Untersuchungen zur Kapazitation und Hyperaktivierung equiner ...

Material und Methoden
Die Reaktion auf Calcium Ionophor A 23187 wurde ebenfalls mit der FITC-PNA/PI-
Messung gemessen. Dazu wurden 5 µl Calcium Ionophore A 23187 (Sigma-Aldrich,
München) zur Probe dazupipettiert (5 µmol/l Endkonzentration) und 60 Minuten unter
Lichtabschluss im Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne 5 % CO2 unterschiedlich
lange inkubiert. Nach ihrem Verhalten im FL1/FL3-Punktediagramm wurden alle
FITC-PNA-positiven Spermien als Spermien mit positivem akrosomalen Status nach
Calcium Ionophore (PAS-IONO) angesehen.
3.5.2. Merocyanin 540-Messung
Die Anteile lebender kapazitierter und nicht kapazitierter Spermien wurden mit Hilfe
der Merocyanin 540-Messung bestimmt.
Zu 490 µl Samen in Tyrode oder Whittens-Medium (Dichte 5 x 10 6 /ml) wurden 5 µl
Merocyanin 540 (270 µmol/l; Sigma-Aldrich, München) und 5 µl YoPro (2.5 µmol/l;
Invitrogen, Karlsruhe) pipettiert und 30 Minuten unter Lichtabschluss im
Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne 5 % CO2 inkubiert.
Nach ihrem Verhalten im FL1/FL2-Punktediagramm wurden drei
Spermienpopulationen unterschieden:
Lebende, nicht kapazitierte Spermien (N-CAP; YoPro negativ, Merocyanin negativ),
lebende, kapazitierte Spermien (CAP; YoPro negativ, Merocyanin positiv) sowie
Plasmamembran-defekte, nicht lebende Spermien (YoPro positiv), die in der
weiteren Analyse nicht weiter verwendet wurden.
3.5.3. JC-1-Messung
Die Anteile an Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential (HMMP) und
mit niedrigem (low; LMMP) wurden mit der JC-1-Färbung bestimmt (GILLAN et al.,
2005). Nach Färbung der Spermien mit 5 µl JC-1 (0,153 mmol/l) und Inkubation unter
Lichtabschluss im Wärmeschrank bei 38 ºC mit und ohne 5 % CO2 für 20 Minuten
konnten im FL2/FL1-Punktediagramm zwei Spermienpopulationen (HMMP und
LMMP) unterschieden werden.
19