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2. Methoden und Materialen 31
inkubiert (siehe Tabelle 6, Seite 49) und dann in PB/BSA, PB, PB und PB/BSA gewaschen.
Anschließend erfolgte erneut eine simultane Inkubation mit einem entsprechenden
Fluoreszein-5-Isothiocyanat (FITC)-konjugierten Antiserum gegen Ratten- oder Hamster-IgG
(1:100 in PB/BSA) aus der Ziege und einem biotin-konjugierten Antiserum gegen Kaninchenoder
Ratten-IgG (1:00 in PB/BSA) aus dem Esel für eine Stunde bei RT (siehe Tabelle 7,
Seite 50) und waschen de Schnitte in PB/BSA, PB, PB und PB. Schließlich wurden die
Schnitte mit einem tertiären FITC-konjugierten Antiserum gegen Ziegen-IgG (1:100 in
PB/BSA) aus dem Esel in Kombination mit Cy3-Avidin (1:1000 in PB/BSA; Dianova) für 2
Stunden bei RT inkubiert. Nach dem Waschen in PB/BSA, PB, PB und PB wurden die
Schnitte mit Vectashield eingedeckelt und bei 4 0 C in der Dunkelheit bis zum weiteren
Gebrauch aufbewahrt.
2.1.4.2 Doppelmarkierungen mit intrinsischem IgG
Im Hirnparenchym der Maus finden sich an den Mikrogliazellen bereits unter physiologischen
Bedingungen über Fc-Rezeptoren gebundene Immunglobuline (Fishman und Savitt, 1989;
Werner et al., 1998), die hier als spezifische Marker für ruhende und aktivierte
Mikrogliazellen dienten. Hierzu wurden die Schnitte nach der oben beschriebenen
Vorbehandlung und Präinkubation in 5%-% ES mit einem Peroxidase-konjugiertem
Antikörper gegen Maus-IgG aus dem Pferd (1:400 in PB/BSA) für 1 Stunde bei RT inkubiert,
dann sorgfältig in PB/BSA, PB, PB und PB/BSA gewaschen und für weitere 10 Minuten mit
biotiniliertem Tyramin (1:3000 in PB) und H 2 0 2 (1:10000 in PB) bei RT inkubiert. Bei dieser
enzymatischen Reaktion oxidiert die Peroxidase das biotinilierte Tyramin unter Reduktion
von H 2 0 2 und bewirkt dessen kovalente Bindung an den Gewebeschnitt (Bobrow et al., 1989;
Bobrow et al., 1991). Mit Hilfe des konjugierten Biotins kann das zuvor gebundene Tyramin
nun nachgewiesen werden (Adams, 1992). Nach dem Waschen in PB, PB/BSA und PB/BSA