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R E P O R T
Mikroskopie
Analyse der zellulären Dynamik
durch digitale Lichtmikroskopie
DIETER G. WEISS, SERGEI A. KUZNETSOV, LICHTMIKROSKOPIE-ZENTRUM, INSTITUT FÜR ZELLBIOLOGIE UND
BIOSYSTEMTECHNIK, UNIVERSITÄT ROSTOCK
ERHARD DÖRP, INGOLF MENN, KLINIK UND POLIKLINIK FÜR INNERE MEDIZIN, UNIVERSITÄT ROSTOCK
HEINRICH KRAMBEER, KLAUS MICHEL, INSTITUT FÜR ALLGEMEINE ELEKTROTECHNIK, UNIVERSITÄT ROSTOCK
GERALD GRÜMMER, AXEL BUDDE, HASOTEC, HARDWARE & SOFTWARE TECHNOLOGY GMBH, ROSTOCK
WILLFRIED KRÖGER, TECHNOTRANS E.V., ROSTOCK
Elektronische Lichtmikroskopie
Untersuchungen der dynamischen Vorgänge
in der Zellphysiologie erfordern mikroskopische
Methoden, die Veränderungen der
Lage und der Form von Zellbestandteilen
oder der Konzentration von Substanzen als
Bildsequenz aufzeichnen und analysieren.
Analoge und digitale Videokameras am Mikroskop
haben in Kombination mit analoger
und digitaler Bildverarbeitung die Möglichkeiten
der Lichtmikroskopie weit über die
Grenzen erweitert, die dem Mikroskopieren
mit dem Auge gesetzt waren. Dies führte zu
dramatischen Verbesserungen der Auflösung,
der Lichtempfindlichkeit und des Kontrastes.
Zudem werden durch die Analyse
der elektronischen Signale viele mikroskopische
Verfahren zu quantitativen Meßmethoden.
Diese „elektronische Revolution der Lichtmikroskopie“
1 brachte uns die zahlreichen
neuen Techniken der Videomikroskopie und
der digitalen Mikroskopie. Neben Videokameras
werden auch andere elektronische Systeme
der Bildaufzeichnung am Mikroskop
genutzt, vor allem besonders lichtempfindliche
charge-coupled-device-(CCD)-Kameras
und rasternde Lichtdetektoren, so daß heute
vor allem folgende Verfahren der digitalen
Lichtmikroskopie zur Verfügung stehen:
die Video-Kontrastverstärkungs-Mikroskopie
für höchste Auflösung,
die Restlichtvideomikroskopie für Fluoreszenz
und Lumineszenz-Anwendungen
und
die elektronische Rastermikroskopie für
konfokale und 3D-Anwendungen.
Nach analoger oder digitaler Aufzeichnung
werden die Bilder vorverarbeitet und dann in
Videofrequenz (25 Hz) oder schneller in
schnellen digitalen Bildprozessoren durch
digitale Kontrastverstärkung, digitale Hintergrundsubtraktion
und digitale Filterungen
verbessert.
Zelluläre Dynamik
sichtbar gemacht
Gleichzeitig wird heute die Analyse der dynamischen
Vorgänge in der Zelle immer wichtiger,
sei es bei der Untersuchung der zellbiologischen
Abläufe, ihrer Regelung durch Signalmoleküle,
bei pathophysiologischen Veränderungen
oder bei der Analyse der Auswirkungen
genetischer Modifikationen in
transfizierten Zellen. Die elektronischen Verfahren
der Lichtmikroskopie erlauben heute
das Visualisieren aller membranumgebenen
Zellorganellen bis zu einer Größe von 40 nm
und der Cytoskelettelemente bis zu einem
Durchmesser von 20 nm. Damit können die
intrazellulären Abläufe und ihre Mechanismen
ebenso studiert werden wie die Eigenbewegungen
der Zellen oder die Mikrozirkulation
in den Kapillaren.
Video-Mikroskopie in Kombination mit Hellfeld-,
Interferenz-Kontrast- oder Polarisations-Mikroskopie,
vor allem aber die von R.D.
Allen entwickelte AVEC-DIC-(Allen videoenhanced
contrast differential interference
contrast)-Mikroskopie 2 machen die feinsten
zellulären Details sichtbar und erlauben die
Analyse ihrer Dynamik. So werden in geeigneten
Eukaryontenzellen die Elemente des
endoplasmatischen Retikulums, die Vesikel,
Mitochondrien und Lysosomen ebenso sichtbar
wie die Mikrotubuli und Aktinbündel, an
denen sie durch Motorenzyme in der Zelle
verteilt werden. Kolloidales Gold als Marker
für Antikörper wird bis zu einer Größe von 5
bis10 nm sichtbar und kann – an Antikörper
gekoppelt – als Marker für die Bewegungen
von Makromolekülen genutzt werden. So
wurden die Motorenzyme entdeckt und ihre
Rolle bei der Organellenbewegung entlang
der Cytoskelettelemente aufgeklärt.
Durch die Videomikroskopie kann die echte
Auflösung um den Faktor 2 und die Sichtbarmachung
kleiner Objekte um den Faktor 10
verbessert werden. Dies wird deshalb erreicht,
weil nur mit Kameras bei voller Nutzung der
numerischen Apertur ohne Überstrahlung
gearbeitet werden kann, und weil für elektronische
Bilderzeugung Rayleighs Auflösungskriterium
durch das vorteilhaftere Sparrow-
Kriterium ersetzt wird. 3,4 Objekte, die kleiner
als etwa 150 bis 200 nm sind, werden allerdings
als Beugungsscheibchen vergrößert
abgebildet und werden nur dann getrennt
sichtbar, also aufgelöst, wenn sie einen Abstand
von 200 nm voneinander haben.
Deutliche Fortschritte hat es auch in bezug
auf die Auflösung in der vertikalen oder z-
Achse gegeben (optical sectioning). Während
bereits die klassische Differentielle Interferenzkontrast-(DIC)-Mikroskopie
eine Auflösung
bis zu 300 nm brachte, kann diese im
AVEC-Verfahren noch weiter auf etwa 150
nm gesteigert werden. 3 In der Fluoreszenz-
Mikroskopie ist die z-Auflösung relativ
schlecht (ein bis mehrere Mikrometer); sie
kann aber durch die konfokale Laserraster-
Mikroskopie bis auf etwa 600 nm verbessert
und durch die 2-Photonen-Mikroskopie sogar
auf etwa 200 nm reduziert werden.
Abb.1: Erfassen der
Koordinaten von Zellorganellen
einer Pflanzenzelle
aus dem Live-
Bild. Die Dimensionen
der Objekte, die alle
Auswahlkriterien erfüllen,
sind in Länge und
Höhe durch rote Fadenkreuze
markiert. Der
kleine Bildschirm rechts
zeigt die akkumulierenden
Datenpunkte der
Objekte. Frame Grabber
FG32PATH (HaSoTec
GmbH, Rostock).
Bildbreite 28 µm.
Bewegungsanalysen
Seit die digitale Mikroskopie die Darstellung
der Zellorganellen erlaubt, besteht auch der
Wunsch, die lebhafte Dynamik ihrer Bewegungen
zu analysieren. So wurden Methoden
entwickelt, diese Dynamik durch eine
große Zahl von Parametern wie Geschwindigkeit,
Geradlinigkeit, Länge der Bewegungsphasen,
Richtungstreue und Richtungs-
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6 | Nr. II/2001 |transkript LABORWELT