 Flow cytometric analysis of in vitro capacitation 28

4.2.3.3 Procaine-induced hyperactivation 30
4.2.4. Results 32
4.2.4.1 Procaine-induced hyperactivation 32
4.2.4.2. Individual variation in procaine-induced hyperactivation
and in vitro capacitation properties 32
4.2.4.3. Hyperactivation and in vitro capacitation properties
in (non-) capacitation medium supplemented with procaine 33
4.2.4.4. Procaine-induced hyperactivation of cryopreserved
stallion sperm 34
4.2.5. Dicussion 35
4.2.6. References 36
4.2.7. Figure legends and figures 40
5. Diskussion 50
6. Zusammenfasssung 53
7. Summary 54
8. Literaturverzeichnis 55
9. Abbildungsverzeichnis 66
10. Tabellenverzeichnis 68
11. Anhang 69

Abkürzungsverzeichnis
® eingetragenes Warenzeichen
TM registered Trademark
ºC Temperatur in Grad Celsius
% Prozent
ALH Amplitude of Lateral Head displacement (Amplitude seitlicher Kopfauslenkung;
Strecke, die der Spermienkopf in Bewegung ausschlägt)
ATP Adenosin-triphosphat
BCF Beat-cross Frequency (Frequenz, mit der der Spermienkopf in Bewegung ausschlägt)
BSA bovines Serumalbumin
CaCL2
Calciumchlorid
cAMP zyklisches (cyclic) Adenosin-3',5'-monophosphat
cap kapazitierend
CAP kapazitierte Spermien
CASA Computer assisted sperm analysis / Computer-assistierte Spermienanalyse
CO2 Kohlenstoffdioxid
DAP Distance Average Path (Länge der geglätteten Bahn)
DCL Distance Curved Line (Länge der gewundenen Strecke)
DSL Distance Straight Line (Länge der direkten Strecke zwischen Anfangs- bis Endpunkt)
EGTA Ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetat
et al. et alii
Fig. Abbildung (figure)
FITC-PNA mit Fluorescein-isothiocyanate markiertes Peanut-agglutinin (Lektin der Erdnuss
arachis hypogea)
FL 1-3 Filter Nummer 1 bis 3
g Erdbeschleunigungskraft (gravitational acceleration)
h Stunde
HBS HEPES buffered saline (siehe Anhang)
Hz Hertz
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
HMMP Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential
IVF In –vitro-Fertilisation
JC-1 5,5´,6,6´-tetrachloro-1,1´,3,3´-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanin iodid
KCl Kaliumchlorid
KH2PO4
L Liter
Kaliumdihydroxyphosphat
LIN Linearity (VSL/VCL)

LMMP Spermien mit niedrigem Mitochondrienmembranpotential
mg Milligramm
MgCl2
MgSO4
Magnesiumchlorid
Magnesiumsulfat
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
µmol Mikromol
min Minute
ml Milliliter
mmol Millimol
mM Millimolar
mOsm Milliosmol
MOT Gesamtmotilität
MW modifiziertes Whittens Medium
MT modifiziertes Tyrode Medium
n Anzahl
NaCl Natriumchlorid
NaHCO3
Natriumhydrogencarbonat
N-CAP nicht kapazitierte Spermien
nm Nanometer
noncap nicht kapazitierend
P Irrtumswahrscheinlichkeit (probability)
PAS Spermien mit positivem akrosomalen Status
PAS-IONO Spermien mit positivem akrosomalen Status nach Behandlung mit Calcium Ionophor A
23187
pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenaktivität
PI Propidiumiodid
PMI Spermien mit intakter Zellmembran
PMS progressivly motile Spermien
s Sekunde
STR Staightness (VSL/VAP)
v Volumen
VAP Velocity Average Path (Geschwindigkeit auf einer geglätteten Bahn)
VCL Velocity Curved Line, kurvolineare Geschwindigkeit (Geschwindigkeit auf gewundener
Strecke)
vs. versus
VSL Velocity Straight Line (Geschwindigkeit auf direkter Strecke von Anfangs-
bisEndpunkt)

1. Einleitung
Einleitung
Bis heute wird die überwiegende Mehrzahl der Fohlen von der leiblichen Mutter
geboren. Die Trächtigkeit wird im Regelfall durch Bedeckung im Natursprung oder
Besamung der Stute erreicht. So führt der derzeit aktuellste Jahresbericht der FN für
das Jahr 2009 insgesamt 48206 Bedeckungen von Reitpferdestuten an. Auf die
Warmblutzucht entfallen dabei 39053 (81 %) Besamungen mit Frischsamen sowie
weitere 990 Besamungen mit Tiefgefriersperma. Im Natursprung wurden 5027 Stuten
gedeckt. Für den Embryotransfer wurden 431 tragende Empfängerstuten registriert.
Durch die anatomische Besonderheit des Pferdeeierstocks ist die Ovulation mehrerer
Follikel (Superovulation) und damit die Freisetzung mehrerer Eizellen pro
Embryotransfer zur Steigerung der Effektivität nur bedingt möglich. Das Punktieren
von Follikeln und Absaugen von Oozyten an der lebenden Stute oder auch die
Gewinnung von Eizellen aus frisch toten Ovarien ist mittlerweile möglich. Grundlage
für die Produktion von Embryonen aus diesen Zellen ist die erfolgreiche Befruchtung
der Oozyten außerhalb der Stute, die In-vitro-Fertilisation.
Um die Effektivität der Befruchtung zu erhöhen, wurden Maßnahmen wie die direkte
Injektion eines Spermiums in die Eizelle (intracytoplasmatische Spermieninjektion,
ICSI) oder das Zonasplitting entwickelt, die nicht nur beim Pferd, sondern auch bei
anderen Tierarten und bei der Frau mit Erfolg angewandt werden. Bisher stößt die
Forschung am Pferd hier an ihre Grenzen, seit den Anfängen der In-vitro-
Befruchtung sind bis heute nur zwei Fohlen geboren worden (Palmer et al. 1991;
Bezard et al. 1992).
Die Forschung fokussiert sich nun auf die Seite der männlichen Gameten. Die
verlässliche Endreifung (Kapazitation) von ejakulierten Hengstspermien stellt nach
wie vor ein Problem dar.
Ziel der vorliegenden Arbeit soll die nähere Erforschung sowohl der Wirkung
unterschiedlicher kapazitierender und nicht kapazitierender Inkubationsmedien als
auch der Effekt verschiedener Chemikalien auf die Samenzelle sein. Die rasche und
objektive Beurteilung einer Spermienpopulation wird dabei mit Hilfe der
Flowzytometrie und der Computer-assistierten Spermienanalyse (CASA) möglich.
1

2. Literaturübersicht
Literaturübersicht
2.1 Spermatogenese und Fertilisation
Die Samenzelle stellt als männliche Keimzelle eine hochspezialisierte Zelle dar,
deren einzige Aufgabe die Befruchtung der weiblichen Keimzelle, der Eizelle, ist.
Die Bildung der Spermien im Hoden (Spermatogenese) führt zum Verlust der
meisten Zellorganellen und eines Großteils des Zytoplasmas sowie zur Reduktion
des üblichen diploiden Chromosomensatzes auf einen haploiden Satz (Meiose).
Ein Ende der Zelle entwickelt eine starke Flagelle, den Spermienschwanz. An der
Wurzel dieser für die Bewegung des Spermiums notwendigen Struktur sind große
Mengen an Mitochondrien für die Bereitstellung der dafür erforderlichen Energie, in
Form von ATP, angesiedelt.
Plasmamembran
äußere akrosomale Membran
Akrosominhalt
innere akrosomale Membran
Kernmembran, den
Zellkern umschließend
postakrosomale Zentriole
Mitochondrien
Abb. 1: Schematische Darstellung der Spermienmorphologie anhand eines
Sagittalschnittes (modifiziert nach GADELLA et al. 2001)
2
akrosomaler
Bereich
postakr.
Bereich
Halsregion
Mittelstück
Hauptstück
Endstück
Kopf
Schwanz

Literaturübersicht
Weitere Reifungsvorgänge wie das Abschnüren des letzten Restes Zytoplasma, das
Erlangen der Bewegungsfähigkeit und Umstrukturierungen der Plasmamembran
erfolgen anschließend im Nebenhoden. Spermien im Nebenhodenschwanz sind
bewegungsfähig (STOREY 1975, JOHNSON et al. 1980), zeigen jedoch bis zur
Ejakulation keine Motilität. Spezifische, die Motilität hemmende Proteine wurden in
der Nebenhodenflüssigkeit der Ratte gefunden (TURNER 1982, USSELMANN 1983),
Es besteht aber auch die Möglichkeit, dass allein der saure pH im Nebenhoden
motilitätshemmend wirkt. Untersuchungen am Bullen ergaben einen pH-Wert der
Nebenhodenflüssigkeit von 5,5, mit der Folge, dass auch der intrazelluläre pH der
Spermien bei 6,5 – 6,6 lag (BABCOCK 1983, CARR 1984). Im Nebenhoden des
Hengstes sind ähnliche Verhältnisse zu erwarten, da auch beim Hengst der Gehalt
an Hydrogenkarbonat gering ist. Ejakulierter Samen enthält dagegen eine große
Menge an Hydrogenkarbonat. Werden Spermien mit Seminalplasma in Berührung
gebracht, zeigen sie die typische Motilität (GAGNON 1995, LUCONI und BALDI
2003).
Spermien aus dem Nebenhodenschwanz des Hengstes sind nach künstlicher
Besamung in der Lage Eizellen zu befruchten (BARKER und GANDIER 1957), die
Trächtigkeitsrate ist allerdings signifikant niedriger als die nach Verwendung
ejakulierter Spermien (MORRIS et al. 2002).
Nach der Ejakulation sind im weiblichen Genitaltrakt weitere Vorgänge zur Erlangung
der Befruchtungsfähigkeit nötig, die als Kapazitation bezeichnet werden (AUSTIN
1951, CHANG, 1952, AUSTIN 1960, YANAGIMACHI 1994; HARRISON 1996).
In ihrer Gesamtheit versetzt erst die Kapazitation das Spermium in die Lage, im
Eileiter zu überleben und ein Reservoir zu bilden, sich vom Eileiter zu lösen, sich
durch den Eileiter zu bewegen und nach Durchdringen der Kumuluszellen an die
Zona pellucida zu binden und die Eizelle zu befruchten (SUAREZ 2008). Die Zona
pellucida stellt eine Glycoproteinhülle dar, die die Eizelle umgibt. Dort durchläuft das
Spermium die Akrosomreaktion, bei der die Plasmamembran mit der äußeren
Akrosommembran verschmilzt und hydrolytische Enzyme freigesetzt werden. Nach
Penetration der Zona pellucida löst das Spermium in der Oozyte die kortikale
Reaktion aus, die das Eindringen weiterer Spermien verhindert und gibt das Signal
3

