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Steuerung der Zelladhäsion auf
Polymeroberflächen durch mikrostrukturierte
Biofunktionalisierung
Christine Richter
Dem Fachbereich Physik der Technischen Universität
Kaiserslautern zur Erlangung des akademischen Grades
„Doktor der Naturwissenschaften“ eingereichte Dissertation
durchgeführt am
Institut für Biologische Grenzflächen I in Karlsruhe
Betreuer: Juniorprof. Dr. Axel Blau
Datum des Antrags auf Eröffnung des Promotionsverfahrens:
04. Februar 2010

Kurzbeschreibung
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Herstellung, Charakterisierung und in vitro
Anwendungen neuartiger Zellkultursubstrate basierend auf chemisch funktionalisierter
Hyaluronsäure (Hyal). Hauptanforderungen an derartige Substrate waren Prozessierbarkeit,
Mustergebung und Biokompatibilität. Die spezifische Strukturgebung und/oder Beschichtung
dieser Substrate kann der Steuerung des Zellwachstums dienen und einen Einblick in die
Parameter der Zelladhäsion bieten.
Das Polysaccharid Hyaluronsäure ist einer der Hauptbestandteile der Extrazellulärmatrix
(ECM) und stellt aufgrund seiner physico-chemischen Eigenschaften eine exzellente Wahl
zur Entwicklung halb-synthetischer Biomaterialien dar. Hyal weist ein interessantes
viskoelastisches Verhalten auf, sie ist transparent, wechselwirkt meist kaum mit Proteinen
und ist bioabbaubar aber dennoch langlebiger als viele Proteine. Daher wird Hyal bereits in
vielen Gebieten des Tissue Engineering (= Gewebetechnik) eingesetzt, beispielsweise als
Wundheilungs- oder Implantatmaterial oder als Transportsystem für Medikamente. Um ein
grundlegendes Verständnis der Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen in vivo zu erhalten, ist
die Untersuchung ECM-ähnlicher Substrate in vitro erforderlich. Im Rahmen dieser Arbeit
wurden unterschiedliche Trägersubstrate mit Hyal-Derivaten oder Hyal-Kompositen
beschichtet, teilweise in einem nachfolgenden Schritt mikrostrukturtechnisch bearbeitet und
schließlich auf Zelladhäsion untersucht.
Zunächst wurden verschiedene Hyal-Derivate, die zur Vernetzung mittels Photocrosslinking
geeignet sind, hergestellt und charakterisiert. Diese Hyal-Derivate wurden zur Bildung
dreidimensionaler Hydrogele für die Einbettung von Zellen verwendet oder zur Beschichtung
dünner Trägersubstrate, wie Glas, Polystyrol und Polymilchsäure (PLA). Zur Vorbehandlung
der Substrate wurden geeignete Parameter wie die Silanisierung oder Plasma-Behandlung
ermittelt, um Hyal-Schichten aufbringen zu können. Mittels Photolithographie konnten
wasserunlösliche photovernetzte (= photocrosslinked, pcl) Hyal Strukturen im Bereich der
Mikrometer-Skala erzeugt werden.
Die pclHyal-Schichtdicken wurden mit Hilfe der Quarzmikrogravimetrie bestimmt; Strukturen
im Mikrometerbereich konnten rasterkraftmikroskopisch und mittels digitaler Mikroskopie
abgebildet werden. Weitere Analysen wie die Röntgen-Photoelektronenspektroskopie (XPS)
oder ζ-Potenzialmessungen zeigten, dass unvernetzte Hyal-Rückstände nicht einfach
abgewaschen werden konnten. Die Oberflächeneigenschaften zwischen Hyal-beschichteten
und Hyal-unbeschichteten Bereichen wiesen beispielsweise keine Unterschiede bezüglich
der Oberflächenladung auf.
Im Verlauf der Untersuchungen zeigte sich, dass pclHyal-Schichten vollständig
zellabweisend und sogar proteinresistent sind. Daher konnte pclHyal auch als Baustein für
weitere Methoden zur Steuerung der Zelladhäsion genutzt werden. Wurden
Adhäsionsvermittler wie Poly-L-Lysin oder Fibronektin eingebettet, so konnte die
Zelladhäsion auf strukturierten pcylHyal-Substraten beobachtet werden. Darüber hinaus
wurden (zyklische) Peptide synthetisiert, die als Integrin-bindendes Motiv Arginin-Glycini

Asparaginsäure (RGD) enthalten und der Funktionalisierung von pcylHyal-Beschichtungen
dienen sollten. Dabei musste das Peptid-Design einen entsprechenden Abstand zwischen
der RGD-Sequenz und der funktionellen photoreaktiven Gruppe aufweisen, über die das
Peptid an die pclHyal-Oberfläche gebunden wird. Nur so kann die immobilisierte RGD-
Einheit der Bindung an die zellulären Integrine zur Verfügung stehen. Über die selektive
Immobilisierung der Peptide auf pclHyal konnte gezeigt werden, dass die Zelladhäsion
sowohl von der Art des verwendeten Peptids als auch von der Belegungsdichte auf dem
Substrat abhängig ist.
Für die Kultivierung auf flachen, strukturierten sowie auf dreidimensional gefertigten
pcylHyal-Substraten wurden verschiedene Zelllinien verwendet: Fibroblasten (L929-Zellen)
wurden für Untersuchungen auf flachen Substraten gewählt, humane Hepatomzellen
(HepG2-Zellen) wurden zur Beobachtung des Wachstums in geformten dreidimensionalen
Substraten verwendet und Endothelzelllinien (EOMA- und Hela-Zellen) wurden zur
Vitalitätsbestimmung in Hydrogelen kultiviert.
Weltweit werden standardmäßig zweidimensionale Zellkultursysteme verwendet, obwohl
diese nicht unbedingt einem korrekten Modell der Umgebung in vivo entsprechen. Für
pclHyal-Hydrogele konnte gezeigt werden, dass diese, obwohl sie über eine entsprechend
poröse Grundstruktur verfügen, nur bedingt als Zellkultursubstrat geeignet sind. Hingegen
ermöglichte die entwickelte Strukturierungstechnik die Bildung dünner pclHyal-Schichten zur
Steuerung der Zelladhäsion in dreidimensionalen Substraten. So gelang erfolgreich die
Herstellung von Mikrokavitäten aus pclHyal/PLA als Zellkulturgerüst. Durch die Besiedelung
dieser Mikrokavitäten mit Zellen konnte gezeigt werden, dass das Zellwachstum nur auf den
gewünschten Bereichen erfolgte und keine 2d/3d-Mischpopulation vorliegt.
Insgesamt konnten verschiedene, hyaluronsäurebasierte, bioabbaubare Zellkultursubstrate
entwickelt und erfolgreich getestet werden. Diese Substrate können zur lokalen Steuerung
der Zelladhäsion genutzt werden und sind praktikable Nachbildungen der natürlichen ECM in
vitro.
ii

Abstract
The present work describes the fabrication, characterization and in vitro validation of novel
cell culture substrates based on chemically functionalized hyaluronic acid (hyal). The main
requirements of such cell culture substrates were processability, patterning and
biocompatibility. Specific structuring and/or coating of these substrates may direct cell growth
and may give insights in cell adhesion parameters.
The polysaccharide hyaluronic acid is a major component of the extra cellular matrix (ECM)
and is an excellent choice for developing semi-synthetic biomaterials due to its physicochemical
properties. Hyal exhibits interesting viscoelastic behaviour, it is transparent, only
weakly interacting with proteins and biodegradable, yet more biostable than many proteins.
Therefore, hyal is applied in several fields of tissue engineering, e.g. as wound healing or
implant material or as a drug carrier. To gain fundamental knowledge on the cell-interfaceinteractions
in vivo the application of ECM-like substrates in vitro is necessary. In this thesis
different supporting substrates were coated with hyal-derivatives or hyal-composites, partially
post-processed in a microtechnology setup, and finally tested in cell adhesion studies.
Initially, different hyal-derivatives suitable for photo crosslinking were synthesized and
characterized. These hyal-derivatives were used to generate three-dimensional hydrogels for
cell encapsulation or to coat thin supporting structures like glass, polystyrene and polylactic
acid (PLA). Pre-treatment procedures like silanization and plasma treatment were evaluated
for depositing hyal-layers onto the substrates. By photolithography water insoluble,
photocrosslinked (= pcl) hyal-structures on the micrometer-scale were fabricated.
The layer thicknesses of pclhyal were measured by quartzmicrogravimetry; µ-patterned
samples were imaged by atomic force microscopy (AFM) and digital light microscopy.
Furthermore, surface analysis by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and zetapotential
measurements revealed unexpected effects of non-crosslinked hyal residual on the surface
properties. Thus, for instance, no differences in surface charge between hyal-coated and
hyal-free areas were detected.
It was also observed that pclhyal forms a completely cell rejecting and even protein repellent
layer. Hence, pclhyal was used as a building block for further modifications aiming at
controlled cell guidance. To achieve cell adhesion on structured pclhyal-substrates,
mediators such as poly-L-lysine or fibronectin were incorporated. In addition, small (cyclo-)
peptides containing the integrin binding motif arginine-glycine-aspartic acid (RGD) were
synthesized to functionalize pclhyal-coatings. The design of these peptides included several
spacer molecules to increase the distance between the RGD sequence and the terminal
photoreactive group that binds the peptide to the pclhyal-layer. Only then, the immobilized
RGD-unit was sufficiently available for interacting with the cellular integrin. By patterned
immobilisation of these peptides onto pclhyal it could be shown that cell adhesion was
dependent on the applied peptide and on its surface density.
iii

