Thesis - Tumb1.biblio.tu-muenchen.de
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2. Metho<strong>de</strong>n und Materialen 27<br />
Aceton/H 2 0 entfettet und jeweils für zwei Minuten in PB, in PB/0.1-%-Rin<strong>de</strong>r-Serum-Albumin<br />
(PB/BSA) und nochmals in PB gewaschen. Zur Absättigung von unspezifischen<br />
Bindungsstellen im Gewebe wur<strong>de</strong>n die Präparate für 30 Minuten mit 5% Ziegenserum/PB<br />
(Vector, Wiesba<strong>de</strong>n, Deutschland) inkubiert und mit <strong>de</strong>m in PB/BSA optimal verdünnten<br />
primären Antikörper (Kapitel 2.3, Seite 47) über Nacht bei 4°C inkubiert und im Anschluss<br />
daran einmal in PB/BSA, zweimal in PB und wie<strong>de</strong>r in PB/BSA gewaschen. Um<br />
unspezifische Bindungsstellen <strong>de</strong>r Antikörper gegen Maus-Immunglobuline zu blockieren,<br />
wur<strong>de</strong>n die entsprechen<strong>de</strong>n sekundären Antikörper (Kapitel 2.3, Seite 48) zunächst<br />
unverdünnt mit <strong>de</strong>r doppelten Menge Maus-Normalserum für 30 Minuten bei 37°C inkubiert.<br />
Anschließend wur<strong>de</strong>n die präinkubierten sekundären Antikörper in PB/BSA mit Ziegenserum<br />
1:100 verdünnt und für eine S<strong>tu</strong>n<strong>de</strong> auf <strong>de</strong>n Schnitten bei RT inkubiert, dann zweimal in<br />
PB/BSA und zweimal in PB gewaschen, um anschließend das gesuchte Antigen mit <strong>de</strong>m<br />
Avidin-Biotin-Peroxidasesystem sichtbar zu machen. Hierbei wird an <strong>de</strong>n biotinilierten<br />
sekundären Antikörper über eine Avidin-Biotin-Avidin Brücke eine biotinilierte Peroxidase<br />
gebun<strong>de</strong>n, welche das zugefügtes 3.3´-Diaminobenzidin (DAB) unter Reduktion von H 2 O 2<br />
oxidiert. Das oxidierte DAB polymerisiert und bil<strong>de</strong>t einen unlöslichen bräunlichen<br />
Nie<strong>de</strong>rschlag (Graham und Karnovsky, 1965; Sternberger, 1986). Für die ABC-DAB-<br />
Reaktion wur<strong>de</strong>n die Schnitte für eine S<strong>tu</strong>n<strong>de</strong> mit ABC-Reagenz (Vector, Lösung A 1:125<br />
und Lösung B 1:125 in PB, 30 Minuten vor Gebrauch angesetzt) bei RT inkubiert, wie<strong>de</strong>r in<br />
PB und PBS gewaschen, und schließlich wur<strong>de</strong> die enzymatische Reaktion durch Zusatz<br />
von Diaminobenzidin (0.5 mg/ml; filtriert) mit H 2 O 2 (1:3000) gestartet und nach 5 Minuten in<br />
Aqua <strong>de</strong>st. abgestoppt. Zur Intensivierung <strong>de</strong>r Färbung von CD3 wur<strong>de</strong>n <strong>de</strong>m<br />
Reaktionsgemisch 0,25 g/l CoCl 2 und 0,2 g/l NiS0 4 zugesetzt. Dabei kommt es zu einem<br />
Einbau dieser Cobalt und Nickel-Ionen in die Chromophoren <strong>de</strong>s polymerisierten DAB mit<br />
blau-schwarzer Tönung <strong>de</strong>r Nie<strong>de</strong>rschlagsfarbe <strong>de</strong>s entsprechen<strong>de</strong>n Produkts (Hsu und<br />
Soban, 1982). Anschließend wur<strong>de</strong>n die Schnitte in einer Alkoholreihe (jeweils 1 Minute in
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