Literaturübersicht
für die Vollendung der Meiose der Eizelle (2. Reifeteilung). Nach Verschmelzung des
dekondensierten Spermienkopfes mit der haploiden Oozyte und der Kombination der
paternalen und maternalen Chromosomensätze wird die nun wieder diploide Zelle
Zygote genannt.
Die zur Kapazitation führenden Vorgänge verkürzen die Überlebenszeit des
betroffenen Spermiums erheblich. Dabei ist zu beachten, dass selbst innerhalb eines
Ejakulats verschiedene Spermienpopulationen existieren, die unterschiedlich schnell
die Kapazitation beginnen und durchlaufen. Dies stellt im weiblichen Genitaltrakt
einen Vorteil dar, da auf diese Weise über einen Zeitraum immer frisch kapazitierte
Spermatozoen für die Befruchtung der Oozyte zur Verfügung gestellt werden.
Während die Technik der In-vitro-Fertilisation (IVF) bei der Frau und beim Rind
erfolgreich angewendet wird, sind im equinen IVF bisher nur zwei Fohlen geboren
worden (PALMER et al. 1991, BEZARD et al. 1992).
Mit Hilfe der intracytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) kann die Kapazitation
durch mechanische Hilfe teilweise umgangen werden. Ejakulierte oder anderweitig
gewonnene Spermien werden dabei mit einer Hohlnadel direkt in die Eizelle injiziert
(HINRICHS 2005, GALLI und LAZZARI 2008).
2.2. Kapazitation und Hyperaktivität
Die Reifungsvorgänge der Spermien im weiblichen Genitale werden insgesamt als
Kapazitation bezeichnet (YANAGIMACHI 1994, HARRISON 1996). Dies beinhaltet
neben Veränderungen der Struktur der Plasmamembran (HARRISON und GADELLA
2005), die die Spermien zur Erkennung und Interaktion mit der Eizelle befähigen
(GADELLA und VAN GESTEL 2004), Veränderungen im Spermienstoffwechsel
sowie letztlich die hyperaktive Beweglichkeit (SUAREZ 2008).
Die Plasmamembran jedes Spermiums stellt eine Lipiddoppelschicht dar, in die
Phospholipide asymmetrisch eingelassen sind. Während die innere Schicht einen
hohen Anteil an Phosphatidylserin und Phosphatidylethanolamin besitzt, enthält die
äußere Schicht große Mengen an Sphingomyelin und Phosphatidylcholin (WANG et
al. 2004).
4

Literaturübersicht
Die wichtige Rolle von Hydrogenkarbonat bei der Regulation der Motilität liegt
wahrscheinlich in der Erhöhung der intrazellulären pH-Wertes durch Diffusion über
die Zellmembran und der Aktivierung der cAMP-Produktion sowie der Erhöhung der
Permeabilität der Zellmembran für Calcium-Ionen (YANAGIMACHI 1969, SUAREZ
und HO 2003). Während im Nebenhoden eine Hydrogenkarbonatkonzentration von
3-4 mM gemessen wurde, liegt Hydrogenkarbonat im Eileiter in einer deutlich
höheren Konzentration von 20 mM vor (HARRISON et al. 1996, RODRIGUEZ-
MARTINEZ et al. 2001, GADELLA und VAN GESTEL 2004).
Durch die erhöhte intrazelluläre Hydrogenkarbonatkonzentration wird eine im Zytosol
gelegene Adenylatzyklase aktiviert, die die Menge des second messengers cAMP
erhöht und dadurch zur Protein Tyrosin-Phosphorylierung über die Proteinkinase A
(PKA) führt (Abb. 2).
Dabei wird auch das spermienspezifische Enzym Scramblase aktiviert, das die
Membranarchitektur der Spermatozoen in größere Unordnung versetzt, destabilisiert,
welches zum Herauslösen von Cholesterin führt (CROSS 1998, VISCONTI und
KOPF 1998, GADELLA und HARRISON 2000, HARRISON und MILLER, 2000,
FLESCH et al., 2001, GADELLA et al., 2001, BREWIS et al. 2005, HARRISON und
GADELLA 2005).
Die Entfernung von Cholesterin führt zu einer erhöhten Membranfluidität der
Spermien, so dass einerseits die Fusionsbereitschaft der Zellmembran mit der
äußeren akrosomalen Membranen im Rahmen der Akrosomreaktion als auch die
Bindung an die Zellmembran der Oozyte ermöglicht wird (LANDIM-ALVARENGA et
al. 2001 Abb. 2). Die damit einhergehende Instabilität hat allerdings einen negativen
Einfluss auf die Überlebenszeit der Spermien. Der Cholesterinefflux erfolgt durch
Cholesterinakzeptoren wie Albumin oder Lipoproteinen im umgebenden Milieu
(CROSS 1998). Die genaue Regulation ist bisher noch nicht vollständig geklärt. In
vitro enthalten in den vorliegenden Versuchen sowohl kapazitierendes Tyrode- als
auch Whittens-Medium bovines Serumalbumin, das als Sterolakzeptor wirkt.
Ein wichtiges Merkmal kapazitierter Spermien ist die Ausbildung eines hyperaktiven
Bewegungsmusters.
5

Literaturübersicht
Sowohl für die Kapazitation als auch für die Ausbildung der Hyperaktivität wird ein
Medium benötigt, dass Calcium (BALDI et al. 1991, PARRISH et al., 1999, HO und
SUAREZ 2003) oder Hydrogenkarbonat (BOATMAN und ROBBINS 1991, GADELLA
und HARRISON 2000, FLESCH et al. 2001) zur Verfügung stellt, sowie die
Aktivierung der cAMP-Synthese ermöglicht (GADELLA und HARRISON 2002, HESS
et al. 2005, XIE et al. 2006). Während HARRISON (1996) für Säugetierspermien
annimmt, dass die Fähigkeit zur Hyperaktivität während der Kapazitation erlangt
wird, weisen neuere Ergebnisse (MARQUEZ und SUAREZ 2004) auf eine
unabhängig von der Kapazitation regulierte Hyperaktivität hin (zusammengefasst von
SUAREZ, 2008).
Als Hyperaktivität wird ein sich deutlich von der gleichmäßigen und geradlinigen
Bewegung frisch ejakulierter Spermien unterscheidendes Bewegungsmuster
bezeichnet (SUAREZ und HO 2003; TURNER 2006). Die Hyperaktivität ist durch
eine stärkere Krümmung des Spermienschwanzes mit einem asymmetrischen,
peitschenden Geißelschlag gekennzeichnet, die unter einem Deckglas zu einem
eher zirkulären Bewegungsmuster führt (SUAREZ et al. 1993; SUAREZ u. HO 2003).
Abb. 2: Schematische Darstellung einiger mit der Kapazitation
verbundener Vorgänge an der Zellmembran
[entnommen aus: VARNER und JOHNSON (2011)]
6

2.3. Medien und Chemikalien
Literaturübersicht
Tyrode-Medium wird in verschiedenen Abwandlungen schon lange in der Zell- und
Gewebeforschung eingesetzt. Auch in der spermatologischen Forschung und
Diagnostik ist es weit verbreitet. So ist TALP (Tyrode-Albumin-Laktat-Pyruvat) das
bei Bullen am häufigsten verwendete Medium, HARRISON et al. (1993, 1996)
erforschten mit einer Tyrode-basierten Lösung die Kapazitation von Eberspermien
und auch RATHI et al. (2001) griffen bei der Entwicklung des Merocyanin-Assays
darauf zurück. McPARTLIN et al. (2008) entwickelten ein modifiziertes Whittens-
Medium, dass die Kapazitation von Hengstspermien unterstützen oder auslösen soll.
Procain ist ein Lokalanästhetikum, das bei unterschiedlichen Säugetierspermien
Hyperaktivität auslöst. Beim Meerschweinchen beobachteten MUJICA et al. (1994)
durch Procain eine Verdopplung der ATP-Konzentration und einen Anstieg des
second messengers cAMP in Spermatozoen in einem glucosehaltigem Medium im
Vergleich zu einem zuckerfreien Medium.
Auch bei Hengstspermien führt Procain zu Hyperaktivität, allerdings sahen
McPARTLIN et al. (2009) keinen Einfluss auf die Protein Tyrosin-Phosphorylierung
oder die Akrosomreaktion. Durch die Verbindung mit dem Hyperaktivität auslösenden
Procain mit kapazitierendem Whittens-Medium erreichten McPARTLIN et al. (2008,
2009) bei der IVF einen hohen Anteil befruchteter Pferdeeizellen (60,7 %).
Der Phosphodiesterasehemmer Pentoxifyllin wurde und wird erfolgreich in der
Humanmedizin eingesetzt. Bei Patienten mit Oligoasthenospermie beobachtete
YOVICH (1993) bei Einsatz von Pentoxifyllin eine signifikant erhöhte
Oozytenbefruchtungs- und Embryogewinnungsrate. Behandelte menschliche
Spermien zeigen eine bessere Motilität und einen erhöhten Anteil hyperaktiver
Spermien. Außerdem soll Pentoxifyllin die Akrosomreaktion positiv beeinflussen und
als Antioxidans wirken (GAVELLA et al. 1991).
Der Einsatz von verschiedener Antioxidantien ist beschrieben an Tiefgefriersamen
vom Bullen (BECONI et al. 1993), Eber (CEROLINI et al. 2000; PEŇA et al. 2003),
Schafbock (MAXWELL und STOJANOV 1996), Mann (ASKARI et al. 1994) und
Frischsperma vom Hengst (AURICH et al. 1997; BALL et al. 2001).
7

Literaturübersicht
Der Effekt von Pentoxifyllin und dem Antioxidans Trolox (6-Hydroxy-2,5,7,8-
tetramethylchroman-2-carboxylsäure) auf Tiefgefriersamen vom Hengst wurde von
SILVA et al. (2009) untersucht. Während Pentoxifyllin keinen Einfluss auf die Motilität
hatte, erhielt Trolox die Motilität auch nach zweistündiger Inkubation. Trolox ist ein
wasserlösliches Vitamin E-Analogon mit einer starken antioxidativen Wirkung
(MICKLE und WEISEL 1993). Laut AITKEN et al. (1989) gehen viele Fälle gestörter
Spermienfunktion mit erhöhten Werten freier Radikale einher. Diese könnten zur
Peroxidation der ungesättigten Fettsäuren in der Akrosommembran und folgend zum
Verlust der Reaktivität auf den die Akrosomreaktion auslösenden Calciumeinstrom
führen. Trolox wurde bereits als Antioxidans beim Einfrieren von Ebersamen und für
Frischsamen vom Hengst genutzt. Während der Einsatz von Trolox im
Einfrierprozess positive Auswirkungen auf die Motilität des aufgetauten Eberspermas
hat (PEŇA et al. 2003), hatte es keine signifikante Wirkung auf die Motilität von auf
5˚C gekühltem Hengstsperma (BALL et al. 2001). Bish er scheinen keine
Untersuchungen auf die Wirkung von Trolox auf Kapazitation oder Hyperaktivität
vorzuliegen.
8

Literaturübersicht
Tabelle 1: Biomarker für die Kapazitation
[modifiziert nach VARNER und JOHNSON (2011)]
Messprinzip Methode Farbstoff Quelle
Membranlipide in
größerer Unordnung
Umverteilung der
Hyaluronidase
Verteilung von
membranständigen
Lektinrezeptoren
Cholesteringehalt der
Zellmembran
Laterale Beweglichkeit
der Membranlipide
Durchflusszytometrie Merocyanin 540 1, 2
Fluoreszenzmikroskopie Immunfluoreszenz 3
Durchflusszytometrie oder
Fluoreszenzmikroskopie
Fluoreszenzanisotrophie
oder Luminiszenz-
Spektrophotometrie oder
Fluoreszenzmikroskopie
Wiedererlangen der
Fluoreszenz nach
Bleichen (FRAP) oder
Spektrophotometrie oder
Fluoreszenzmikroskopie
9
Fluoreszierende
Lektine
1,6-Diphenyl-1,3,5-
hexatrien oder Filipin
Fluoreszierende
Lipide
4, 5, 6
5, 7, 8,
9
10, 11
Membranpotential Spektrofluometrie DiSC3(5) 12, 13
Tyrosinphosphorylie-
rung
Immunelektrophorese
oder Immunoblotting oder
Fluoreszenzmikroskopie
oder Durchflusszytometrie
Aminophospholipide Durchflusszytometrie oder
konfokale Mikroskopie
Monoklonale
Antikörper gegen
Phosphotyrosin
Annexin-V oder Ro-
SA-FL
12, 14,
15, 16
pH im Zytosol Spektrofluometrie BCECF-AM 17, 18
Ca 2+ im Zytosol Durchflusszytometrie oder
Spektrofluometrie
FURA-2 oder Fluo3-
AM
7
13, 19,
20, 21,
22