Different cell lines were used for the cultivation on flat or three dimensionally reshaped
pclhyal-patterned substrates; fibroblasts (L929-cells) were chosen for studies on flat
substrates, human hepatoma cells (HepG2-cells) were used to monitor cell growth inside of
thermoformed, three-dimensional substrates, and endothelia cell lines (EOMA- and Helacells)
were cultivated in pclhyal-hydrogels to evaluate their viability.
Two-dimensional cell culture is state of the art in any cell culture lab worldwide, although it
does not represent an accurate model of the in vivo environment. For the use of pclhyalhydrogels
it was shown, that despite their appropriate porous framework, they are limited in
their use as cell culture scaffolds due to electrostatic shielding. However, the developed
patterning technology allowed the fabrication of thin pclhyal layers to guide cell adhesion
locally on three-dimensional substrates. As a proof of principle, microcavities made of
pclhyal/PLA were produced as a cell culture scaffold. As expected, the inoculation of these
microcavities with cells yielded scaffolds with locally controllable cell adhesion.
In summary, several different hyaluronan-based, biodegradable cell culture scaffolds were
developed and successfully tested. These scaffolds can be used to guide cell adhesion and
proved suitable for providing an ECM-like surrounding.
iv

INHALTSVERZEICHNIS
Kurzbeschreibung ..................................................................................................................... i
Abstract ....................................................................................................................................iii
1 Einleitung...........................................................................................................................1
1.1 Motivation .....................................................................................................................1
1.2 Entwicklung funktionaler Gewebestrukturen.................................................................2
1.2.1 Aufbau und Funktion der Extrazellulärmatrix.........................................................2
1.2.2 Künstliche Gewebestrukturen aus Polymeren.......................................................3
1.2.3 Gelartige Gerüststrukturen ....................................................................................4
1.2.4 Zellattraktion in Hydrogelen ...................................................................................5
1.2.5 Hydrogele auf Basis der Hyaluronsäure ................................................................7
1.3 Zielsetzung ...................................................................................................................9
2 Grundlagen......................................................................................................................11
2.1 Chemie und Biologie der Hyaluronsäure ....................................................................11
2.2 Chemische Modifikationen der Hyaluronsäure ...........................................................13
2.2.1 Modifizierungen der HA Carboxylgruppe.............................................................14
2.2.2 Modifizierungen der HA Hydroxylgruppe .............................................................16
2.3 Vernetzung von Hyaluronsäure-Derivaten..................................................................17
2.3.1 Chemisches Crosslinking ....................................................................................19
2.3.2 Photochemisches Crosslinking............................................................................20
2.3.3 Bildung von 3D-Komplexen aus Hyal-Derivaten..................................................21
2.4 Filmprozessierungsmethoden.....................................................................................21
2.4.1 Spin-Coating ........................................................................................................21
2.4.2 Silanisierung von Glas, Gold, Silizium .................................................................23
2.4.3 Plasma-Behandlung von Polymeren ...................................................................24
2.5 Biofunktionalisierung von Hyaluronsäure ...................................................................24
2.5.1 Kovalent biofunktionalisierte Hyal-Stränge zur Hydrogelbildung .........................26
2.5.2 Einbettung von Proteinen in Hydrogele ...............................................................26
2.5.3 Co-Polymerisation von Hyal-Strängen mit einem weiteren Polymer und dem
funktionalisierten Biomolekül ...............................................................................27
2.5.4 Kovalente Immobilisierung von Peptiden auf Hydrogelen ...................................28
2.6 Biofunktionalisierung mit zyklischen Peptiden ............................................................29
2.6.1 Peptide, die eine Azid-Gruppe tragen..................................................................29
2.6.2 Peptide, die einen Acrylsäure-Rest tragen ..........................................................30
2.6.3 Peptide, die über eine Thiol-Gruppe verfügen.....................................................30
v

2.7 Neue Strategie zur Biofunktionalisierung von Hyaluronsäure-Hydrogelen.................31
2.8 Einsatz von Hyal-Kompositen in der 3D-Zellkultur .....................................................32
2.9 Untersuchungsmethoden zur Charakterisierung der Biofunktionalisierung von
Polymeroberflächen und deren Einsatz in der Zellkultur ............................................34
2.9.1 Spektroskopische Verfahren................................................................................34
2.9.2 Mikroskopische Verfahren ...................................................................................36
2.9.3 Weitere Analyseverfahren ...................................................................................40
3 Material und Methoden....................................................................................................44
3.1 Methoden....................................................................................................................44
3.1.1 Oberflächenbehandlungen ..................................................................................44
3.1.2 Bildung von Hyaluronsäurefilmen und –gelen .....................................................44
3.1.3 SMART-Prozess: das Mikrothermoformen Hyaluronsäure-beschichteter PLA-
Substrate .............................................................................................................49
3.2 Synthesen der Hyaluronsäure-Derivate......................................................................51
3.2.1 Darstellung von AAHyal[43].................................................................................51
3.2.2 Darstellung von VAHyal[98].................................................................................52
3.2.3 Darstellung von ATAHyal[95]...............................................................................53
3.2.4 Darstellung von PAHyal[95].................................................................................53
3.2.5 Darstellung von GMHyal......................................................................................54
3.2.6 Darstellung von MAHyal ......................................................................................55
3.2.7 Darstellung von GMHyal und MAHyal mit Hyal (MW 50; 350; 1100 kDa) ...........56
3.3 Synthesen der Peptid-Derivate...................................................................................56
3.3.1 Darstellung von Ahx 3 [148] ...................................................................................56
3.3.2 Darstellung von AZB-Ahx 3 ...................................................................................57
3.3.3 Darstellung von VIB-Ahx 3 ....................................................................................57
3.3.4 Darstellung linearer Peptide ................................................................................59
3.3.5 Darstellung zyklischer Peptide.............................................................................60
3.4 Zellkulturversuche.......................................................................................................62
3.4.1 L929 Zellen auf pclHyal-Substraten, pclHyal/Peptid-Substraten .........................62
3.4.2 HepG2-Zellen auf pclVAHyal/PLL-PLA ...............................................................62
3.4.3 EOMA-Zellen und Hela-Zellen in pclHyal-Hydrogelen.........................................62
3.4.4 Zellen in Collagen-Gelen .....................................................................................63
4 Ergebnisse und Diskussion .............................................................................................64
4.1 Kopplungsprodukte der Hyaluronsäure ......................................................................64
4.1.1 Die Synthesen von AAHyal und VAHyal wurden gewählt, um photoaktivierbare
Gruppen an Hyaluronsäure zu binden.................................................................64
vi

4.1.2 Zur Erzeugung von Hydrogelen via Click-Chemie wurden die Synthesen von
ATAHyal und PAHyal durchgeführt .....................................................................65
4.1.3 MAHyal und GMHyal wurden aufgrund vielversprechender Literaturbeispiele für
die Anwendung als Zellkultursubstrate hergestellt ..............................................66
4.2 Hyaluronsäure-Filmbildung.........................................................................................67
4.2.1 Bestimmung geeigneter Parameter (Lösungsmittel, Plasma) zur Hyal-Anbindung
an verschiedene Substrate durch Kontaktwinkelmessungen bestimmt...............67
4.2.2 Bioabbaubarkeit der Hyal-Derivate......................................................................70
4.2.3 QCM-Messungen, AFM-Untersuchungen und 3D-Laserscan-Mikroskopie zeigen
die Film- und Profilbildung von pclHyaluronsäurefilmen auf verschiedenen
Substraten ...........................................................................................................70
4.2.4 XPS-Messungen unterschiedlicher Substrate zeigen Probleme bei der
Strukturbildung auf und liefern den Nachweis für eine erfolgreiche
Immobilisierung unterschiedlicher Hyal-Komposite .............................................80
4.2.5 Die Analyse des Zetapotenzials gibt Aufschluss über die Oberflächenladung
verschiedener Hyaluronsäurefilme ......................................................................86
4.2.6 Hyaluronsäure-Filme zur Anwendung im Mikrothermoform-Verfahren................89
4.3 Hyaluronsäure-Gelbildung ..........................................................................................90
4.3.1 Photocrosslinking von AAHyal durch Bildung reaktiver Nitrene ..........................90
4.3.2 Polymerisation von VAHyal durch Bildung reaktiver Carbene.............................92
4.3.3 Click-Gele werden aus ATAHyal und PAHyal gebildet........................................93
4.3.4 Die Polymerisation von GMHyal und MAHyal .....................................................94
4.4 Peptidsynthesen .........................................................................................................95
4.4.1 Synthesevorstufen zur Darstellung funktionalisierter Peptide .............................95
4.4.2 Die Synthese der linearen Peptide AZB-GGGRGDSP und AZB-GGGRDGSP:
Peptide, die als Linker eine Glycin-Kette tragen, an der photoreaktives Azid
gebunden ist ........................................................................................................97
4.4.3 Die Synthese der linearen Peptide VIB-GGGRGDSP und VIB-GGGRDGSP:
Peptide, die als Linker eine Glycin-Kette tragen, die den polymerisierbaren Vinyl-
Rest trägt .............................................................................................................97
4.4.4 Die Synthese von AZB-Ahx 3 -zyklo[DfKRG]. Ein ringförmig aufgebautes Peptid,
das als Linker drei Aminohexansäure-Einheiten trägt, an dessen Ende ein
photoreaktiver Azid-Rest gebunden ist................................................................98
4.4.5 Die Synthese von VIB-Ahx 3 -zyklo[DfKRG]. Ein ringförmig aufgebautes Peptid,
das als Linker drei Aminohexansäure-Einheiten trägt, an dessen Ende ein
polymerisierbarer Vinyl-Rest gebunden ist ..........................................................98
4.5 RGD-Immobilisierung auf Hyaluronan ........................................................................99
vii

