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2. Methoden und Materialen 37
LEK FITC = (MEAN FITC-HAFS - MEAN FITC ) / (MEAN AF-HAFS - MEAN AF)
LEK Cy3 = (MEAN Cy3-HAFS - MEAN Cy3 ) / (MEAN AF-HAFS - MEAN AF)
Die korrigierten FITC- und Cy3-Bilder (KOR FITC und KOR Cy3 ) wurden dann berechnet, indem
auf alle Pixel der originalen FITC- und Cy3-Dateien folgende Formel angewandt wurde:
KOR FITC = OM FITC - LEK FITC x OM AF
KOR Cy3 = OM Cy3 – LEK Cy3 x OM AF
Die korrigierten Bilder KOR FITC und KOR Cy3 wurden als TIFF-Dateien zur weiteren Analyse
gespeichert. Die Autofluoreszenzextraktion im konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop wurde
durch Programmierung in OPTIMAS und EXCEL halbautomatisch durchgeführt (Kloss et al.,
1999).
2.1.5 Immunelektronenmikroskopie
2.1.5.1 Gewebsentnahme und -behandlung für Immunelektronenmikroskopie
Zur weiteren Untersuchung der ultrastrukturellen Veränderungen der terminalen
Neuritenendigungen an den axotomierten Motoneuronen wurden die Mäuse 7 Tage nach
Durchtrennung des N. facialis wie unter 2.1.1 beschrieben in Diethylether getötet.
Anschließend wurden die Tiere (n=4 pro Gruppe) mit 150 ml PBS/ 10mM MgCl 2 (Mg-PBS),
danach mit 200 ml 2-% Paraformaldehyd und 3.0-% Glutaraldehyd (in Mg-PBS) transkardial
perfundiert, der Hirnstamm entnommen, für 2 Stunden in 1-% Paraformaldehyd (in Mg-PBS)
bei 4 0 C nachfixiert, in Agarose eingebettet und mit einem Vibratom in 80 µm dicke Schnitte
geschnitten und sofort weiterbehandelt.
Für die elektronenmikroskopische Untersuchung der mikroglialen Nodule wurden die Mäuse
14 Tage nach Durchtrennung des N. facialis in Diethylether getötet und diesmal mit 40 ml
PBS/ 10mM MgCl 2 (Mg-PBS), danach mit 200 ml 4-% Paraformaldehyd und 3.0-%