Literaturübersicht
1 = HARRISON et al. 1996, 2 = RATHI et al. 2001, 3 = MEYERS und ROSENBERGER 1999, 4 =
JIMINEZ et al. 2003, 5 = CROSS 2003, 6 = BENOFF 1997, 7 = GADELLA und HARRISON 2002, 8 =
COLENBRANDER et al. 2002, 9 = FLESCH et al. 2001, 10 = SMITH et al. 1998, 11 = GADELLA et al.
1995, 12 = PIEHLER et al. 2006, 13 = FRAIRE-ZAMORA und GONZALEZ-MARTINEZ 2004, 14 =
VISCONTI et al. 1995, 15 = FLESCH et al. 1999, 16 = POMMER et al. 2003, 17 = NERI-VIDAURRI et
al. 2006, 18 = GARCIA und MEIZEL 1999, 19 = LINARES-HERNANDEZ et al. 1998, 20 = BRAY et al.
2005, 21 = HARRISON et al. 1993, 22 = MAGISTRINI et al. 1997
2.4 Computerassistierte Spermienanalyse (CASA)
Zur Beurteilung der Spermaqualität stellt die lichtmikroskopische Beurteilung der
Motilität immer noch die einfachste und schnellste Methode dar. Allerdings wird die
Aussagekraft hinsichtlich einer Fertilitätsprognose unterschiedlich beurteilt. Die
Aussagen verschiedener Autoren zum Zusammenhang zwischen
Motilitätsergebnissen und Fertilität reichen von keiner Korrelation (DOWSETT und
PATTIE 1982, VOSS et al. 1981) bis zu hohen Korrelationen (SAMPER et al. 1991).
Die Einführung der computerassistierten Spermienanalyse (CASA) durch DOTT und
FOSTER (1979) führte zur Entwicklung verschiedener kommerzieller Systeme
[CellSoft-System (Stroemberg Mika); IVOS, v 12.2 (Hamilton Thorne Research,
Beverly, MA); SpermVision (Minitüb, Tiefenbach)]. Die computerassistierte
Spermienanalyse bietet den Vorteil einer raschen und bei Vermeidung von
Messungenauigkeiten objektiven Motilitätsbeurteilung. Zusätzlich zur visuellen
Beurteilung ist mittels CASA die Messung verschiedener Geschwindigkeiten und
Distanzen sowie des Bewegungsmusters der einzelnen Spermien möglich
(MORTIMER 2000).
Ein Nachteil von CASA liegt in der begrenzten Eignung von Vollmilch- oder
eidotterhaltigen Verdünnern, da Partikel fälschlicherweise als immotile
Spermienköpfe identifiziert werden können (JASKO et al. 1988).
Zu den kinetischen Parametern zählen nach BOYERS et al. (1989) die
Geschwindigkeit und Strecke über den gesamten Weg, den das Spermium
zurückgelegt hat (VCL = Velocity Curve Line, µm/s; DCL = Distance Curve Line, µm),
die mittlere Bahngeschwindigkeit und die mittlere Strecke auf einer geglätteten Bahn
(VAP = Velocity Average Path, µm/s; DAP = Distance Average Path, µm) und die
10

Literaturübersicht
Geschwindigkeit und die Strecke der direkten Verbindung zwischen Anfangs- und
Endpunkt (VSL= Velocity Straight Line, µm/s; DSL = Distance Straight Line µm).
Daher ergeben sich bei gleichmäßiglinearem Bewegungsmuster ähnliche Werte für
VAP und VSL, während VAP bei irregulärem nicht-linearem Bewegungsmuster
deutlich höher als VSL ist.
Die seitliche Kopfauslenkung (ALH = Amplitude of Lateral Head displacement)
beschreibt die Amplitude der Abweichung des Kopfes vom durchschnittlichen Weg.
Die Beat-Cross-Frequency (BCF) ist die gemittelte Frequenz, mit der die Bahn der
gesamten vom Spermium zurückgelegten Strecke die durchschnittliche Strecke
kreuzt. Aus diesen ermittelten Werten können weitere Parameter berechnet werden.
Dazu zählt die Linearität (LIN), der Quotient aus VSL und VCL, der die Geradlinigkeit
über die gesamte Strecke wiedergibt. Die Straightness (STR), VSL durch VAP,
beschreibt die Geradlinigkeit des durchschnittlichen Wegs (BOYERS et al. 1989,
MORTIMER et al. 1997).
Die mit Hilfe von CASA gemessenen Werte eignen sich gut zur Charakterisierung der
Hyperaktivität. Die Bedeutung der Hyperaktivität für das Lösen vom Eileiterepithel,
die Bewegung im Eileiter und das Durchdringen der die Eizelle umgebenden Zona
pellucida wurde bereits beschrieben (zusammengefasst von SUAREZ 2008).
Hyperaktivität ist durch eine weniger progressive, asymmetrische Bewegung der
Spermien mit einer erhöhten seitlichen Kopfauslenkung gekennzeichnet.
MORTIMER et al. (1998) definieren im menschlichen Ejakulat Spermien mit VCL ≥
150 µm/s und LIN ≤ 50% und ALH ≥ 7,0 µm als hyperaktive Spermien. RATHI et al.
(2001) legten bei Hengstspermien strengere Grenzen zur Bestimmung hyperaktiver
Spermien (VCL ≥ 180 µm/s und ALH ≥ 12 µm) an. Dies mag ein Grund für den relativ
geringen Anteil hyperaktiver Spermien im Vergleich zu dem kapazitierter Spermien
im Merocyanin-Assay sein.
2.5. Durchflusszytometrie
Die Einführung der Durchflusszytometrie in die spermatologische Untersuchung in
den 1980ern hat zu einer Vielzahl an Verwendungsmöglichkeiten und Protokollen
geführt (MORREL 1991; SPANÒ und EVENSON 1993). Prinzip der Messung ist das
11

Literaturübersicht
mehr oder weniger einzelne Durchfließen der Spermien einer Messkammer. Das
Gerät erkennt vorbeifließende Zellen entweder an einer vorübergehenden
Spannungsänderung oder schließt über Änderungen der Vorwärts- und
Seitwärtsstreuung des einfallenden Laserlichts auf Größe und Granularität der
Partikel und ermöglicht so die Unterscheidung der Spermien von anderen Partikeln.
Vor der Messung werden die Spermien mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt (s.u.).
Mit Hilfe eines Lasers werden die Fluoreszenzfarbstoffe zur Fluoreszenz angeregt.
Das emittierte Licht wird elektronisch verstärkt und von Fotozellen registriert. Durch
die Auswahl geeigneter Filter empfängt jeder Detektor nur Licht einer bestimmten
Wellenlänge.
2.6. Fluoreszenzfarbstoffe
Durch Kopplung des Fluoreszenzfarbstoffes Fluorescein-isothiocyanate (FITC) an
ein Lektin der Erdnuss Arachis hypogea entsteht FITC-PNA. Das Lektin (Peanut-
Agglutinin) bindet an die Innenseite der äußeren akrosomalen Membran (FLESCH et
al. 1998) und zeigt dadurch die Akrosomreaktion an. Bei Anregung zeigt der
Fluoreszenzfarbstoff grüne Fluoreszenz.
Für den Fluoreszenzmarker Propidiumiodid (PI) stellt die intakte Zellmembran ein
impermeables Hindernis dar, so dass nur membrandefekte Zellen mit PI gefärbt
werden können. Propidiumiodid bindet an doppelsträngige DNA und RNA (TAS u.
WESTERNENG 1981) und emittiert nach Anregung rotes Fluoreszenzlicht.
Merocyanin 540 ist ein hydrophober gelber Fluoreszenzfarbstoff, der Zellmembranen
stärker anfärbt, wenn die Zelllipide weniger geordnet vorliegen (WILLIAMSON et al.
1983). RATHI et al. (2001) nutzten diese Eigenschaft, um durch Hydrogenkarbonat
ausgelöste Änderungen der Phospholipidzusammensetzung der Zellmembran
während der Kapazitation darzustellen.
YoPro als grüne Gegenfärbung zu Merocyanin ist wie auch PI ein Farbstoff für den
die intakte Zellmembran ein impermeables Hindernis darstellt (KAVAK et al. 2003,
RATHI et al. 2001).
12

Literaturübersicht
Der Mitochondrienfarbstoff 5,5´,6,6´-Tetrachloro-1,1´,3,3´-tetraethylbenzimidazolyl-
carbocyanin iodid (JC-1) ermöglicht die Unterscheidung von Spermien mit hohem
und niedrigem Mitochondrienmembranpotential, also zwischen hochleistenden und
wenig leistungsfähigen Mitochondrien. JC-1 ist ein lipophiler Farbstoff, der in alle
Mitochondrien aufgenommen wird und dort grün fluoresziert. In hochleistenden
Mitochondrien steigt die Menge des aufgenommenen JC-1, welches in der Organelle
Aggregate formt und dann orange Fluoreszenz emittiert (GARNER et al. 1997;
GILLAN et al. 2005).
13

3. Material und Methoden
3.1. Tiere
Material und Methoden
Die Ejakulate für die vorliegende Studie wurden von bekanntermaßen fruchtbaren
Hengsten (4-19 Jahre) der Rasse hannoversches Warmblut des Niedersächsischen
Landgestüts Celle gewonnen (Versuchsteil 1: n = 4, je zwei Ejakulate , Versuchsteil
2: n = 6, je drei Ejakulate). Bei jedem Hengst wurde vor Beginn der Versuche
mehrere Wochen lang eine tägliche Samenentnahme für den Samenversand
durchgeführt. Vor und während der Experimente waren alle Hengste klinisch gesund.
Die Hengste wurden in Einzelboxen auf Stroh gehalten und dreimal täglich mit Heu
und Hafer gefüttert. Frisches Wasser stand über Selbsttränken immer zur freien
Verfügung.
3.2. Samengewinnung und –aufbereitung
Versuch 1
Die Samengewinnung erfolgte auf einem Phantom (Modell Celle) mithilfe einer
künstlichen Scheide (Modell Hannover, Minitüb, Tiefenbach) in die ein steriles
Filterpaper eingebaut wurde, um den Gel-Anteil des Ejakulats zu entfernen. Direkt im
Anschluss an die Samengewinnung erfolgte die Verdünnung des Ejakulats 1 : 1 (v/v)
mit körperwarmem nicht kapazitierendem Whittens- oder Tyrode-Medium.
Die dann folgende Zentrifugation des verdünnten Samens für 1 min bei 100g
entfernte tote Zellen und Debris. Der Überstand wurde ein zweites Mal für 5 min bei
600 g zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde mit nicht kapazitierendem und
kapazitierendem Whittens-Medium sowie mit nicht kapazitierendem und
kapazitierendem Tyrode-Medium resuspendiert und auf eine Dichte von 50 x 10 6 /ml
eingestellt. Dann inkubierten die Samenaufbereitungen bis zur Messung im
Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne 5 % CO2.
Versuch 2
Die Samengewinnung erfolgte wie bei Versuch 1 beschrieben. Nach Entfernung des
Gel-Anteils wurde das Volumen des Ejakulats, photometrisch die Dichte und
14