4.5.1 Die Immobilisierung photoreaktiver Peptide ........................................................99
4.5.2 Die Anbindung von RGDF 19 an Hyaluronsäure mittels Festphasensynthese......99
4.6 Hyaluronsäurefilme und deren Einfluss auf das Zellwachstum ..................................99
4.6.1 Die Zelladhäsion auf verschiedenen Hyaluronsäurestrukturen lässt sich gut bei
Verwendung von GMHyal beobachten ..............................................................100
4.6.2 Durch Zugabe von FKS, FN oder PLL wird die Zelladhäsion für alle pclHyal-
Substrate ermöglicht..........................................................................................103
4.6.3 Zelladhäsion auf thermogeformten, pclVAHyal/PLL bzw. VAHyal/PLLbeschichteten
Substraten eröffnet Wege zu dreidimensionaler Zellkultivierung 105
4.6.4 Peptide ermöglichen die Zelladhäsion auf pclHyal-Filmen und die Erzeugung
kleinster Muster zur Steuerung des Zellwachstums ..........................................109
4.6.5 Die quantitative Analyse negativ geladener Kolloide auf Hyaluronsäurefilmen
liefert Erklärungsansätze zum Einfluss der Oberflächenladung bei
Zelladhäsionsprozessen ....................................................................................115
4.7 Hyaluronsäuregele und deren Einfluss auf verschiedene Zelllinien .........................117
4.7.1 Einfluss der Zelldichte und der Polymerisationsbedingungen auf die Vitalität von
EOMA-Zellen und Hela-Zellen...........................................................................117
4.7.2 Kultivierung von Zellen in Hyaluronan-Gelen ....................................................119
5 Zusammenfassung und Ausblick ..................................................................................122
5.1 Zusammenfassung ...................................................................................................122
5.2 Ausblick ....................................................................................................................124
Literaturverzeichnis ..............................................................................................................126
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................................137
Apparatives, Chemikalien, Lösungsmittel und Zellkulturmedien ..........................................142
Protokolle zur Peptidherstellung und Zellkultivierung...........................................................149
Veröffentlichungen ...............................................................................................................153
Lebenslauf............................................................................................................................154
viii

Einleitung
1 Einleitung
1.1 Motivation
Zahlreiche physiologische Prozesse werden in vitro und in vivo einerseits durch das
Wechselspiel biochemischer Parameter in der Mikroumgebung von Zellen gesteuert,
andererseits durch die Oberflächeneigenschaften des eingesetzten Zellkultursystems bzw.
Implantatmaterials. Sind Erstere von außen nur unzureichend kontrollierbar, so stehen
mittlerweile eine Vielzahl biophysikalisch-chemischer Strukturierungs- und
Modifikationsmethoden zur Verfügung, Oberflächen kontrolliert zu modifizieren. Neben der
Beeinflussung organotypischer Funktionen ausdifferenzierter Zellen wie Metabolismus,
neuronaler Aktivität oder anderer Zellfunktionen wie Sekretion und Bewegung kommt
insbesondere der Steuerung der Proliferation und der gerichteten Differenzierung adulter
Stammzellen eine stark steigende Bedeutung in der Forschung und Therapie zu. Lösliche
Faktoren wie Hormone oder Wachstumsfaktoren, die zum Teil von Zellen aufgenommen
werden und direkt in die komplexen intrazellulären Signalwege eingreifen, finden bereits fast
durchgängig in Zellkulturexperimenten Anwendung. Im Kontrast dazu erfüllen gegenwärtig
jedoch selbst biofunktionalisierte Materialoberflächen oft nicht die hohen Ansprüche
komplexer, das heißt dreidimensionaler und organotypischer Gewebemodelle. Dies liegt
sowohl an noch fehlenden Kenntnissen der Zusammenhänge im komplexen System
Oberfläche-Extrazellulärmatrix-Zelle, als auch an unzureichender Praxistauglichkeit einiger
Ansätze. Beispielsweise fehlt bei der Verwendung von Proteinen tierischen Ursprungs häufig
eine genaue Kenntnis über deren Zusammensetzung. Problematisch kann auch die
mangelnde Prozess-Stabilität so genannter Biomaterialien bei der Substratherstellung sein.
Die Züchtung komplexer, dreidimensionaler und funktioneller Gewebe, die aus mehreren
verschiedenen Zellarten und einer biologischen oder artifiziellen Gerüst- oder Stützstruktur
zusammengesetzt sind, wird Tissue Engineering (Gewebetechnik) genannt. Hat ein Material
durch seine Oberfläche, Struktur und Chemie langfristig keinen negativen Einfluß auf Zellen
und Gewebe in seiner Umgebung, so wird es als biokompatibel bezeichnet. Die Gestaltung
künstlicher Gewebe erfordert daher detaillierte Kenntnisse über den Aufbau und die
Wechselwirkung von Zellen mit ihrer natürlichen Umgebung, der so genannten
Extrazellularmatrix (ECM). Der Begriff Extrazellulärmatrix umfasst die Gesamtheit aller
Makromoleküle, die sich außerhalb der Plasmamembran von Zellen in Geweben und
Organen befinden. In der ECM wird über Botenstoffe und Proteine das Verhalten von Zellen
geregelt; damit werden Prozesse wie die Wundheilung, Gefäßentstehung (Angiogenese)
oder Metastasenbildung beeinflusst. Die Erforschung neuer funktionaler Gerüststrukturen
dient der Entwicklung von Wundheilungsmaterialien und Transportsystemen für
Medikamente oder zur Unterstützung des körpereigenen Bindegewebes. Um das Verhalten
von Zellen in vivo zu verstehen, ist die Herstellung und Anwendung biokompatibler
dreidimensionaler Strukturen notwendig, die in vitro Untersuchungen in einer ECM-ähnlichen
Matrix ermöglichen. [1]
1

Einleitung
1.2 Entwicklung funktionaler Gewebestrukturen
1.2.1 Aufbau und Funktion der Extrazellulärmatrix
Das Material, das sich im so genannten Interzellularraum zwischen Zellen befindet, wird
Extrazellulärematrix genannt. Diese besteht aus fibrillären Proteinen, die Faserstrukturen
bilden, und aus einem als Grundsubstanz bezeichneten Teil, der die Faserzwischenräume
ausfüllt. Die Hauptvertreter der faserbildenden Proteine sind die Collagene, die dem Gewebe
Zugfestigkeit verleihen. Elastische Fasern werden aus den Proteinen Fibrillin und Elastin
gebildet. Die Grundsubstanz besteht aus langkettigen Polysacchariden, Glykosaminoglykane
(GAGs) genannt, und den Adhäsionsproteinen, die als Glykoproteine bezeichnet werden. Zu
den GAGs zählen Hyaluronsäure, Heparansulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat und
Keratansulfat, die alle bis auf Hyaluronsäure an Proteine gebunden sind und so genannte
Proteoglykane (PG) bilden. Bekannte Beispiele der Glykoproteine, die die Wechselwirkung
der ECM mit Zellrezeptoren oder anderen Matrixbestandteilen ermöglichen, sind die
Laminine, Vitronektin und Fibronektin. In Abbildung 1-1 ist die ECM-Umgebung einer Zelle
schematisch dargestellt.
Abbildung 1-1: Darstellung einer Zellmembran mit Membranrezeptoren umgeben von der
ECM [2]
Das durch die Fasern gebildete Netz oder Gitter der ECM wird in seinen Eigenschaften
durch die hohe Wasseraufnahmekapazität der Proteoglykane und GAGs beeinflusst. Damit
werden sowohl die Geometrie der Zellumgebung gestaltet als auch wichtige Transportwege
für Metaboliten geschaffen. Der direkte Kontakt der ECM mit Zelloberflächenrezeptoren löst
im Zellinneren Signalkaskaden aus, die Regulationssysteme stimulieren oder hemmen.
Dadurch können einerseits Zelleigenschaften verändert werden, andererseits die
extrazelluläre Matrix durch ECM-Synthese oder –Abbau auch selbst. Über diesen als
‚dynamic reciprocity‘ bezeichneten Prozess können die Adhäsion, Migration, Zellteilung,
Differenzierung und Dedifferenzierung sowie die Apoptose in Geweben gesteuert werden. [3]
2

Einleitung
Zur Bindung von Zellen an die Bestandteile der ECM werden die Adhäsionsproteine benötigt.
Diese binden an so genannte Integrine, das sind in der Zellmembran lokalisierte
Adhäsionsmoleküle und Signaltransduktoren. Die bekannteste Sequenz zur Erkennung
durch die Integrine zur Zellbindung ist das Tripeptid Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD).
[4, 5] Die RGD-Sequenz kommt vor allem in den Proteinen Fibronetkin und Vitronektin vor,
die eine wichtige Rolle bei der Zellmigration und -adhäsion spielen.
1.2.2 Künstliche Gewebestrukturen aus Polymeren
Das Feld zur Erforschung biologischer Oberflächen ist stark interdisziplinär geprägt. So
erfordert die Entwicklung medizinischer Implantate, neuer Biosensoren und Biochips zur
Diagnose sowie photosynthetischer und biomimetrischer Materialien Kenntnisse auf dem
Gebiet der Zellbiologie und Materialwissenschaften, insbesondere der
Oberflächenmodifikationstechniken. [6] Bei der Entwicklung so genannter funktionaler
Biomaterialien spielen topographische Effekte, die chemische Gestaltung und die
dynamischen Eigenschaften des biokompatiblen Systems eine wichtige Rolle. [7] Die
traditionelle zweidimensionale Zellkultur kann jedoch nur einen kleinen Einblick in die
komplexen und dynamischen Vorgänge im Körper bieten, sodass die Herstellung von in vitro
3D-Modellen zur Beobachtung zellulärer Wechselwirkungen auf dem Gebiet des Tissue
Engineering eine große Herausforderung darstellt. [8] Abbildung 1-2 stellt Zellen dar, die in
die ECM eingebettet sind. Die angemerkten Eigenschaften der ECM beeinflussen das
Verhalten der Zellen.
Abbildung 1-2: Schematische Darstellung der Umgebung einer Zelle: Die mechanischen
Eigenschaften der ECM werden von Collagen-Fasern (Vernetzungsgrad,
Porengröße, Faserstärke) und von Proteoglykanen (PG) (Wassergehalt,
Proteinbindung) bestimmt [8]
Zur Erzeugung von Mikroumgebungen, die eine dreidimensionale Zellkultivierung
ermöglichen, werden in der Literatur verschiedene Ansätze verfolgt. [9] Diese
berücksichtigen primär das Strukturdesign, wobei je nach Anwendungen der Substrate im
3

