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2. Methoden und Materialen 33
wurden die Schnitte erneut mit 5-% Eselserum zur Absättigung unspezifischer
Bindungsstellen für 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT) präinkubiert und mit dem
entsprechenden primären Antikörper über Nacht bei 4 0 C inkubiert. Anschließend wurden die
Schnitte mit einem sekundären FITC-konjugierten Antikörper gegen Ratten-IgG (1:100 in
PB/BSA) aus der Ziege (siehe Tabelle 7, Seite 50) für eine Stunde bei RT inkubiert und
dann in PB/BSA, PB, PB und PB gewaschen. Schließlich wurden die Schnitte mit einem
tertiären FITC-konjugierten Antiserum gegen Ziegen-IgG (1:100 in PB/BSA) aus dem Esel in
Kombination mit Cy3-Avidin (1:1000 in PB/BSA) für 2 Stunden bei RT inkubiert. Nach dem
Waschen in PB/BSA, PB, PB und PB wurden die Schnitte mit Vectashield eingedeckelt und
bei 4 0 C in der Dunkelheit bis zum weiteren Gebrauch aufbewahrt.
2.1.4.3 Digitalisierung der Fluoreszenz im konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop
Die weitere Darstellung und Verarbeitung der Immunfluoreszenz-Doppelmarkierungen
erfolgte mit einem konfokalen Laser-Mikroskop (TCS 4D, Leica). Zur Identifikation der sich
grünlich darstellenden FITC-Fluoreszenz wurde eine Anregungswellenlängen von 488 nm
verwendet. Die Cy3-Fluoreszenz stellte sich bei einer Anregungswellenlänge von 568 nm rot
dar. Die verschiedenen Emissionsspektren der FITC- und Cy3-Fluoreszenz wurden durch
entsprechende Filter aufgetrennt und ihre Intensität von getrennten Fotodetektoren simultan
gemessen (Lichtwerte 0-255). Die resultierenden Mikrographien hatten eine Größe von 1024
x 1024 Pixel pro Bild. Für quantitative Untersuchungen wurde ein 10x-Objektiv bei konstanter
Laserspannung benutzt, wobei hier eine Fläche von 1 mm x 1 mm erfasst wurde. Für höher
auflösende Darstellungen wurde ein 20x-, 40x- oder 100x-Objektiv gewählt. Es wurden
gleichmäßig 11 aufeinanderfolgende Bilder über eine Gesamtdicke von 30 µm aufgenommen
und mit dem Max-Intens-Algorithmus zu einem Bild kondensiert. Dieser Algorithmus wählt
aus jedem der 11 korrespondierenden Pixel, mit den jeweils gleichen x-y Koordinaten
(insgesamt 1024x1024 Pixel per Bite), den hellsten (mit dem höchsten OLVV) aller 11
Schnittebenen aus und setzt sie zu einem neuen kondensierten Bild wieder zusammen. Ein