Material und Methoden
mikroskopisch die Motilität bestimmt und anschließend mit körperwarmem
Magermilchverdünner (INRA-82 nach VIDAMENT et al. 2000, siehe Anhang) auf
eine Dichte von100 x 10 6 /ml eingestellt und bei Raumtemperatur gelagert.
Die Produktion von Tiefgefriersamen erfolgte wie bei SIEME et al. (2003)
beschrieben. In groben Zügen wurde der verdünnte Samen für zehn Minuten bei 600
g zentrifugiert und das Pellet in Magermilchverdünner mit 2,5% Eidotter und Glyzerin
resuspendiert. Das Ziel ist eine Endkonzentration von 2,5% Glyzerin und eine Dichte
von 200 x 10 6 /mL. Über zwei Stunden wurde der Samen auf 5 ºC abgekühlt und
dann in 0,5 ml Pailletten abgefüllt. Das Einfrieren der Pailletten erfolgte mit einer
Abkühlrate von 60 ºC pro min bis auf -140 ºC und darauf folgender Lagerung in
flüssigem Stickstoff.
Das Auftauen erfolgte direkt vor der Messung für 30 s bei 37 ºC im Wasserbad.
3.3. Medien
Vier verschiedene Medien wurden in der vorliegenden Arbeit miteinander verglichen.
Neben dem modifizierten Tyrode-Medium auch das neuere modifizierte Whittens-
Medium (Zusammensetzung siehe Anhang). Durch Zugabe von Hydrogenkarbonat
und BSA wurde jeweils ein kapazitierendes Medium hergestellt, die Kontrolle ohne
Hydrogenkarbonat und BSA stellte das nicht kapazitierende Medium dar. Die Medien
wurden mindestens zwei Stunden vor Versuchsbeginn bei 38 ºC im Wärmeschrank
äquilibriert, die kapazitierenden Medien wurden wegen ihres
Hydrogenkarbonatgehalts unter 5 % CO2 Atmosphäre inkubiert.
Als Flussmedium für das Durchflusszytometer diente steril filtriertes HBS-Medium
(Zusammensetzung siehe Anhang).
3.4. Chemikalien
Versuch 1
Jede der vier Spermaaufbereitungen wurde zu vier Aliquots aufgeteilt und mit
Procain (5 mmol/l Endkonzentration; Procain-hydrochlorid; Sigma-Aldrich, München),
Pentoxifyllin (3,5 mmol/l; Sigma-Aldrich) und Trolox (120 mmol/l; 6-Hydroxy-2,5,7,8-
15

Material und Methoden
tetramethylchroman-2-carboxylsäure; Sigma-Aldrich) versetzt. Ein Aliquot ohne
Zusatz diente als Kontrolle.
Versuch 2
Im zweiten Versuchsteil wurde nur Procain (Procain-hydrochlorid; Sigma-Aldrich,
München) eingesetzt. Zu den aufbereiteten aliquotierten Spermaproben wurde aus
einer Procain-Stammlösung (100x) soviel hinzupipettiert, das folgende
Endkonzentrationen erreicht wurden: 0, 0,5; 1,0; 2,5; 5,0 und 8,0 mM Procain.
Anschließend wurden die Proben bis zur Messung im Wärmeschrank bei 38 ºC mit
und ohne 5 % CO2 inkubiert
3.5. Durchflusszytometrie
Für die Messungen wurde das Gerät Cell Lab Quanta SC MPL (Beckman Coulter,
Krefeld) genutzt. Es ist mit einem 488nm Argon-Ionenlaser zur Anregung, sowie
einem 525 ± 30 nm Filter für die Detektion grüner, einem 590 ± 30 nm Filter für
orange und einem ≥ 670 nm Filter für rote Fluoreszenz ausgerüstet.
Die Fließgeschwindigkeit des Flussmediums HBS wurde auf etwa 30 µl/min
eingestellt und hatte eine Zählrate von 200-500 Partikeln pro Sekunde zur Folge. Pro
Probe wurden 5000 Spermien gemessen. Die Auswahl der Spermien aus den
Gesamtpartikeln erfolgte auf Basis des elektronischen Volumens und der
Seitwärtsstreuung.
Für die Messungen am Durchflusszytometer wurden 5 µl des Magermilch-verdünnten
Samens (Dichte 100 x 10 6 /ml) mit Tyrode oder Whittens-Medium auf 500 µl
Endvolumen (Enddichte 1 x 10 6 /ml) verdünnt. Die hergestellten Aliquots inkubierten
unterschiedlich lange unter Lichtabschluss im Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne
5 % CO2.
Zehn Minuten vor der Messung wurden die entsprechenden Farbstoffe zupipettiert.
16

3.5.1. FITC-PNA/PI-Messung
Material und Methoden
Zur Bestimmung des Anteils der Spermien mit intakter Plasmamembran (PMI) oder
mit positivem akrosomalem Status (PAS) wurde eine Doppelfärbung mit
Propidiumiodid (PI; Sigma-Aldrich, München) und mit Fluorescein-isothiocyanate
markiertem Peanut-Agglutinin (FITC-PNA; Axxora, Lörrach) durchgeführt (RATHI et
al. 2001).
Dazu wurden 5 µl Samen (Dichte 100 x 10 6 /ml) in 490 µl Tyrode oder Whittens-
Medium verdünnt, und sowohl 2 µl 0,75 mM PI als auch 3 µl 75 µM FITC-PNA
dazupipettiert. Das Ergebnis war ein Endvolumen von 500 µl, eine Dichte von
1 x 10 6 /ml, 3 µM PI und 0,45 µM FITC-PNA.
17

Material und Methoden
Entsprechend ihrer Färbung konnten im FL1/FL3-Punktediagramm die Spermien in
vier Gruppen eingeteilt werden:
Plasmamembran-intakte, lebende Spermien mit negativem akrosomalen Status
(PMI; PI negativ, FITC-PNA negativ),
Plasmamembran-defekte Spermien mit negativem akrosomalen Status
(PI positiv, FITC-PNA negative),
Plasmamembran-defekte, nicht lebende Spermien mit positivem akrosomalem Status
(PI positiv, FITC-PNA positiv) sowie
Plasmamembran-intakte, lebende Spermien mit positivem akrosomalem Status
(PI negativ, FITC-PNA positiv).
Alle FITC-PNA-positiven Spermien wurden als Spermien mit positivem akrosomalem
Status (PAS) klassifiziert.
Abb. 3: Punktwolkendiagramm der vier Spermienpopulationen nach FITC-
PNA/PI-Färbung und anschließender durchflusszytometrischer
Auswertung
18

Material und Methoden
Die Reaktion auf Calcium Ionophor A 23187 wurde ebenfalls mit der FITC-PNA/PI-
Messung gemessen. Dazu wurden 5 µl Calcium Ionophore A 23187 (Sigma-Aldrich,
München) zur Probe dazupipettiert (5 µmol/l Endkonzentration) und 60 Minuten unter
Lichtabschluss im Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne 5 % CO2 unterschiedlich
lange inkubiert. Nach ihrem Verhalten im FL1/FL3-Punktediagramm wurden alle
FITC-PNA-positiven Spermien als Spermien mit positivem akrosomalen Status nach
Calcium Ionophore (PAS-IONO) angesehen.
3.5.2. Merocyanin 540-Messung
Die Anteile lebender kapazitierter und nicht kapazitierter Spermien wurden mit Hilfe
der Merocyanin 540-Messung bestimmt.
Zu 490 µl Samen in Tyrode oder Whittens-Medium (Dichte 5 x 10 6 /ml) wurden 5 µl
Merocyanin 540 (270 µmol/l; Sigma-Aldrich, München) und 5 µl YoPro (2.5 µmol/l;
Invitrogen, Karlsruhe) pipettiert und 30 Minuten unter Lichtabschluss im
Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne 5 % CO2 inkubiert.
Nach ihrem Verhalten im FL1/FL2-Punktediagramm wurden drei
Spermienpopulationen unterschieden:
Lebende, nicht kapazitierte Spermien (N-CAP; YoPro negativ, Merocyanin negativ),
lebende, kapazitierte Spermien (CAP; YoPro negativ, Merocyanin positiv) sowie
Plasmamembran-defekte, nicht lebende Spermien (YoPro positiv), die in der
weiteren Analyse nicht weiter verwendet wurden.
3.5.3. JC-1-Messung
Die Anteile an Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential (HMMP) und
mit niedrigem (low; LMMP) wurden mit der JC-1-Färbung bestimmt (GILLAN et al.,
2005). Nach Färbung der Spermien mit 5 µl JC-1 (0,153 mmol/l) und Inkubation unter
Lichtabschluss im Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne 5 % CO2 für 20 Minuten
konnten im FL2/FL1-Punktediagramm zwei Spermienpopulationen (HMMP und
LMMP) unterschieden werden.
19

Material und Methoden
3.6. Computer-assistierte Spermienanalyse (CASA)
Für die computervideomikrographischen Motilitäts- und Viabilitätssanalysen wurde
das Gerät Sperm Vision® Version 3.5 (Minitüb, Tiefenbach) verwendet. Das Gerät
verfügt über ein Phasenkontrastmikroskop mit beheizbarem und automatisiertem
Objekttisch. Eine beheizbare Arbeitsplatte (HT 300, Fa. Minitüb, Tiefenbach), die
auch die Beheizung des Objekttisches steuert, steht für alle Arbeitsschritte zur
Verfügung. Nach den Vorgaben der Firma Minitüb wurde für jede Messung eine 20
µm tiefe Messkammer (20 Mikron, SC 20-01-04-B, Fa. Leja, GN Nieuw-Vennep, NL)
mit etwa 4 µL aufbereitetem Sperma befüllt. Über eine mit dem Mikroskop
verbundene digitale Hochgeschwindigkeitskamera (60 Bilder pro Sekunde) wurden
die mikroskopischen Bilder an den Computer weitergeleitet. Pro Probe wurden
innerhalb von 30-45 Sekunden acht Sichtfelder und pro Feld 100 Zellen analysiert.
Das Programm errechnet aus der Positionsveränderung des Spermienkopfes in den
Bildern einer Serie folgende Parameter: Gesamtmotilität (MOT, %), progressive
Motilität (PMS, %), die mittlere Geschwindigkeit auf der geglätteten Bahn
(VAP, µm s -1 ), die Geschwindigkeit auf direkter Strecke zwischen Anfangs- und
Endpunkt (VSL, µm s -1 ), die kurvolineare Geschwindigkeit (VCL, µm s -1 ), die
Gradlinigkeit des gemittelten Weges - Straightness (STR = VSL/VAP), die Linearität
(LIN = VSL/VCL), die Strecke der direkten Verbindung zwischen Anfangs- und
Endpunkt (DSL, µm), die kurvolineare Strecke (DCL, µm), die mittlere Strecke auf
einer geglätteten Bahn (DAP, µm), die Frequenz, mit der die Bahn der DCL die der
DAP kreuzt = Beat cross frequency (BCF, Hz) und die Amplitude seitlicher
Kopfauslenkung (ALH, µm) (zusammengefasst von MORTIMER 2000).
Ab einer mittleren Geschwindigkeit auf der geglätteten Bahn (VAP) von > 40 µm s -1
und einer Geradlinigkeit (STR) > 0,5 wurde ein Spermium als progressiv motil
erkannt.
3.7. Statistik
Für die statistische Auswertung der Daten wurde das Programm „SPSS for
Windows“ (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) Version 17.0 verwendet.
20