Einleitung
klinischen Bereich oder in vitro unterschiedliche Schwerpunkte gesetzt werden. Im klinischen
Bereich werden funktionale Implantate benötigt, die neben der geeigneten Form und
Ausgestaltung idealerweise bioabbaubar sind und problemlos im Körper metabolisiert
werden können. [10] Die Anwendungen in vitro zielen auf ein verbessertes Verständnis der
Gewebephysiologie und Pathophysiologie. Dabei steht die genaue Kontrolle der 3D-
Organisation im Vordergrund, um die verschiedenen Funktionen des körpereigenen
Gewebes korrekt nachzuahmen. [8]
In natürlichen Systemen werden dreidimensionale Eigenschaften häufig durch das
Zusammenspiel auf multi-skaligen Ebenen erzeugt. [11] Ein gutes Beispiel stellt der Knochen
dar, in dem Hydroxyapatite (nano-skalig) mit den mikroskopisch großen Lamellen
wechselwirken. Allgemein ist die makroskopische Ausprägung wie Größe und Form wichtig
für spätere Implantate; das Mikrostrukturdesgin gibt die Gerüststruktur vor und entscheidet
damit über Parameter wie Porosität und mechanische Eigenschaften. Eine zusätzliche
nanoskopische Gestaltung solcher dreidimensionalen Gerüststrukturen birgt das Potenzial,
molekulare Erkennungs- und zelluläre Regulationsprozesse weitreichend steuern zu können.
Um die universellen Eigenschaften der Extrazellulärmatrix nachzuahmen, werden viele
neuartige Biomaterialien entwickelt, die sich grundsätzlich in vier verschieden Gruppen
aufteilen lassen: Polymere und Verbundwerkstoffe sowie auch Metalle und Keramiken. [12]
Den Polymeren - synthetischer oder natürlicher Herkunft kommt dabei durch ihre Flexibilität
die größte Bedeutung zu. Entscheidend für die Anwendung sind dabei die Biokompatibilität,
Benetzbarkeit, Transparenz, Bioabbaubarkeit und mechanischen Eigenschaften der
Materialien, sowie die Steifigkeit, Ladung, Polarität und Chemie der mit Zellen in Kontakt
tretenden Oberflächen.
Die Einbettung von Zellen in ein dreidimensionales Gerüst gelingt entweder durch die
Besiedelung poröser Strukturen wie Fasern [13] oder Schwämmen [14] oder durch das
Einbetten der Zellen in gelartige Strukturen [15]. Während die erstgenannte Methode ein
überaus gutes Oberflächen-Volumen-Verhältnis aufweist, so stellt die häufig ungeordnete
Architektur und die unkontrollierbare Porenverteilung und -größe in der Herstellung ein
Problem bei der Reproduzierbarkeit von Ergebnissen dar. Bei der Verwendung von Gelen ist
die Strukturbildung ähnlich problembehaftet. Ein entscheidender Vorteil ist jedoch, dass die
Zelle von ihrer Umgebung komplett umschlossen wird und dennoch von allen Seiten durch
Signale erreicht werden kann.
1.2.3 Gelartige Gerüststrukturen
Gelartige Biomaterialien, auch Hydrogele genannt, sind Polymere mit netzartiger Struktur,
die durch physikalische Einflüsse (Temperatur-, pH-Wert-Änderung) oder chemische
Verknüpfung (kovalente Bindung mittels Crosslinker, Photopolymerisationsprozesse) aus
löslichen Komponenten gebildet werden. Diese dreidimensionalen Gerüststrukturen weisen
eine außergewöhnliche Benetzbarkeit auf, sind zudem häufig vollständig transparent und
können durch einfache Konzentrationsänderung der Monomere oder Quervernetzer in ihrer
Steifigkeit oder Topography verändert werden. Die mechanischen Eigenschaften eines
4

Einleitung
Hydrogels werden zudem vom Quellverhalten beeinflusst, welches durch
hydrophile/hydrophobe Bereiche im Polymer bestimmt wird. Häufig verläuft der
Gelierungsprozess unter milden Bedingungen und sogar in situ, sodass Zellen,
Wachstumsfaktoren oder andere bioaktive Produkte direkt im Polymer eingeschlossen
werden können. Die Wechselwirkung von Zellen mit einem Gel kann Auswirkungen auf die
Zelladhäsion, -wanderung und -differenzierung haben. Lässt sich eine gelartige
Mikroumgebung durch kontrollierte Bioabbaubarkeit schließlich vom Zellverband wieder
lösen, so bieten sich Anwendungen auf dem Gebiet der Implantat-Medizin an. [16-18]
Derzeit werden sowohl natürliche Hydrogele aus Collagen [19], Fibrin [20] oder Alginsäure
[21] als auch synthetische Hydrogele aus Polyacrylsäurederivaten [22], Polyethylenglykol
(PEG) [23] oder Peptiden [24] als 3D in vitro Modell-Systeme angewendet. Die natürlichen
Polymere zeichnen sich durch unbestreitbare Biokompatibiltät und milde
Gelierungsbedingungen aus. Oftmals treten jedoch Probleme durch biogene
Verunreinigungen auf, die beim Gewinnungsprozess der Polymere nicht entfernt werden und
so später unkontrollierbare Effekte auf Zellen haben. Synthetische Polymere sind zwar
häufig einfacher zu kontrollieren, harsche Polymerisationsbedingungen oder mangelnde
Biokompatibilität behindern jedoch den Einsatz in der Zellkultur.
1.2.4 Zellattraktion in Hydrogelen
Hydrogele sind aufgrund ihrer Zusammensetzung stark hydrophil. Die Adsorption von
Proteinen der Extrazellulärmatrix, wie den Glykoproteinen Laminin, Fibronektin oder
Vitronektin, im Gel oder auf der Geloberfläche kann durch Entropie gesteuerte Prozesse
äußerst gering sein. Zu diesen Prozessen zählt unter anderem der hydrophobe Effekt.
Dieser beschreibt die Tatsache, dass unpolare Moleküle im polaren Medium aggregieren,
um eine möglichst kleine Kontaktoberfläche einzunehmen. In wässriger (= hydrophiler)
Umgebung kommt es zur Aggregation unpolarer Seitenketten im Inneren eines Proteins.
Dies ist entropisch betrachtet günstiger, da die Wassermoleküle ansonsten um die
hydrophoben Gruppen eine käfigartige Struktur bilden würden. Die Hydrophobizität einer
Seitenkette gibt Auskunft über ihre hydrophile bzw. hydrophobe Tendenz. [25] Generall lässt
sich sagen, dass mit steigender Hydrophilie einer Oberfläche die Proteinaffinität zu dieser
abnimmt. Eine allgemeingültige Regel bzw. exakte Korrelation zwischen Hydrophobiemax
und Ausmaß der Proteinadsorption ist jedoch nicht möglich.
Viele Zellen benötigen allerdings die ECM-Moleküle als Adhäsionspunkte zur Besiedelung
der Gelstrukturen, um mittels ihrer Integrin-Rezeptoren auf der Zellmembran mechanisch an
das Substrat zu koppeln. Schematisch ist die Integrin-vermittelte Adhäsion in Abbildung 1-3
dargestellt. Häufig wird die Anheftung, Wanderung und Vermehrung von Zellen in einem Gel
begünstigt, wenn Proteine oder Peptide, die über Adhäsionsdomänen verfügen, kovalent
immobilisiert sind. [9]
5

Einleitung
nicht-adhärente Zelle
(Zellsuspension)
Integrin-vermittelte
Zelladhäsion
Extrazellulärmatrix
biofunktionalisierte Oberfläche
natürliche Wachstumsfaktoren, Adhäsionspeptide
Integrin
immobilisierte, nicht-natürliche Adhäsionsfaktoren
Abbildung 1-3: Wachstumsfaktoren oder Adhäsionspeptide begünstigen Integrin-vermittelte
Zelladhäsion
Beispielsweise werden natürliche Proteine wie Fibronektin, Laminin oder Collagen als
Beschichtungen für Zellkulturgefäße verwendet. Sie sind universell einsetzbar und fördern
stets die Zellattraktion. Dennoch ist die Exposition ihrer funktionellen Untereinheiten nicht
unbedingt gewährleistet, wenn das Protein auf einer künstlichen Oberfläche physisorbiert
und dadurch möglicherweise sogar denaturiert. Die Proteine müssen zudem hochrein
gewonnen werden, um unerwünschte Nebenwirkungen auszuschließen. Durch die
statistische Orientierung der Proteine auf oder in einem Gel stehen möglicherweise nur
wenige Bereiche der Integrin-Bindung zur Verfügung. Wie im Fall der Oberflächenanheftung
können Wechselwirkungen der Proteinseitenketten mit dem Hydrogel die
Proteindenaturierung zur Folge haben. [26]
Auch die Verwendung synthetischer Adhäsionsvermittler findet breite Anwendung im Bereich
der Biofunktionalisierung von Oberflächen. Beispielsweise werden Polykationen wie Poly-
Lysin oder Poly-Ornithin zur Beschichtung von Polystyrol-Petrischalen verwendet. (Die
beiden Poly-Peptide unterscheiden sich einzig in der Anzahl der Kohlenstoffatome je
Monomeruntereinheit.) Dadurch können viele Zelltypen besser an der Oberfläche anheften
und sind weniger auf das Vorhandensein von Serumproteinen angewiesen. [27, 28] Ebenso
gelingt die Steuerung der Zelladhäsion durch die Verwendung von Poly-Ethylenimin, das
einen basischen Molekülcharakter aufweist. [29, 30]
Die Immobilisierung spezifischer integrinbindender Peptide verspricht eine elegante Strategie
zur Funktionalisierung. Kleine Peptide sind stabiler gegenüber äußeren Einflüssen wie pH-
Wert oder Sterilisationsbedingungen, können präzise und in hoher Dichte im Hydrogel
verankert werden und weisen hohe Zell-Spezifität auf. Die einfachere und kostengünstigere
Herstellung sowie ihre Beständigkeit gegenüber enzymatischen Abbauprozessen machen
Peptide zum idealen Zellerkennungsmotiv. RGD ist die am besten untersuchte und am
häufigsten angewendete Sequenz zur Vermittlung der Zelladhäsion auf Polymeren. [31]
6