Material und Methoden
Die Prüfung auf Normalverteilung erfolgte mit dem Kolmogorov–Smirnov-Test. Alle
Daten waren normalverteilt und wurden durch den Mittelwert und die
Standardabweichung beschrieben. Die Effekte der Medien und Reagenzien wurden
einer multifaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) unterzogen. Signifikante Einflüsse
der Medien und Reagenzien wurden mit Hilfe des Ryan-Einot-Gabriel-Welsh-Tests
(GLM mit post-hoc-Test) errechnet.
Als Signifikanzgrenze wurde bei allen Tests eine Irrtumswahrscheinlichkeit von
p ≤ 0,05 angenommen.
21

4. Ergebnisse
Ergebnisse
4.1. Chapter 1: Effect of procaine, pentoxifylline and trolox on capacitation
and hyperactivation of stallion spermatozoa
Veröffentlicht im Journal Andrologia 6. Juli 2011
Ortgies, F., Klewitz, J., Görgens, A., Martinsson, G., Sieme, H. (2011):
Effect of procaine, pentoxifylline and trolox on capacitation and hyperactivation of
stallion sperm.
Bisher nur im Internet: doi: 10.1111/j.1439-0272.2010.01150.x.
Summary
Reasons for low in vitro fertilization (IVF) rates in the horse include the difficulties in
inducing capacitation and/or hyperactivation of stallion sperm. The aim of this study
was to analyze the effect of noncapacitating and capacitating modified Whitten’s
(MW) and modified Tyrode’s medium (MT) and treatment with procaine (5 mmol),
pentoxifylline (3.5 mmol) and trolox (120 mmol) on motility (CASA), capacitation,
acrosomal status, viability and mitochondrial membrane potential of stallion
spermatozoa (n = 4). While there was no influence of MT and MW on sperm motility,
a significant increase in the percentage of viable-capacitated spermatozoa was
observed after incubation in capacitating MW (P < 0.05). Pentoxifylline showed no
significant effect on the motility pattern but increased the proportion of live-
capacitated spermatozoa (P < 0.05). Trolox had no detectable effect on either
capacitation or hyperactivation. Procaine was the only agent that induced
hyperactivation in terms of a reduced proportion of progressively motile spermatozoa,
straight line velocity, straightness, linearity and beat-cross frequency and an increase
in the amplitude of lateral head displacement (P < 0.05). The combination of
capacitating Whitten’s medium and procaine showed the best results for the
induction of capacitation and hyperactivation in stallion spermatozoa, this was
possible even after short-term incubation.
22

Ergebnisse
4.2. Chapter 2: Procaine-induced sperm hyperactivation and in vitro
capacitation properties show differences amongst stallions
Florian Ortgies 1 , Harriëtte Oldenhof 1 , Samantha Henke 1 , Jutta Klewitz 1 , Gunilla
Martinsson 2 , Harald Sieme 1,*
1 Clinic for Horses - Unit for Reproductive Medicine, University of Veterinary Medicine
Hannover, Hannover, 2 National Stud Lower Saxony, Celle, Germany
*corresponding author:
Harald Sieme
Clinic for Horses - Unit for Reproductive Medicine, University of Veterinary Medicine
Hannover, Bünteweg 15, D-30559 Hannover, Germany
keywords: capacitation, hyperactivation, stallion, sperm, procaine
abbreviations: IVF: in vitro fertilization
23

4.2.1. Abstract
Ergebnisse
In vitro induction of capacitation is one of the major challenges to overcome for
increasing success rates in equine in vitro fertilization. In addition, hyperactivation is
needed for penetration of the zona pellucida. In this study we analyzed the effect of
increasing concentrations of procaine on equine sperm hyperactivation and in vitro
capacitation. Special attention was paid to variation in responses amongst sperm
from individual stallions. Hyperactivation was induced under capacitating as well as
non-capacitating conditions, using two types of capacitation medium (Tyrode and
Whittens medium). Furthermore, it was tested if cryopreserved sperm responded to
procaine in a similar fashion as diluted sperm. Induction of hyperactivation was
quantified as increased sperm curve line velocity and lateral head movement, as
determined using computer assisted sperm analysis. Procaine concentrations of 2.5
to 5 mM resulted in maximal hyperactivation, although great variation was observed
amongst sperm from different stallions. For cryopreserved sperm, higher procaine
concentrations were needed for attaining a similar level of hyperactivation. In vitro
capacitation properties were assessed flow cytometrically, as the decrease in
membrane intact cells under capacitating conditions. No differences between Tyrode
and Whittens capacitation medium were found, irrespective of the absence or
presence of procaine.
24

4.2.2. Introduction
Ergebnisse
In vitro fertilization (IVF) in horse breeding is troublesome (Alm et al., 2001;
Choi et al., 1994; Dell’Aquila et al., 1996, 1997a, 1997b; Zhang et al., 1990; Hinrichs
et al., 2002). Up to now, there are reports on only two foals which have been
produced using IVF (Palmer et al., 1991; Bezard et al., 1992). Whereas IVF is
successful in human reproduction and used commercially in the production of
offspring of valuable cows, it is thought that unsuccessful in vitro induction of
capacitation is the reason for the low success rates of in vitro fertilization in equine
reproduction. The major barrier to IVF in the horse appears to be the penetration of
the zona pellucida. Fertilization rates can be increased by partial or total removal of
the zona or zona drilling, which in turn often results in polyspermy (Choi et al., 1994).
The term capacitation refers to the changes that ejaculated sperm undergo
during maturation inside the female reproductive tract. Capacitation involves cellular
events by which sperm acquire properties that allow for binding the zona pellucida
and fertilizing an oocyte (for review see Yanagimachi, 1994). Changes include
membrane modifications including changes in lipid composition and cholesterol
efflux, reorganization of membrane proteins, changes in surface properties and
fluidity, and permeability to calcium. Capacitated sperm become hyperactivated,
which involves a change in the sperm motility pattern to high-amplitude,
asymmetrical flagellar bends. Such movements help sperm to detach from the
oviductal epithelium, to navigate through the twisting lumen of the oviduct and
penetrate the zona pellucida (for review see Suarez, 2008).
25

Ergebnisse
Capacitation and hyperactivation are two processes that are prerequisites for
successful fertilization. They require a capacitation medium supplemented with
calcium (Baldi et al., 1991; Parrish et al., 1999; Ho & Suarez, 2003) and bicarbonate
(Boatman & Robbins, 1991; Gadella & Harrisson 2000; Flesch et al., 2001). In
addition, both processes involve cAMP synthesis (Gadella & Harrisson, 2002; Hess
et al., 2005; Xie et al., 2006). The underlying molecular pathways involved in
regulating capacitation and hyperactivation are poorly understood, but seem to be
independent of each other (for review see Suarez, 2008).
For equine IVF a diversity of treatments and incubating conditions has been
tested. Tyrode (Parrish et al., 1988) and a modified Whittens capacitation medium
(McPartlin et al., 2008) are the media that are generally used for inducing in vitro
capacitation of stallion sperm. Procaine, which is also used as a local anaesthetic, is
reported to induce hyperactivation in sperm from different mammalian species
(Marquez and Suarez, 2004, Mujica et al., 1994, Chang and Suarez, 2011), including
stallion (McPartlin et al., 2009). It is though that procaine functions through increasing
the permeability of the plasma membrane for calcium (Mujica et al., 1994). They
found, however, an increase in ATP and cAMP levels in procaine-treated sperm
irrespective of the extracellular calcium concentration. For stallion procaine-induced
sperm hyperactivation was not associated with changes in protein tyrosine
phosphorylation or the induction of acrosomal exocytosis (McPartlin et al., 2009).
McPartlin et al. (2008, 2009) have reported 60.7 % fertilized oocytes for equine IVF,
when using procaine-induced hyperactivation and Whittens capacitation medium.
In a previous study we tested the use of procaine pentoxifylline and trolox, for
their abilities to induce capacitation and hyperactivation of stallion sperm. In vitro
26

Ergebnisse
capacitation could only be induced in capacitation medium. Only use of procaine
resulted in hyperactivation, irrespective of the medium used (Ortgies et al 2011).
The aim of this study was to analyze variation in procaine-induced
hyperactivation and in vitro capacitation properties of sperm from individual stallions.
Sperm hyperactivation was induced using increasing procaine concentrations and
analyzed using computer assisted sperm analysis. In vitro capacitation was
evaluated by flow cytometric analysis of plasma and acrosomal membrane integrity
upon exposure to (non-)capacitating conditions. The use of two types of capacitating
medium (Tyrode and Whittens) was compared. Hyperactivation was induced under
capacitating as well as non-capacitating conditions, to evaluate if hyperactivation and
in vitro capacitation are coupled processes. Furthermore, it was tested if
cryopreserved sperm responded to procaine in a similar fashion as diluted sperm.
4.2.3. Materials and methods
4.2.3.1. Semen collection and dilution
Semen was collected from stallions of the Hanoverian warmblood breed,
which were held at the National Stud of Lower Saxony in Celle, Germany. The
horses were kept in box stalls bedded with straw, were fed oats and hay three times
a day, and water was freely available. Semen was collected from October to March.
Three ejaculates from each of six stallions aged 4 to 19 years were used. Semen
was collected using an artificial vagina (Model Hanover, Minitube, Tiefenbach,
27

Ergebnisse
Germany). A breeding phantom was used, and a mare was fixed in front of the
breeding phantom. Sterile gauze filtration was performed to remove the gel portion.
Semen was evaluated for volume, cell concentration and motility, after which it
was diluted with pre-warmed skim milk extender (INRA-82; Vidament et al., 2000) at
100 x 10 6 cells mL -1 and stored at room temperature until use. INRA-82 was
prepared by mixing equal amounts of glucose-saline solution and ultra heat treated
skim milk. It consists of: 25 g L -1 glucose monohydrate, 1.5 g L -1 lactose
monohydrate, 1.5 g L -1 raffinose pentahydrate, 0.4 g L -1 potassium citrate
monohydrate, 0.3 g L -1 sodium citrate dihydrate, 4.76 g HEPES, pH 7.0, 500 mg L -1
penicillin, 500 mg L -1 gentamycin, 0.15% skim milk.
Cryopreservation of semen was performed as previously described (Sieme et
al., 2003). In short, extended semen was centrifuged for 10 min at 600 x g after
which the sperm cell pellet was resuspended in skim milk extender supplemented
with 2.5% clarified egg yolk and glycerol, resulting in final concentrations of 2%
glycerol and 400 x 10 6 cells mL -1 . This suspension was cooled to 5 ˚C during 2 h,
after which it was packaged in 0.5 mL straws, cooled down to -140 ˚C at 60 ˚C min -1
and stored in liquid nitrogen. Thawing of straws was done in a water bath of 37 ˚C for
30 s, prior to analysis.
4.2.3.2. Flow cytometric analysis of in vitro capacitation
For in vitro capacitation assays, sperm were incubated in Tyrode medium
(Parrish et al., 1988). Alternatively, Whittens medium was used (McPartlin et al.,
2008). Tyrode A capacitation medium is composed of: 100 mM NaCl, 3.1 mM KCl,
28

Ergebnisse
2.0 mM CaCl2, 0.4 mM MgCl2, 0.3 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 21.6 mM Na-
lactate, 1.0 mM Na-pyruvate, 10 mM HEPES, pH 7.5, 3 g L -1 BSA, and 50 µg mL -1
gentamycin. Tyrode B control medium (for non-capacitating conditions) lacked CaCl2,
NaHCO3 and BSA, and was supplemented with 1 mM Na2EGTA. Whittens A medium
is composed of 100 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 5.5 mM glucose, 22 mM
HEPES, 4.8 mM Ca-lactate and 1.0 mM pyruvic acid Na-pyruvate, 25 mM NaHCO3
and 7 mg mL -1 BSA. Whittens B control medium (for non-capacitating conditions)
lacked NaHCO3 and BSA.
Incubations in Tyrode or Whittens A and B medium were done for 2 h, in
medium equilibrated at 37 ˚C in the presence and ab sence of 5% CO2, respectively.
Sperm were diluted in Tyrode or Whittens medium at 1 x 10 6 cells mL -1 . This was
done by diluting 5 µL 100 x 10 6 cells mL -1 in skim milk extender in a final volume of
500 µL Tyrode or Whittens medium. Aliquots were prepared for evaluation of
capacitation characteristics at subsequent time points. Fluorescent dyes were added
to these aliquots 10 min prior to flow cytometric analysis.
For determination of percentages of sperm that have damaged plasma and
acrosomal membranes, a double staining with propidium iodide (PI; Sigma-Aldrich,
St. Louis, MO, USA) and fluorescein labeled peanut agglutinin (FITC-PNA; Vector
Laboratories, Burlingame, CA, USA) was performed (Rathi et al., 2001). For PI/FITC-
PNA staining, 5 µL 100 x 10 6 cells mL -1 in extender was diluted in 490 µL Tyrode or
Whittens medium, and 2 µL 0.75 mM PI and 3 µL 75 µM FITC-PNA were added;
resulting in 1 x 10 6 cells mL -1 , 3 µM PI and 0.45 µM FITC-PNA.
A flow cytometer (Cell Lab Quanta SC MPL; Beckman-Coulter, Fullerton, CA,
USA) was used that is equipped with a 488 nm argon ion laser of 22 mw for
29

Ergebnisse
excitation, and BP 525/30, BP 590/30 and LP 670 nm filters for green, orange and
red fluorescence, respectively. HEPES-buffered saline solution of 300 mOsm kg -1
(HBS; 20 mM HEPES pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM glucose, 2.5 mM KOH) was
used as sheath fluid. A sheath fluid rate of approximately 30 µL min -1 was used
resulting in 200 to 500 counts per second. A total of 5000 sperm were measured, that
were selected on the basis of electronic volume and side scatter properties.
4.2.3.3. Procaine-induced hyperactivation
For tests in which hyperactivation was induced using increasing
concentrations of procaine, extended sperm was centrifuged for 10 min at 600 x g,
after which the cell pellet was resuspended in Tyrode A capacitation medium at 25 x
10 6 cells mL -1 . Aliquots of 500 µL were prepared to which 100x procaine stock
solution was added, resulting in final concentrations of 0, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, and 8.0
mM procaine. Samples were incubated at 37 ˚C in the presence of 5% CO2 for 10
min.
For induction of hyperactivation via procaine on cryopreserved sperm;
cryopreserved samples were thawed for 30 s at 37 ˚C , and then diluted with Tyrode
A to 25-50 x 10 6 cells mL -1 (8 times dilution: 1 part 400 x 10 6 cells mL -1 in INRA-82
supplemented with 2% egg yolk and 2% glycerol, 7 parts Tyrode A). Aliquots of 500
µL were prepared to which procaine stock solution was added as described above.
Computer assisted sperm analysis (CASA) was used to determine the effects
of various concentrations of procaine on motility parameters. Parameters included:
total motile sperm (MOT, %), progressively motile sperm (PMS, %), curved line
30

Ergebnisse
velocity (VCL, µm s -1 ), and amplitude of lateral head displacement (ALH, µm). This
was done using ‘Spermvision’ (Minitube, Tiefenbach, Germany), as previously
described (Ortgies et al. 2011). Chambers of 20 µm (Leja, Nieuw Vennep,
Netherlands) were loaded with an approximately 3 µL sample and maintained at 37
˚C. Ten microscopic fields were analyzed per sample , with 60 frames per second, for
which averages were calculated.
31

4.2.4. Results
Ergebnisse
4.2.4.1. Procaine-induced hyperactivation
Figure 1 illustrates changes in sperm motility parameters for sperm incubated
for 10 min in capacitating Tyrode medium supplemented with increasing
concentrations of procaine. Whereas total motility was not affected by increasing
concentrations of procaine, the percentage of progressively motile sperm decreased
(figure 1A). Moreover, with increasing procaine concentrations, the beat cross
frequency (BCF) decreased, while the amplitude of lateral head movement (ALH)
increased (figure 1B), and the straight line velocity (VSL) and distance (DSL)
decreased. The curve line velocity (VCL) and distance exhibited an optimum at 2.5 to
5mM procaine (figure 1C and 1D). The curve line velocity and distance as well as
head movement were chosen as most pronounced parameters indicating
hyperactivation.
4.2.4.2. Individual variation in procaine-induced hyperactivation and in vitro
capacitation properties
In order to evaluate if sperm from individual stallions exhibited differences in
procaine-induced hyperactivation and in vitro capacitation properties, averages for
these processes were determined for three ejacualates from each of six stallions
(figures 2 and 3). For procaine-induced hyperactivation, differences in the procaine
concentration needed for maximum curve line velocities were seen amongst different
32

Ergebnisse
stallions: at 2.5 versus 5 mM, resulting in VCL values ranging from 180 to 240 μm s -1
(figure 2).
Also, in vitro capacitation properties were different for sperm from these stallions.
First of all, ejaculates from different stallions exhibited different numbers of plasma
and acrosomal membrane intact cells (PI negative/FITC-PNA negative; closed black
squares). Furthermore, upon incubation in Tyrode A capacitation medium,
differences in the extent by which the number of membrane intact cells decreased
were seen, indicating differences amongst stallions in capability to undergo in vitro
capacitation. For example, stallion H1 (figure 3A) exhibits a decrease from 75% to
30% membrane intact cells, whereas stallion H5 (figure 3D) only decreases down to
45%.
4.2.4.3. Hyperactivation and in vitro capacitation properties in (non-)
capacitation medium supplemented with procaine
In figure 4, the average response of sperm incubated in Tyrode A capacitating
medium in compared with that of sperm incubated in Tyrode B control medium This
clearly illustrates that sperm undergo in vitro capacitation in Tyrode A capacitation
medium, but not in Tyrode B control medium, as is evident from the decrease in the
percentages of plasma and acrosomal membrane intact cells upon exposure to (non-
) capacitating conditions. Incubation in Tyrode B control medium only results in a
small decrease of only 5% in membrane intact cells during a 90 min incubation at 38
o C, whereas membranes become damaged for half of the sperm population upon
incubation in Tyrode A capacitation medium for 60 min. Incubation in Whittens A
33

Ergebnisse
capacitation and Whittens B control medium gives similar results as Tyrode based
media (figure 5A and 5C).
It was tested if addition of procaine to (non-)capacitating Whittens medium
affected in vitro capacitation properties. Figure 5 illustrates that in vitro capacitation
properties are unaffected by the presence of procaine, both in capacitating Whittens
and control medium.
In contrast, hyperactivation could be induced both in capacitation and control
medium. This is evident as higher VCL and ALH values for sperm incubated for up to
90 min in Whittens capacitation as well as control medium supplemented with 5 mM
procaine (figure 6).
4.2.4.4. Procaine-induced hyperactivation of cryopreserved stallion sperm
It was tested if cryopreserved sperm responded to increasing procaine
concentrations in a similar fashion as diluted sperm. Figure 7 shows changes in
sperm motility parameters for cryopreserved sperm that was diluted with Tyrode A
medium supplemented with increasing concentrations of procaine after thawing. It
seems that a higher procaine concentration is required for cryopreserved sperm for
attaining a similar increase in curve line velocity as diluted sperm (8 mM instead of 5
mM for a VCL of about 200 μm s -1 ).
34

4.2.5. Discussion
Ergebnisse
In the present study is described that procaine can induce hyperactivation,
both in capacitating and non-capacitating medium, whereas in vitro capacitation
properties are not affected by procaine. Capacitation and hyperactivation are are
processes that are often suggested to be linked and dependent on each other since
they are both required for fertilization. There are, however, reports that
hyperactivation and capacitation can be induced separately, and they involve
independent signaling pathways (for review see Suarez, 2008). The results described
in this study are in agreement with this. Marquez & Suarez (2004) describe the use of
pharmacological agents to induce hyperactivation of uncapacitated bovine sperm.
They, however, found that hyperactivation could not be induced under capacitating
conditions that support acrosomal exocytosis. We found that induction of
hyperactivation is also possible for cryopreserved sperm, although this requires
higher concentrations of procaine
In the current study we found that in vitro capacitation of stallion sperm
followed a similar pattern in Tyrode and modified Whittens capacitation medium.
McPartlin et al (2008) reported that modified Whittens medium was most successful
in inducing in vitro capacitation in equine spermatozoa. When a procaine-induced
hyperactivation was performed in this medium, they obtained 60.7% fertilized oozytes
for use in equine IVF (McPartlin et al., 2008, 2009).
Procaine-induced sperm hyperactivation is evident as a star-shaped motility
pattern using computer assisted sperm analysis sperm can be classified as
hyperactivated objectively. We observed a dose-dependent change in motility
35

Ergebnisse
parameters, with attaining a maximum curve line velocity and lateral head movement
with 5mM procaine. Sperm from different stallions, however, exhibited differences in
the procaine concentration needed for attaining a similar state of hyperactivation.
Taken together, hyperactivation and capacitation of stallion sperm can be
induced under in vitro conditions. It remains to be determined, however, how
substances like procaine affect embryo development, and dependent on the outcome
of such studies if they can be applied for in vitro fertilization for use in equine
reproduction.
4.2.6. References
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Ergebnisse
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39

4.2.7. Figure legends and figures
Ergebnisse
Figure 1. Sperm motility characteristics as determined using computer assisted
sperm analysis (CASA), of stallion sperm incubated for 10 min in Tyrode A
capacitation medium supplemented with increasing concentrations of procaine. A:
total (MOT) and progressive motility (PMS), B: amplitude of lateral head movement
(ALH) and beat cross frequency (BCF), C: average path (DAP), curve line (DCL) and
straight line distance (DSL), D: average path (VAP), curve line (VCL) and straight line
velocity (VSL), as well as linearity (VSL/VCL). Averages ± standard deviations of
three ejaculates of each of six stallions are presented.
Figure 2. Curve line velocity (VCL; closed squares) and amplitude of lateral head
movement (ALH; open squares) for sperm from different stallions (A: H1, B: H3, C:
H4, D: H5, E: H6, F: H9), that was incubated for 10 min in Tyrode A capacitation
medium supplemented with increasing concentrations of procaine. Averages ±
standard deviations of three ejaculates are presented.
Figure 3. In vitro capacitation properties of sperm from different stallions (A: H1, B:
H3, C: H4, D: H5, E: H6, F: H9). Sperm was incubated in Tyrode A capacitation
medium, and a PI/FITC-PNA double staining was performed for aliquots at different
time points after which samples were analyzed flow cytometrically. Percentages of
plasma and acrosomal membrane intact cells (PI negative/FITC-PNA negative;
closed black squares), plasma membrane damaged cells (PI positive; open squares),
40