Einleitung
Auch die Einlagerung von Wachstumsfaktoren wie Zytokinen und Angionese-Faktoren zur
Beeinflussung der Signalübertragung und Zelldifferenzierung ist eine Möglichkeit, die
Zellattraktivität zu steuern. [10] Die Freisetzung solcher Wachstumsfaktoren aus einem
Hydrogel spielt vor allem in der therapeutischen Anwendung eine große Rolle. Zur Neo-
Vaskularisierung kann VEGF (vascular endothelial growth factor) aus PGA (Polyglycolid)
freigesetzt werden, zur Knochenregeneration werden TGF (transforming growth factor) in
PLGA-PEG (Polylactid-co-glycolid-Polyethylenglycol) eingesetzt und zur Wundheilung nutzt
man die Freisetzung von FGF (fibroblast growth factor) aus Zellulose-Gelen. [32]
Grundsätzlich muss zwischen der Einbettung von Proteinen in einem Hydrogel und der
Immobilisierung von Peptiden auf einem Hydrogel unterschieden werden. Während die
relativ großen Proteine im Netz des Hydrogels recht unkompliziert eingebettet werden
können, müssen die verhältnismäßig kleinen Peptide kovalent an das Polymer angebunden
werden, um nicht durch das Hydrogel-Netzwerk zu rutschen. Beide Möglichkeiten sind für
unterschiedliche Fragestellungen denkbar. Problematisch kann bei der Einbettung der
Proteine ein unerwünschtes Ausdiffundieren sein, ist aber gerade diese Freisetzung
erwünscht, so muss bei kovalent gebundenen Peptiden die enzymatische Freisetzung aus
dem Hydrogel gewährleistet sein.
1.2.5 Hydrogele auf Basis der Hyaluronsäure
Zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Oberfläche-Extrazellulärmatrix-Zelle
bietet sich als natürlich vorkommendes Polysaccharid die Hyaluronsäure (kurz: Hyal) an, die
auch Hyaluronan genannt wird. Sie gehört zur Gruppe der Glykosaminoglykane, ist einer der
Hauptbestandteile der ECM und wird ständig im Körper metabolisch entfernt und erneuert.
Aufgrund ihrer physikochemischen Eigenschaften [33] wie Viskoelastizität, Transparenz und
ihrer hohen Wasseraufnahmekapazität eignet sich die Hyaluronsäure hervorragend als so
genanntes biokompatibles Material zur Herstellung neuartiger, bioartifizieller
Gewebestrukturen. In den Abbildungen 1-4 sind das trockene Hyal-Pulver und die
hochviskose Hyal-Lösung nach Wasseraufnahme abgebildet.
(a)
(b)
Abbildungen 1-4: Hyaluronsäure als trockenes weißes Pulver (a) (Wuhan Yuancheng
Chemical Ltd) bildet in Wasser eine hochviskose Lösung (b) (Fidia Advanced
Biopolymers Srl)
7

Einleitung
Die Entwicklung zellattraktiver Oberflächen auf Basis der Hyaluronsäure bedingt die
Auseinandersetzung mit den verschiedenen Faktoren, die die Anlagerung von Zellen zu
einem Zellverband beeinflussen. Zu den am besten untersuchten Funktionen, die durch den
zellulären Hylauronsäure-Rezeptor CD44 reguliert werden, zählen: [34]
• die Fortbewegungssteuerung von Zellen auf Hyaluronan-reicher ECM
• die Beibehaltung einer Hyaluronan-reichen Matrix auf der Zelloberfläche
• die Endozytose von Hyaluronan und daran gebundenen Molekülen
• die Signaltransduktion auch im Zusammenhang mit apoptotischen Prozessen.
Wird der CD44 Rezeptor beispielsweise verstärkt aktiviert, so wird die
Überlebenswahrscheinlichkeit von Zellen zusätzlich gesteigert und eine über Medikament-
Freisetzung herbeigeführte Apoptose verhindert. [35]
Modifikationen der Hyaluronsäure können einerseits der Vernetzung der Einzelstränge
dienen, andererseits der Anbindung von Zell-Erkennungsmerkmalen. Werden die Hyal-
Stränge miteinander quervernetzt, so bilden sich mechanisch robustere Polymere, die
wasserunlöslich sind, aber dennoch über interessante Eigenschaften in Wasser verfügen.
Beispielsweise liegt die pH-abhängige Wasseraufnahmekapazität 1 von Hyal-Hydrogelen, die
mittels Diaminopropan vernetzt wurden, im Bereich von 6750±300 % bei physiologischem
pH. [36] Andere Publikationen berichten über den Quellungsgrad 2 eines methacrylierten
Hyal-Hydrogels der abhängig vom Vernetzungsgrad Werte über 50 erreichen kann. [37]
Miteinander verknüpfte Hyaluronan-Stränge bzw. Hyal-Netze sind gegen den Angriff von
Hyaluronidasen besser geschützt, und werden weniger rasch in vivo abgebaut als das
natürliche Polymer. [38] Eine Steigerung der Elastizität eines Hyal-Hydrogels kann durch
Sulfatisierung des Grundgerüsts mit anschließender Gelbildung erzielt werden. [39] Die
Verknüpfung von Hyaluronsäure-Derivaten mit anderen Polymeren, wie beispielsweise
Polyethylenglykol, kann ebenfalls erfolgreich zur biokompatiblen Hydrogel-Bildung genutzt
werden. [40]
Gerade die Verwendung gel-artiger Hyaluronan-Derivate als biokompatible, bioabbaubare
Gewebe stellt jedoch eine Synthese-Herausforderung dar. Beispielsweise wird durch den
stark hydrophilen und polyanionischen Charakter die Anlagerung von Zellen auf vernetzten
Hyaluronsäurefilmen stark gehindert, sodass weitere Modifikationen notwendig sind. [41] In
der Literatur finden sich interessante Möglichkeiten, die eine Zelladhäsion auf dem
vermeintlich abweisenden und dennoch stark ECM-ähnlichen Substrat beschreiben. Die
Hyaluronsäure bildet dabei ein Spacergerüst, in das RGD-Einheiten eingebunden sind, die
an Integrine binden und damit der Zelladhäsion dienen.
1 Wasseraufnahmekapazität = (Masse gequollen - Masse trocken ) / Masse trocken · 100
2 Quellungsgrad = Masse gequollen / Masse trocken
8

Einleitung
Aus biologischer Sicht ist vor allem die Wechselwirkung modifizierter Hyaluronsäure mit den
Zelloberflächenrezeptoren CD-44, RHAMM und ICAM-1 interessant. Natürliche
Hyaluronsäure bindet über diese Rezeptoren an Zellen und beeinflusst deren Beweglichkeit
und Adhäsion sowie die dauerhafte körpereigene Hyaluronsäure-Produktion. [34, 42]
1.3 Zielsetzung
Zellkultursubstrate für in vitro Anwendungen werden heute noch überwiegend nach einem
einfachst möglichen Design hergestellt. Dieses berücksichtigt oft hauptsächlich die
unkomplizierte Herstellung, Sterilisation und Anwendung. Das Ziel dieser Arbeit war daher,
bestehende, aus Kunststoff gefertigte Zellkultursubstrate durch die Anpassung der
Grenzfläche so weit zu verändern, dass neben den bestehenden Anwendungsaspekten eine
in vivo ähnlichere Umgebung für Zellen geschaffen wird. Wie bereits in den einleitenden
Kapiteln 1.2 erwähnt spielen dabei die inerte Hyaluronsäure als auch eine Reihe Zell- bzw.
Integrin-akttraktiver Komponenten eine Rolle. Ein komplettes Nachbilden aller dieser ECM-
Komponenten ist nahezu unmöglich und aufgrund störender Effekte (Chargenvariabilität,
Sterilität, Verunreinigungen) für die Anwendung nicht praktikabel.
Bei der Entwicklung funktioneller Biomaterialien sind generelle Fragestellungen nach der
Biokompatibilität, der Prozessierbarkeit und den Anwendungsbereichen zu beantworten. Für
die Hyaluronsäure wurden bereits zahlreiche Untersuchungen bezüglich der Biokompatibiltät
durchgeführt. [38, 39, 43, 44] Als einer der Hauptbestandteile der ECM wurden Hyal-Derivate
bereits als Pharmakotherapeutikum [45, 46], als Zellgerüstmaterialien [47, 48] und als
funktionelle Beschichtungen [49] genutzt. Ausgehend von reiner Hyaluronsäure als einzigem
natürlichem Baustein der ECM in Kombination mit vollsynthetischen Peptiden oder
natürlichen Proteinen sollten Substrate entwickelt werden, die der Nutzung in der Zellkultur
dienen.
Der erste Schritt zum Ziel war zunächst die Herstellung verschiedener Hyal-Derivate, wie sie
in Kapitel 2.2 vorgestellt werden. Im nächsten Schritt wurden die Prozesse zur Vernetzung
(Kapitel 2.3) und Immobilisierung (Kapitel 2.4) der Hyal-Derivate zur Beschichtung von
Trägersubstraten oder als eigenständiges dreidimensionales Gel etabliert. Dabei sollte die
Möglichkeit der Strukturierung von Hyal-Beschichtungen auf Zellkultursubstraten mittels
Photolithographie erprobt werden. Zudem sollte der Einsatz von Hyaluronsäure bei dem in
Kapitel 2.8 vorgestellten „Substrate Modification and Replication by Thermoforming“
(SMART) -Verfahren untersucht und angepasst werden. Die Beschichtung thermoformbarer
biokompatibler Folien mit Hyal-Derivaten und zellattraktiven Komponenten stellt eine neue
Anwendung im Bereich des Tissue Engineering dar.
Zur Herstellung zellattraktiver Hyaluronsäure Beschichtungen bzw. Hydrogele bietet sich die
Anbindung bzw. Einbettung synthetischer (Poly-)Peptide oder natürlicher zellattraktiver
Komponenten an, wie sie in den Kapiteln 2.5 vorgestellt werden. Neben der Synthese
integrinbindender Peptide, die über eine geeignete Funktionalität zur kovalenten Anbindung
auf bzw. in pclHyal verfügen (siehe Kapitel 2.6), waren ebenso Protokolle zur Steuerung der
Zelladhäsion mittels Einbettung (natürlicher) Adhäsionsfaktoren zu ermitteln (siehe Kapitel
9

Einleitung
2.7). Ziel war es, Möglichkeiten der (lokalen) Anbindung biofunktionaler Substanzen auf bzw.
in pclHyal zu untersuchen. Dabei empfahl es sich, vor der Biofunktionalisierung von
Polymeroberflächen Beschichtungsversuche und deren Einfluss auf Zellen an einfach zu
untersuchenden Glasoberflächen durchzuführen, um direkte Aussagen über erfolgreiche
Modifizierungen treffen zu können. Dadurch konnten Probleme in der Prozessentwicklung
auf Polymeroberflächen schneller erkannt und angepasst werden.
Die so gebildeten pclHyal-Substrate sollten auf ihre Anwendbarkeit und Biofunktionalität in
vitro getestet werden. Zudem sollte untersucht werden, in wie weit die Immobilisierung von
Hyal und zellattraktiven Faktoren auf flachen Substraten und in dreidimensionalen Kavitäten
zur Steuerung der Zelladhäsion genutzt werden kann.
Zur Charakterisierung der hergestellten Hyal-Derivate, zur Validierung der Immobilisierung
auf verschiedenen Substraten und zur Kontrolle erzeugter Strukturen aus Hyal-Hydrogelen
bieten sich unterschiedliche spektroskopische und mikroskopische Verfahren an, wie sie in
den Kapiteln 2.9 erläutert werden. Insbesondere kooperativer Effekte synthetischer Peptide
auf bzw. in Hydrogelen sollten durch geeignete Methoden, beispielsweise durch die
Bestimmung des Zetapotenzials, untersucht werden.
10

Grundlagen
2 Grundlagen
2.1 Chemie und Biologie der Hyaluronsäure
Die Substanz, die 1934 erstmals von Karl Meyer und John Palmer [50] aus dem Glasköper
des Auges isoliert wurde, bekam den Namen Hyaluronsäure, nach neuerer Nomenklatur
auch Hyaluronan genannt, der die Herkunft (hyaloid = glasig) und einen Teil der
Zusammensetzung (Uronsäure) verbindet.
Heute zählt man die Hyaluronsäure (siehe Abbildung 2-1) zur Familie der
Glykosaminoglykan-Polymere. Ihre makromolekulare Kettenstruktur wird von Disaccharid-
Einheiten gebildet, die alternierend aus β-1,3 D-N-Acetylglucosamin und β-1,4 D-
Glucuronsäure bestehen.
Abbildung 2-1: Amphiphatischer Charakter der Hyaluronsäure (blau: hydrophil, rot:
hydrophob) [51]
Die linear aneinander gereihten Polymeruntereinheiten sind β-1,4 glycosidisch miteinander
verknüpft und eine einzelne natürliche Hyaluronsäurekette kann zwischen 200 und 20000
Untereinheiten lang sein; demnach variiert das Molekulargewicht zwischen 200 und
10000 kDa. Das Molekulargewicht einer Disaccharid-Untereinheit beträgt: MW (NaHyal)
401,29 g mol -1 . Nachdem die Molekülstruktur erst 1954 vollständig durch Weissmann und
Meyer [52] aufgeklärt wurde, begann man, die Hyaluronsäure genauer zu untersuchen.
Die außergewöhnlichen hydrodynamischen und rheologischen Eigenschaften der
amphiphilen Hyaluronsäure werden durch die Struktur des Polymers bestimmt: Die
überwiegend in Sesselform vorliegenden Saccharide und der polyanionische Charakter des
Moleküls bilden ein unverzweigtes Grundgerüst, das durch intramolekulare
Wasserstoffbrücken flexibel und dynamisch reagieren kann. [53] Wie in Abbildung 2-1 farbig
hinterlegt dargestellt, bilden die axialen Wasserstoffatome eine unpolare hydrophobe Schicht
während die äquatorialen Seitenketten eine polare hydrophile Schicht bilden. Dadurch
variiert die tatsächliche Struktur von Hyaluronsäure in Lösung, wird aber generell als
geordnetes Knäuel einer Doppelhelix mit beträchtlicher intrinsischer Steifigkeit beschrieben.
[54] In vitro beeinflußt hauptsächlich die umgebende Ionenstärke die physikalischen
Eigenschaften der Hyaluronsäure. [55] Hyal ergibt mit Wasser eine viskoelastische Lösung,
wobei jedes einzelne Hyaluronsäuremolekül so stark hydratisiert vorliegt, dass bereits gering
konzentrierte Lösungen hochviskos sind: 10 mg/mL haben bereits eine 5000fach höhere
11

Grundlagen
Viskosität als Wasser; 3-5 mg/mL hochmolekularer Hyal in physiologischer Lösung
beanspruchen das gesamte Lösungsmittel. [56]
Die Konzentration an Hyaluronsäure im menschlichen Körper variiert stark zwischen 4 g/kg
in der Nabelschnur, 2-4 g/L in der Gelenkflüssigkeit, 0,2 g/kg in der Haut, 10 mg/mL in der
Brustlymphe und 0,1-0,01 mg/mL im normalen Serum. Der Gesamtgehalt an Hyal im Körper
eines 70 kg schweren Menschen beträgt etwa 15 g, wobei sich der meiste Anteil in der Haut
und den Geweben des Bewegungsapparates befinden. Insgesamt wird etwa ein Drittel der
Gesamtmenge der im Körper verfügbaren Hyal täglich umgesetzt. [57]
Im gesamten Körper wird hochmolekulare Hyaluronsäure ständig von Fibroblasten,
Keratinozyten, Chondrozyten und anderen speziellen Zellen in der ECM produziert und
freigesetzt. Dies geschieht in der Plasmamembran durch die Addition von Zuckern an das
reduzierende Ende der Polymerkette, wobei das nicht-reduzierende Ende aus der Zelle
hinaus ragt, wie in Abbildung 2-2 schematisch dargestellt. [58] Die Syntheserate wird dabei
durch die Zelldichte [59], die mechanische Ausdehnung und durch Wachstumsfaktoren [60]
beeinflusst. Zusammen mit anderen Makromolekülen bestimmen hochmolekulare
Hyaluronsäurestränge die mechanischen Eigenschaften der Extrazellulärmatrix. Die
langkettigen Hyaluronsäurestränge sind das Füllmaterial im Gewebe und sorgen für eine
ausreichende Wasseraufnahme. Sie verhindern Angiogenese [61], wirken
entzündungshemmend und unterdrücken die Immunabwehr [62].
Abbildung 2-2: Die Biosynthese von Hyaluronsäure ist eine kationisch (M ++ ) katalysierte
Enzym-Reaktion. Die Membran-gebundene Hyaluronansynthase (HAS)
verknüpft die Uridinphosphat-(UDP)-gebundenen Hyal-Komponenten zu
Hyaluronan, das von der Zelle sezerniert wird [56]
Normalerweise wird der Großteil der Hyaluronsäure innerhalb weniger Tage vollständig
verstoffwechselt. Der Abbau der Hyaluronsäure in der ECM ist abhängig vom umgebenden
Gewebe. Im Knochen oder Knorpel wird Hyal zusammen mit anderen ECM Molekülen in situ
abgebaut, in der Haut und den Gelenken geschieht dies in zwei Schritten. Große
Hyaluronan-Moleküle (10000 kDa) werden zunächst in Fragmente zu 1000 kDa zerteilt.
Schließlich wird Hyal von der Matrix abgelöst, in den Lymphgefäßen aufgenommen und zur
12

Grundlagen
Hydrolyse in die Leber transportiert. [63] Insgesamt sind sechs Hyaluronidase-ähnliche Gene
bekannt, die zum Hyal-Abbau beitragen. [64] Interessanterweise reagieren einige Zellen
speziell auf kleine Hyal-Fragmente. So werden beispielsweise die Angionese angeregt und
Makrophagen aktiviert. Hyaluronan-Fragmente mit einem Molekulargewicht zwischen 6-
20 kDa aktivieren dendritische Zellen, die Antigen-tragenden Zellen des Immunsystems. [65]
Vor allem bei Wundheilungsprozessen spielt die natürliche Hyaluronsäure eine wichtige
Rolle. Durch Wechselwirkung der Hyaluronsäure mit den zellulären Hyal-Rezeptoren werden
Zytokine und second-messenger-Systeme aktiviert, welche die Produktion von
Wachstumsfaktoren in entzündungshemmenden Zellen (Leukozyten) anregen und die
Wanderung und Anheftung der Zellen an entzündetes Gewebe unterstützt. Zudem wird die
Phagozytose unterstützt und die Verbreitung pathogener Substanzen verhindert. [42]
Studien über den Einfluss von Hyaluronsäure während des unkontrollierten Zellwachstums in
der Krebsentstehung zeigen, dass die Wechselwirkung von Hyaluronsäure mit den
Rezeptoren der Tumorzellen die Signalkaskaden im Tumorgewebe beeinflussen. Dies führt
zur Anreicherung von Hyaluronsäure im Gewebe, was zunächst nicht unbedingt die
Entstehung eines Tumors bewirkt, aber dennoch eine Umgebung schafft, in der das
Überleben von Tumorzellen und ihre internen Funktionsabläufe unterstützt werden. Die
Hyaluronsäure kann demnach als Transporter für Anti-Tumor-Präparate bei einer Krebs-
Therapie dienen. [66]
2.2 Chemische Modifikationen der Hyaluronsäure
Die Hyaluronsäure besitzt wichtige funktionelle Gruppen, die eine chemische Modifikation
ermöglichen. Einerseits kann die Carboxylgruppe verestert werden oder mit Hilfe
verschiedener Kopplungsreagenzien aktiviert werden, sodass ein nucleophiler Angriff
erfolgen kann. Andererseits sind zahlreiche Modifikationen der Hydroxylgruppe wie die
Sulfatierung, die Veresterung oder die Veretherung möglich (siehe Abbildung 2-3). In der
Literatur werden zahlreiche Hyaluronan-Derivate zur Verwendung als Biomaterialien
vorgestellt. [67, 68] Die folgenden Kapitel 2.2.1 und 2.2.2 beschreiben einige der üblichen
chemischen Modifikationen der Hyaluronsäure. Zudem gibt es weitere Modifizierungen, die
hier allerdings nicht näher erläutert werden, da sie aufgrund scharfer Reaktionsbedingungen
häufig zur Beeinträchtigung der Biokompatibilität führen oder den Zerfall des Hyal-Moleküls
mit sich bringen.
13