Ergebnisse
and acrosome damaged cells (FITC-PNA positive; closed gray squares) are plotted
as a function of the incubation time under capacitating conditions. Averages ±
standard deviations of three ejaculates are presented.
Figure 4. In vitro capacitation properties for stallion sperm incubated in Tyrode A
capacitation medium (A) or Tyrode B control medium (B). Percentages of plasma and
acrosomal membrane intact cells (PI negative/FITC-PNA negative; closed black
squares), plasma membrane damaged cells (PI positive; open squares), and
acrosome damaged cells (FITC-PNA positive; closed gray squares) are plotted as a
function of the incubation time. Averages ± standard deviations of three ejaculates of
each of five stallions are presented.
Figure 5. In vitro capacitation properties for stallion sperm incubated in Whittens A
capacitation medium (A-B) or Whittens B control medium (C-D), in the absence (A,
C) and presence (B, D) of 5 mM procaine. Percentages of plasma and acrosomal
membrane intact viable cells (PI negative/FITC-PNA negative; closed black squares),
plasma membrane damaged cells (PI positive; open squares), and acrosome
damaged cells (FITC-PNA positive; closed gray squares) are plotted as a function of
the incubation time. Averages ± standard deviations of one ejaculate of each of five
stallions are presented.
Figure 6. Curve line velocity (A) and amplitude of lateral head movement (B) for
stallion sperm incubated in Whittens A capacitation medium (closed symbols) or
Whittens B control medium (open symbols), for 90 min, in the absence (squares) and
41

Ergebnisse
presence (circles) of 5 mM procaine. Averages ± standard deviations of one ejaculate
of each of five stallions are presented.
Figure 7. Sperm motility characteristics of cryopreserved sperm that was thawed and
diluted in Tyrode A capacitation medium supplemented with increasing
concentrations of procaine. Samples were incubated under capacitating conditions
for 10 min at 37 o C, after which CASA analysis was performed. A: total (MOT) and
progressive motility (PMS), B: amplitude of lateral head movement (ALH) and beat
cross frequency (BCF), C: average path (DAP), curve line (DCL) and straight line
distance (DSL), D: average path (VAP), curve line (VCL) and straight line velocity
(VSL), as well as linearity (VSL/VCL). Averages ± standard deviations of one
ejaculate of each of four stallions are presented.
42

Figure 1.
total and progressive motility (%)
distance (μm)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
MOT
PMS
procaine (mM)
DCL
DSL
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
procaine (mM)
A
C
DAP
Ergebnisse
amplitude of lateral head movement (μm)
velocity (μm s -1 )
43
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
240
220
200
180
160
140
120
100
0
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
80
ALH
VSL
BCF
procaine (mM)
60
0.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
procaine (mM)
VCL
VSL/VCL
VAP
B
D
50
40
30
20
10
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
beat cross frequency (Hz)
linearity (r.u.)

Figure 2.
curve line velocity (μm s -1 )
curve line velocity (μm s -1 )
260
240
220
200
180
160
140
120
260
240
220
200
180
160
140
VCL
ALH
VCL
ALH
120
0 1 2 3 4 5 6 7 8
procaine (mM)
A
H1
D
H5
Ergebnisse
0 1 2 3 4 5 6 7 8
procaine (mM)
44
ALH
VCL
VCL
ALH
B
H3
E
H6
VCL
VCL
ALH
ALH
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
procaine (mM)
C
H4
F
H9
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
lateral head movement (μm)
lateral head movement (μm)

Figure 3.
cells (%)
cells (%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
PI - /FITC-PNA -
PI +
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
time (min)
A
H1
FITC-PNA +
D
H5
Ergebnisse
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
time (min)
45
B
H3
E
H6
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
time (min)
C
H4
F
H9

Figure 4.
cells (%)
cells (%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
PI - /FITC-PNA -
PI +
Ergebnisse
FITC-PNA +
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
time (min)
46
A
Tyrode A
B
Tyrode B

Figure 5.
cells (%)
cells (%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
PI - /FITC-PNA -
PI +
time (min)
A
Whittens A
FITC-PNA +
C
Whittens B
Ergebnisse
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
47
B
Whittens A
+ 5 mM procaine
D
Whittens B
+ 5 mM procaine
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
time (min)

Figure 6.
curve line velocity (μm s -1 )
240
220
200
180
160
140
120 WA
100 WB
WA + procaine
80
WB + procaine
60
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
time (min)
Ergebnisse
48
amplitude of lateral head movement (μm)
10
A 9
B
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
time (min)

Figure 7.
total and progressive motility (%)
distance (μm)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
MOT
PMS
procaine (mM)
DCL
DSL
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
procaine (mM)
A
C
DAP
Ergebnisse
amplitude of lateral head movement (μm)
velocity (μm s -1 )
49
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
240
220
200
180
160
140
120
100
0
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
80
ALH
VSL
BCF
procaine (mM)
60
0.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
procaine (mM)
VCL
VSL/VCL
VAP
B
D
50
40
30
20
10
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
beat cross frequency (Hz)
linearity (r.u.)

5. Diskussion
Diskussion
Bis heute ist die Nutzung der Möglichkeiten der IVF beim Pferd begrenzt. Ein Grund
ist die bisher nicht zuverlässige Kapazitation der equinen Spermatozoen.
Während im ersten Teil der vorliegenden Studie noch Tyrode-Medium und Whittens-
Medium verglichen wurden und drei verschiedene Substanzen auf ihre Fähigkeit zur
Auslösung der Kapazitation und/oder Hyperaktivität der Hengstspermien untersucht
wurden, konzentriert sich der zweite Teil basierend auf den vorherigen Ergebnissen
nur auf Whittens-Medium und Procain. Diese Kombination verspricht laut Literatur
auch gute Ergebnisse im equinen IVF (McPARTLIN et al. 2008, 2009).
Bei der initialen durchflusszytometrischen PI/FITC-PNA-Messung zeigten Whittens-
und Tyrode-Medium keine Unterschiede im Anteil der Spermien mit positivem
akrosomalen Status. Dies spricht für die grundsätzliche Eignung beider Medien für
die Verdünnung von Hengstsperma. Die positive akrosomale Reaktion der Spermien
auf Calcium Ionophor A 23187 ist in kapazitierender Tyrode-Lösung deutlich stärker
als in kapazitierendem Whittens-Medium (cap MT 45.8 ± 20.0% versus noncap MW
17.9 ± 8.7%, cap MW 21.8 ± 5.5%, noncap MT 26.5 ± 9.0%; P < 0.05; Versuch 1:
Fig. 1d). Diese Beobachtung deckt sich mit der von McPARTLIN et al. (2008), die
eine Reaktion der Spermien auf Calcium Ionophor A 23187 in kapazitierendem
Whittens-Medium erst nach sechsstündiger Inkubation sahen.
Dem gegenüber steht der größere Anteil Merocyanin-positiver Zellen in
kapazitierendem Whittens-Medium (cap MW 34.7 ± 14.7% versus noncap MW 5.7 ±
4.9%, noncap MT 6.7 ± 9.9%, cap MT 9.0 ± 5.9%; P < 0.05; Versuch 1: Fig. 1e).
Diese Wirkung wurde schon nach der kurzen Inkubationszeit von 30 Minuten
deutlich. Offen bleibt, ob kapazitierendes Whittens-Medium zu einer insgesamt
langsameren Kapazitation führt und deshalb die im Merocyanin-Assay gefundenen
mit den frühen Stufen der Kapazitation einhergehenden Veränderungen deutlicher
werden als in Tyrode-Medium.
Beide Medien eignen sich somit für die Kapazitation von Hengstsperma, je nach
Messmethode zur Bestimmung der durchlaufenen Kapazitation bestehen jedoch
Unterschiede.
50

Diskussion
Wie sich in den Versuchen zeigte, ist der Vorteil von Whittens- gegenüber Tyrode-
Medium die bessere Konservierung der Spermien, was sich sowohl in einem
größeren Anteil Plasmamembran-intakter Spermien (PI negativ) als auch in einem
höheren Anteil an Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential (HMMP)
objektivieren lässt. Die Zugabe von Procain zeigt tendenziell eine stärkere Reaktion
der Spermien in kapazitierendem Whittens-Medium.
Die Zugabe von Procain löst praktisch sofort das typische kreisförmige, bei
genauerer Betrachtung Stern-ähnliche Bewegungsmuster hyperaktiver
Hengstspermien aus.
Mit Hilfe der Computer-assistierten Spermienanalyse lassen sich die veränderten
Parameter objektiv benennen. Neben einem Anstieg der Werte für VCL, DCL und
ALH kommt es zu einem Abfall der Werte für VSL, DSL, BCF sowie der berechneten
Werte STR und LIN und dem Anteil der progressiv motilen Spermien, während die
Gesamtmotilität nicht verändert wird. Ebenfalls verändert die Zugabe von Procain
weder den Anteil Plasmamembran-intakter (PI negativer) Zellen noch wird im
Durchflusszytometer eine Kapazitation der Spermien beobachtet.
Interessanterweise löst Procain diese Reaktion sowohl in kapazitierendem als auch
nicht kapazitierendem Medium aus, führt dabei nicht zu einem erhöhten Anteil
kapazitierter Spermien und stärkt damit die Argumentation, dass Kapazitation und
Hyperaktivität voneinander unabhängig reguliert sind (MARQUEZ und SUAREZ
2004, zusammengefasst von SUAREZ 2008). MARQUEZ und SUAREZ (2004)
lösten mit chemischen Substanzen hyperaktive Bewegungsmuster in unkapazitierten
Bullenspermien aus, konnten andererseits keine Hyperaktivität in kapazitierendem
Medium beobachten.
Im zweiten Versuchsteil konnte gezeigt werden, dass die Wirkung von Procain
konzentrationsabhängig ist und durchschnittlich bei 5mM Endkonzentration die beste
Dosierung liegt. Allerdings unterliegt die Reaktion der Spermien auf das Procain wie
auch der Ablauf der Kapazitation individuellen Einflüssen. So zeigen einzelne
Hengste schon bei geringerer Dosierung die beste Reaktion in Form einer erhöhten
VCL und ALH, sodass wahrscheinlich vor einem IVF-Versuch die individuelle Dosis
erforscht werden sollte. Bei der Messung von aufgetautem Tiefgefriersamen fällt auf,
dass durchschnittlich höhere Dosen nötig sind. Da der genaue
51