Grundlagen
Kapitel 2.2.1
- Veresterung
- Carbodiimid vermittelte
Kopplungsreaktionen
Kapitel 2.2.2
- Sulfatierung
- Esterifizierung
- Etherifizierung
Modifizierung der
Hyal Carboxylgruppe
Modifizierung der
Hyal Hydroxylgruppe
*
O OH OH
HO
O O
O
O
HO OH NH
O
*
n
Abbildung 2-3: Chemische Modifikationen der Hyaluronsäure
2.2.1 Modifizierungen der HA Carboxylgruppe
Durch Veresterungen der Hyaluronsäure werden Polymere gewonnen, deren
Wasserlöslichkeit vom Vernetzungsgrad abhängt, wodurch sich unterschiedliche
Anwendungsmöglichkeiten ergeben
Eine Veresterung der Hyaluronsäure liefert je nach Veresterungsgrad wasserlösliche
Polymere bis hin zu wasserunlöslichen Hydrogelen. Die bekanntesten, auf ihre
Biokompatibilität hinreichend untersuchten Hyaluronan-Ester-Derivate sind unter dem
Handelsnamen HYAFF®11 (Benzylester-Derivat) und HYAFF®7 (Ethylester-Derivat)
erhältlich. [69, 47]. Die beiden Derivate sind unterschiedlich stark hydratisierbar, was
teilweise einen indirekten Einfluß auf die Zelladhäsion hat. Strukturierte Membranen und
Schwämme aus HYAFF®11 sind geeignete Substrate für verschiedenste Zelltypen, während
HYAFF®7 für die antiadhäsive Beschichtung chriurgischer Instrumente genutzt wird. Die
Veresterung der Hyaluronsäure gelingt in zwei Schritten. Zunächst wird das quaternäre
Ammoniumsalz der Hyaluronsäure gebildet, welches im nächsten Reaktionsschritt mit einem
esterbildenden Reagenz in aprotischen Lösungsmitteln und unter kontrollierter Temperatur
umgesetzt wird. Hyaluronsäureester sind in organischen Lösungsmitteln löslich und
hydrolysieren spontan in wässriger Umgebung.
Eine weitere interessante Anwendung wurde von Luo et al. beschrieben, die nach Anbindung
eines Fluoreszenzmarkers (= BODIPY) an NHS-veresterte Hyaluronsäure (50 mol % bzw.
80 mol %, abhängig von der Reaktionszeit) zunächst die Anlagerung von BODIPY-Hyal an
der Zellmembran von humanen Eierstockkrebszellen (SK OV-3) beobachten konnten. Die
zeitabhängige Endozytose und Ansammlung des Fluoreszenzfarbstoffes im Zytoplasma
wurden dann mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie analysiert. [46]
14

Grundlagen
Carbodiimid vermittelte Reaktionen liefern häufig Hyal-Konjugate, die kovalent einen
Wirkstoff gebunden haben und daher für die kontrollierte Freisetzung in vivo
interessant sind
Die Aktivierung der Carboxylgruppen an Glykosaminoglykanen gelingt durch die
Verwendung von Carbodiimiden. In Anwesenheit eines geeigneten Nucleophils,
üblicherweise ein primäres Amin, das als Nucleophil fungiert, entsteht durch den Additions-
Eliminierungs-Mechanismus eine neue Verbindung. [70] Die so gebildeten Derivate sind
hauptsächlich Hyal-Wirkstoff-Biokonjugate, die häufig in der Krebstherapie angewandt
werden. [71]
Von Vorteil ist die Wasserlöslichkeit vieler Carbodiimid-Verbindungen, sodass ihr Einsatz
auch zur Kopplung biologischer Substanzen verwendet werden kann, ohne dass organische
Lösungsmittel verwendet werden müssen. Nachteilig wirkt sich bei dieser Reaktion jedoch
die saure Umgebung aus, in der primäre Amine protoniert werden und somit ihre
Nucleophilie verlieren. Eine Verbesserung der Reaktionsausbeute gelingt über die
Stabilisierung der reaktiven Zwischenstufe über einen zweistufigen Mechanismus.
Ein großer Fortschritt in der Chemie zur Modifikation der Hyaluronsäure war die Erkenntnis,
dass Hydrazide ihren nucleophilen Charakter bei pH 4-6 beibehalten und somit effizient an
den Carbodiimid-aktivierten Glucuronsäure-Rest der Hyaluronsäure binden können.
Zahlreiche mono- und polyfunktionalisierte Hydrazide wurden seitdem zur Modifizierung der
Hyal genutzt. [72] Ein interessantes Anwendungsbeispiel stellt die Anbindung von
Hydrocortison an Hyaluronsäure dar. Es entsteht ein Hydrogel, in dem das Hydrocortison
angebunden ist und enzymatisch auch wieder davon abgetrennt werden kann. [38] Ein
solches System ist besonders für die gezielte, langsame und kontrollierte Freisetzung eines
Wirkstoffes geeignet. Abbildung 2-4 zeigt schematisch die Schritte zum vernetzten Hyal-
Hydrocortison-Produkt.
15

Grundlagen
Abbildung 2-4: Schrittweise Vernetzung und Anbindung von Hydrocortison an Hyaluronan
[38]
2.2.2 Modifizierungen der HA Hydroxylgruppe
Die Sulfatierung von Hyal dient der Bildung von Makromolekülen, die resistent gegen
den enzymatischen Abbau sind und für Oberflächenbeschichtungen genutzt werden
Durch Reaktion von Hyaluronan mit einem Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex in DMF lassen
sich hervorragend blutkompatible Oberflächenbeschichtung erzeugen, die sich durch gute
Zytokompatibilität auszeichnen und das Anheften von Zellen und Bakterien behindern Die
Anbindung von Sulfatgruppen an Hyaluronsäure machen das Makromolekül zudem resistent
gegen den Abbau durch Hyaluronidase oder Chondroitinase. [73-75]
16

Grundlagen
Bei der Esterifizierung werden Hyal-Derivate gebildet, die bei der Krebstherapie oder
der Augen-Chirurgie eingesetzt werden
Bekannt ist die Umsetzung von Hyaluronsäure mit Butansäure, die zu einem Hyal-Derivat
führt, das Zell-Differenzierung induziert und das Wachstum einer Reihe menschlicher
Tumore inhibiert. [45] Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung des Methacrylsäureanhydrids
zur Esterifizierung der Hyaluronsäure. Das entstehende Hydrogel-Produkt findet Anwendung
bei der Einbettung von Zellen und als Hornhaut-Ersatz in der Augen-Chirurgie. [76, 77]
Neuere Publikationen haben gezeigt, dass vor allem methacrylierte Hyal-Derivate ideal für
die Einkapselung von Stammzellen genutzt werden können. Dabei wird das Polymer
zusammen mit humanen embryonalen Stammzellen (hESC) gemischt und der
Gelierungsprozess über Radikalstarter bei Bestrahlung mit UV gestartet. So können die
Zellen in ihrem undifferenzierten Status kultiviert werden [78], und sogar Mikro-Bioreaktoren
können mit der Zell-Gel-Suspension befüllt werden [79].
Hyal-Derivate, die durch Etherifizierung erzeugt werden, finden breite Anwendung als
Füllstoffe zur Hautglättung
Die Umsetzung von Hyaluronsäure (2000 kDa) mit Methacrylsäureglycidylester ist bereits
erfolgreich durchgeführt worden. [37, 80] Anwendungen im Bereich des Tissue Engineering
konzentrieren sich derzeit auf den Beitrag vernetzter GMHyal-Derivate zur mechanischen
Unterstützung in Hydrogelen und deren Einfluß auf das Zellwachstum. [81]
Die unter den Handelsnamen Restylan®, Perlan® und Juvederm® erhältlichen Haut-
Füllstoffe werden aus der Vernetzung von Hyaluronan mit 1,4-Butandiolglycidylether
hergestellt. Durch die hohe Wasseraufnahmekapazität der in die Haut injizierten
Hyaluronsäure-Derivate werde Falten geglättet, zudem weisen die Ether-Verbindungen eine
hohen Lebensdauer von mehreren Monaten auf. [82]
2.3 Vernetzung von Hyaluronsäure-Derivaten
Zur Bildung eines Hyaluronsäurefilms oder -gels gibt es, wie teilweise bereits vorgestellt,
verschiedene Möglichkeiten. Einerseits kann dies in Lösung mit Hilfe chemischer Crosslinker
erfolgen, andererseits kann eine Vernetzung durch die Erzeugung von Radikalen in situ
hervorgerufen werden. Das chemische Crosslinking bietet zwar eine Vielzahl an
Möglichkeiten zur Vernetzung der Hyaluronsäurestränge untereinander, jedoch kann dabei
keine Strukturgebung erfolgen. Werden allerdings Radikale durch den Einsatz von UV-
Strahlung gebildet, so können unbestrahlte und bestrahlte Hyaluronsäurebereiche erzeugt
werden, die unterschiedliche Eigenschaften aufweisen. In den folgenden Kapiteln 2.3.1 bis
2.3.3 werden sowohl die chemischen als auch die photochemischen Crosslinking-Methoden
erläutert, die über kovalente Bindungen Hyaluronsäurestränge miteinander vernetzen.
Zusätzlich eröffnet die Möglichkeit zur ionischen Quervernetzung ein weiteres Feld zur
Biomaterialbildung aus Hyaluronsäure, auf das hier jedoch nicht näher eingegangen werden
17