Diskussion
Wirkungsmechanismus des Procains noch nicht genau bekannt ist, erfordert die
Klärung dieser Beobachtung weitere Forschung.
Die Zugabe von Pentoxifyllin führt unabhängig vom Medium zu einem erhöhten
Anteil kapazitierter Spermien in der Merocyanin-Färbung (P < 0.05; Versuch 1: Fig.
2a–d) ohne jedoch zu hyperaktiven Bewegungsmustern zu führen. Auch dies spricht
wieder für eine voneinander unabhängig Regulation von Kapazitation und/oder
Hyperaktivierung (MARQUEZ und SUAREZ 2004; zusammengefasst von SUAREZ,
2008). Jedoch konnte der an menschlichem Sperma beschriebene positive Einfluss
auf die Akrosomreaktion (GAVELLA et al. 1991; TESARIK et al. 1992) im PI/FITC-
PNA-Assay auch nach Calcium Ionophor A 23187 nicht beobachtet werden. Die bei
der Behandlung des Mannes beobachtete bessere Motilität und den erhöhten Anteil
hyperaktiver Spermien (YOVICH, 1993) konnten wir beim Hengst ebenfalls nicht
bestätigen.
Etwas enttäuschend war die Zugabe von Trolox. Weder in der Computer-assistierten
Spermienanalyse noch in den durchflusszytometrischen Messungen konnte eine
Wirkung hinsichtlich Kapazitation und/oder Hyperaktivierung der Samenzellen
beobachtet werden.
Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen in Übereinstimmung mit McPARTLIN et al.
(2008, 2009) die Vorteile der Kombination kapazitierendes Whittens-Medium/Procain
zur Kapazitation und Hyperaktivierung von Hengstspermien. Alternativ wäre die
gleichzeitige Behandlung mit Pentoxifyllin und Procain zu überlegen.
Wie die durchflusszytometrische Messung zeigt (Versuch 1: Fig. 5), entwickelt
kapazitierendes Whittens-Medium schon nach 20 Minuten seine Wirkung. Da sich
die Wirkung des Procains direkt bei Zugabe entwickelt, wird eine längere
Vorinkubation der Spermien unnötig, so dass die Lebensfähigkeit der Spermatozoen
für die IVF erhalten bleibt. Die Wirkung dieser Aufbereitung auf die Eizelle ist noch
nicht bekannt, jedoch spricht eine IVF-Rate von 60,7 % (McPARTLIN et al., 2009) für
sich.
52

6. Zusammenfassung
Florian Ortgies (2011):
Zusammenfassung
Untersuchungen zur Kapazitation und Hyperaktivierung equiner Spermatozoen
Ziel der Dissertation war es, den Einfluss verschiedener Medien und Chemikalien auf
die Kapazitation und Hyperaktivierung von Hengstspermien mit Hilfe der computer-
assistierten Spermienanalyse und der Durchflusszytometrie zu erforschen. Dazu
wurden zwei Versuchsteile durchgeführt. Im ersten Versuchsteil wurden
kapazitierendes und nicht kapazitierendes Tyrode-Medium und kapazitierendes und
nicht kapazitierendes Whittens-Medium, sowie der Effekt von Procain, Pentoxifyllin
und Trolox getestet. Dabei zeigte sich in beiden kapazitierenden Medien eine rasche
Reaktion der Spermien, die im Kontrollmedium ausblieb. Procain führte unabhängig
vom Medium sehr schnell zu einer Hyperaktivierung der Spermien, während durch
Pentoxifyllin die Kapazitation ausgelöst wurde. Trolox zeigte keinen Effekt.
Im zweiten Versuchsteil wurde die individuelle Reaktion des Spermas von sechs
verschiedenen Hengsten auf ansteigende Procainkonzentrationen in Tyrode-Medium
näher untersucht. Dabei wurde auch tiefgefrorenes Sperma verwendet.
Eine Konzentration von 5mM Procain führte verlässlich zu einer Hyperaktivierung,
jedoch konnte gezeigt werden, dass einzelne Hengste schon auf eine deutlich
geringere Konzentration mit hyperaktiver Bewegung reagieren. Deutlich wurde
außerdem, dass TG-Samen für die Hyperaktivierung eine tendenziell höhere
Konzentration an Procain benötigt.
53

7. Summary
Florian Ortgies (2011):
Summary
Investigation on capacitation and hyperactivation of equine spermatozoa
The objective of the thesis was to determine the effect of different media and
treatments on capacitation and hyperactivation of equine spermatozoa. Sperm were
measured flowcytometrically and by computer-assisted sperm-analysis.
The first study evaluated capacitating and non-capacitating Tyrode-medium and
capacitating and non-capacitating Whittens-medium als well as the effect of procaine,
pentoxifylline and Trolox. Both capacitating media led to sperm capacitation that was
not seen in control media. Independent of the medium procaine almost immediately
induced hyperactivation, while pentoxifylline caused capacitation. Trolox showed no
effect.
The second study further examined the individual response of spermatozoa from six
different stallions on increasing procaine concentrations in Tyrode medium. This was
also performed on frozen/thawed semen.
A concentration of 5mM procaine reliably caused hyperactivation, but it was
demonstrated that hyperactivation can be induced with far lower concentrations in
individual stallions. Additionally, a higher procaine concentration is needed to induce
hyperactivation in frozen/thawed semen.
54

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9. Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Schematische Darstellung der Spermienmorphologie anhand eines
Sagittalschnittes (modifiziert nach GADELLA et al. 2001) 2
Abb.2: Schematische Darstellung einiger mit der Kapazitation verbundener
Vorgänge an der Zellmembran (entnommen aus: VARNER und
JOHNSON (2011)) 6
Abb. 3: Punktwolkendiagramm der vier Spermienpopulationen nach FITC-
PNA/PI-Färbung und anschließender durchflusszytometrischer
Auswertung 10
Figure 1. Sperm motility characteristics as determined using computer assisted
sperm analysis (CASA), of stallion sperm incubated for 10 min in
Tyrode A capacitation medium supplemented with increasing
concentrations of procaine 43
Figure 2. Curve line velocity and amplitude of lateral head movement for sperm
from different stallions, that was incubated for 10 min in Tyrode A
capacitation medium supplemented with increasing concentrations of
procaine. 44
Figure 3. In vitro capacitation properties of sperm from different stallions. Sperm
was incubated in Tyrode A capacitation medium, and a PI/FITC-PNA
double staining was performed for aliquots at different time points after
which samples were analyzed flow cytometrically. Percentages of
plasma and acrosomal membrane intact cells (PI negative/FITC-PNA
negative), plasma membrane damaged cells (PI positive); and
acrosome damaged cells (FITC-PNA positive) are plotted as a function
of the incubation time under capacitating conditions. 45
66

Abbildungsverzeichnis
Figure 4. In vitro capacitation properties for stallion sperm incubated in Tyrode A
capacitation medium or Tyrode B control medium. Percentages of
plasma and acrosomal membrane intact cells (PI negative/FITC-PNA
negative), plasma membrane damaged cells (PI positive), and
acrosome damaged cells (FITC-PNA positive) are plotted as a function
of the incubation time. 46
Figure 5. In vitro capacitation properties for stallion sperm incubated in Whittens
A capacitation medium or Whittens B control medium, in the absence
and presence of 5 mM procaine. Percentages of plasma and acrosomal
membrane intact viable cells (PI negative/FITC-PNA negative), plasma
membrane damaged cells (PI positive), and acrosome damaged cells
(FITC-PNA positive) are plotted as a function of the incubation time. 47
Figure 6. Curve line velocity and amplitude of lateral head movement for stallion
sperm incubated in Whittens A capacitation medium or Whittens B
control medium for 90 min, in the absence and presence of 5 mM
procaine. 48
Figure 7. Sperm motility characteristics of cryopreserved sperm that was thawed
and diluted in Tyrode A capacitation medium supplemented with
increasing concentrations of procaine. Samples were incubated under
capacitating conditions for 10 min at 37 oC, after which CASA analysis
was performed. A: total (MOT) and progressive motility (PMS), B:
amplitude of lateral head movement (ALH) and beat cross frequency
(BCF), C: average path (DAP), curve line (DCL) and straight line
distance (DSL), D: average path (VAP), curve line (VCL) and straight
line velocity (VSL), as well as linearity (VSL/VCL). 49
67

10. Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Biomarker für die Kapazitation
[modifiziert nach VARNER und JOHNSON (2011)] 9
68

11. Anhang
INRA 82- Magermilchverdünner
Aqua bidest. 1 L
Glucose 50 g
Lactose-Monohydrat 3 g
Raffinose x 5H2O 3 g
Na Citrat x 2 H2O 0,5 g
K Citrat x H2O 0,82 g
HEPES 9,52 g
Penicillin 1 g
Gentamycin 1 g
Magermilch (0,3% Fett) 1 L
Anhang
Der pH-Wert wurde auf 7,4 und die Osmolarität auf 300 mOsm eingestellt.
HBS-Medium
Aqua bidest. 1 L
NaCL 137 mM
KOH 2,5 mM
HEPES 20 mM
Glucose x H2O 10 mM
Der pH-Wert wurde auf 7,4 und die Osmolarität auf 300 mOsm eingestellt.
69

modifiziertes Tyrode-Medium
NaCl 96 mM
KCl 3,1 mM
MgSO4 x 7 H2O 0,4 mM
Glucose x H2O 5 mM
CaCl2 2 mM
KH2SO4 0,3 mM
HEPES 20 mM
Na-Pyruvat 1 mM
Na-Laktat Syrup 21,7 mM
Anhang
Gentamycin 100 µg/ml
Für kapazitierendes Tyrode-Medium wurde 15 mM NaHCO3 und 3 mg/ml BSA
ergänzt
Der pH-Wert wurde auf 7,4 bei 38 ºC und die Osmolarität auf 300 mOsm eingestellt
modifiziertes Whittens-Medium
NaCl 100 mM
KCl 4,7 mM
MgCl2 1,2 mM
Glucose 5,5 mM
HEPES 22 mM
Laktat 4,8 mM
Pyruvat 1,0 mM
Für kapazitierendes Whittens-Medium wurde 25 mM NaHCO3 und 7 mg/ml BSA
ergänzt
Der pH-Wert wurde auf 7,4 bei 38 ºC und die Osmolarität auf 300 mOsm eingestellt.
70

Danksagung
An erster Stelle danke ich ganz herzlich meinem Doktorvater
Herrn Prof. Dr. Harald Sieme
für die Überlassung des Dissertationthemas
und eine sehr lehrreiche, abwechslungsreiche Doktorandenzeit.
Vielen Dank für Ihre Betreuung und das Teilen Ihres Wissens, fachliche und
menschliche Beratung, Zusammenarbeit, Vertrauen und „lose Leine“, das Lachen
und den unglaublichen Humor!
Ebenso danke ich den Entscheidungsträgern und Mitarbeitern des Landgestüts Celle
sowohl für die kollegiale Zusammenarbeit und die Bereitstellung von Hengsten oder
Ejakulaten als auch für die lebendigen privaten Kontakte.
Allen Mitarbeitern der Reproduktionsmedizinischen Einheit danke ich für die
herzliche Zusammenarbeit und die freundliche Atmosphäre irgendwo zwischen
vegetarisch, selbstgemacht, mitgebracht und Hörsaal, Stall, Labor, Büro.
Alle aufzuzählen lasse ich sein, es wäre doch unvollständig.
Trotzdem extra „Danke“ an Jutta, Samantha und Jet,
sowie liebe Grüße an alle Zwei- und Vierbeiner diesseits des Kindergitters!
Ganz besonders müssen meine Traum-Kolleginnen hervorgehoben werden:
Antje, Corinna und Jutta, es war schön mit Euch!
Meinen Eltern möchte ich ganz herzlich für ihre bisher lebenslange Unterstützung
danken!
Auch ohne meine liebe Christin und meinen Bruder Felix wäre alles nichts.