Grundlagen
soll, da vor allem Polykationen zur Komplexierung mit dem polyanionischen Hyaluronan
genutzt werden. Es werden also stets zusätzliche Polymere zur Vernetzung verwendet und
nicht ausschließlich Hyaluronsäure. Beispiele finden sich in der Literatur zu Chitosan-[23,
83], Poly-L-Lysin-[84], Polypyrrol-[85, 86], und Alginat-[87] Hyaluronan-Derivaten.
Abbildung 2-5 zeigt die für ein Vernetzen von Hyal-Strängen im Rahmen der Arbeit
angewendeten Verfahren. Der Einfluss auf die Adhäsion von Zellen durch verschiedene
Substitutionen am Hyal-Polymer ist zu untersuchen.
pclAAHyal
Photocrosslinking
bei Anregung der Kapitel 2.3.2
Azido-Gruppe
AAHyal
pclVAHyal
Photocrosslinking
Kapitel 2.3.2 durch radikalische
Polymerisation
VAHyal
N 3
+
+
NH 2
Azidoanilin
NH 2
Vinylanilin
O OH OH
HO
O O
O
O
HO OH NH
O
Hyal
n
+ H2 N
N 3
O
3
Azidotrioxaundecanamin
+
NH 2
ATAHyal
Click-Hyal
Chemocrosslinking von
ATAHyal mit PAHyal durch
katalytische Cycloaddition
Kapitel 2.3.3
Propargylamin
PAHyal
Methacrylsäureglycidylester
Methacrylsäureanhydrid
O
O O
+
O
+
O
O
GMHyal
MAHyal
Photocrosslinking durch
radikalische Polymerisation
Kapitel 2.3.2
pclGMHyal
pclMAHyal
Abbildung 2-5: Crosslinking-Methoden für verschiedene Hyal-Derivate
18

Grundlagen
2.3.1 Chemisches Crosslinking
Die Gelbildung, also die Erzeugung vernetzter Hyaluronsäure kann über die
Kopplungsreaktion zwischen einer eingefügten Hyadrazido-Funktionalität und einem
sogenannten homobifunktionellen Crosslinker erfolgen. Als Crosslinker werden
beispielsweise Bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS 3 ), 3,3’-Dithiobis-(sulfosuccinimidyl)suberat
(DTSSP), Dimethylsuberimidat (DMS) oder Ethylenglycolbis-(sulfosuccinimidylsuccinat)
(sulfo-EGS) verwendet. [88] Ebenso erfolgreich gelingt die Hydrogelbildung durch Bildung
von Disulfidbrücken. [89] Dazu wurde Hyaluronan mit 3,3’-Dithiobis(propionhydrazid) (DTP)
umgesetzt, bei dem man ein Gemisch aus vernetzten Hyal-Strängen aufgrund der
Dihydrazid-Funktionalität sowie auch das unverzweigte Molekül erhält. In einer der jüngsten
Publikationen wird die Synthese von N,N’-Dibenzoyl-L-Cystein (DBC) mit Hyaluronan
beschrieben. Die so funktionalisierten Hyal-Stränge lagern sich durch π-π-Wechselwirkungen
nah beieinander an, sodass Disulfidbrücken durch einfache Oxidation des Cysteins an Luft
schließlich zur Hydrogelbildung führen. [90]
Die Verwendung von Glutaraldehyd zur Vernetzung Amin-funktionalisierter
Hyaluronsäurederivate (mit Lysin, Diaminopentan oder Glycin-Lysin) wurde ebenfalls
beschrieben, obwohl der Substitutionsgrad der Hyaluronsäure durch primäre Amine mit nur
6 % sehr gering ist. [91]
In alkalischem Milieu reagiert Divinylsulfon (DVS) mit den Hydroxylgruppen der
Hyaluronsäure. Es kommt zur Ausbildung von bis-Ethyl-sulfon-Brücken. [92] Derivate mit
unterschiedlichem Molekulargewicht finden unter Markennamen wie Hylan A und Hylan B
breite Anwendung in der Augenmedizin zur Verbesserung der Viskosität von Ersatzlösungen
für die Tränenflüssigkeit. Auch bei der Falten- und Narbenbehandlung werden Hyal-Derivate
angewendet, ebenso wie das unter dem Handelsnamen Synvisc erhältliche Hyal-Präparat
zur Injektion bei Arthrose im Kniegelenk. [93]
Eine interessante Quervernetzung der Hyaluronsäure ist die so genannte „Click-Reaktion“,
unter der man eine 1,3-dipolare Cycloaddition zwischen Aziden und terminalen Acetylenen
bei Raumtemperatur unter Verwendung von Kupfer als Katalysator versteht. Die Reaktion
verläuft hervorragend in wässrigen Systemen, ist verhältnismäßig pH-unabhängig und
selektiv selbst in Anwesenheit verschiedenster anderer funktioneller Gruppen. [94]
Der Gelierungsprozess gelingt zwar bereits durch katalytische Mengen von (häufig in situ
erzeugtem) Cu(I), bedingt aber die Verwendung von zelltoxisch wirkenden Kupfersalzen.
Dennoch war es möglich, bei Zellen (Saccharomices cerevisae) in einem derart in situ
erzeugten Gel nach 24 h Proliferation zu beobachtet. [95] Durch Komplexierung mit EDTA
und Herauswaschen des zur Reaktion genutzten zweiwertigen Cu 2+ konnte das zelltoxische
Salz entfernt werden.
Für die Verwendung der Click-Gele mit anderen Zellkulturen ist die Reduktion der
Katalysatormenge denkbar, um die Belastung durch Kupfer gering zu halten. Neuere
Veröffentlichungen beschrieben zudem eine kupferfreie Click-Chemie, die den Zugang zu
biokompatiblen Anwendungen ermöglicht. [96]
19

Grundlagen
2.3.2 Photochemisches Crosslinking
Um durch die Bestrahlung mit UV-Licht Polymere zu vernetzen, müssen photosensitive
Gruppen wie beispielsweise 4-Azidoanilin (AA) im Hyaluronsäuremolekül vorhanden sein.
[43, 97] Die Azidogruppen gehen bei Bestrahlung in einen angeregten Zustand über, es
bilden sich sowohl Singulett- als auch Triplett-Nitrenverbindungen. Diese können sowohl an
Doppelbindungen addieren, als auch radikalisch reagieren. Ebenfalls über eine Carbodiimid-
Reaktion verläuft die Anbindung von 4-Vinylanilin (VA), wobei 25 % der Carboxylgruppen der
Glucuronsäureuntereinheiten im Hyaluronan umgesetzt werden. [98] Im so gebildeten
StyrolHyal stehen Vinyl-Gruppen zur Verfügung, die über eine in situ herbeigeführte
radikalische Kettenpolymerisationsreaktion die einzelne Hyal-Stränge quervernetzen. Dabei
wird durch UV-Strahlung die homolytische Spaltung von so genannten Initiatormolekülen
bewirkt, wobei hochreaktive Primärradikale entstehen. Diese lagern sich im nächsten Schritt
an entsprechend modifizierte Hyaluronsäureketten oder Moleküle an, die eine reaktive C=C-
Doppelbindung tragen und das für die Kettenreaktion notwendige Kohlenstoff-Radikal wird
erzeugt. In den Abbildungen 2-6 sind zwei Hyal-Derivate nach Photocrosslinking und
Gefriertrocknung dargestellt.
(a)
(b)
Abbildungen 2-6: Exemplarische Gegenüberstellung der Feinstruktur unterschiedlich
photovernetzter, gefriergetrockneter Hyal-Derivate: (a) VAHyal [98] (b) GMHyal
[81]
Die Vernetzung von Hyaluronsäure-Derivaten, die mit Methacrylsäureglycidylester bzw.
Methacrylsäureanhydrid umgesetzt wurden, wie in Kapitel 2.2.2 beschrieben, verläuft
ebenfalls über eine radikalische Polymerisation. Die erfolgreiche Gel-Bildung wurde bereits
von mehreren Gruppen gezeigt und wird auch zur Besiedelung mit Zellen verwendet. [37, 76,
80, 81, 99]
Im Zusammenhang mit Hyaluronsäure bzw. zur Vernetzung von Peptiden in Hydrogelen
werden bisher als Photoinitiatoren N-Vinylpyrrolidon (Vp) [100] sowie 2,2-Dimethoxy-2-
phenylacetophenon (DMPA) [101], 2-Methyl-1-[4-(hydroxyethoxy)phenyl]-2-methyl-1-
propanon (Irgacure 2959, Ic) [76] und (1S)-7,7-Dimethyl-2,3-dioxobicyclo[2.2.1]heptan-1-
carbonsäure (CQ-COOH) [98] sowie Campherchinon [102] eingesetzt. Vor allem die
Verwendung der Photoinitiatoren Irgacure 2959 (Ic) und Vp scheint gegenüber der
Anwendung in Zellkulturen möglich. Leach et al. beschreiben keinen negativen Einfluss auf
die Vitalität von menschlichen Aorta Endothelzellen [37], Khademhosseini et al. nennen den
20

Grundlagen
vorsichtigen Einsatz der Photoinitiatoren, beschreiben jedoch eine Vitalität von 82 ± 5 % für
NIH-3T3 Fibroblasten. [99]
2.3.3 Bildung von 3D-Komplexen aus Hyal-Derivaten
Bei der Bildung von Hyaluronsäuregelen stehen unterschiedliche Anwendungsgebiete im
Fokus. Einerseits werden Hydogele erzeugt, um das Quellverhalten, die rheologischen
Eigenschaften oder die Bioabbaubarkeit [47] zu untersuchen, andererseits werden
implantierbare Hyal-Gele gebildet, die in vivo Aufschluß über Wundheilung [37] und
Bioverträglichkeit geben können. Ebenso ist die Bildung von Hyal-Hydrogelen zur Einbettung
von Zellen in situ Gegenstand aktueller Forschung. [90] Beispielsweise hat die Variation der
Porengröße (Abbildung 2-7 zeigt ein poröses Hyal-Gerüst) in Hydrogelen einen direkten
Einfluß auf die Wasseraufnahmekapazität. [36] Ebenso kann für unterschiedlich stark
substituierte Hyaluronsäurestränge der Einfluss auf den Vernetzungsgrad durch Änderung
der Viskosität beobachtet werden. [103]
Abbildung 2-7: REM-Aufnahme eines Hyal-RGD Hydrogel Gerüsts mit unterschiedlichen
Porengrößen [104]
2.4 Filmprozessierungsmethoden
2.4.1 Spin-Coating
Zur Aufbringung von Hyaluronsäurederivaten auf Oberflächen bietet sich das Aufschleudern
(= spin-coating) entsprechender Hyal-Lösungen an. Spin-coating ist eine schnelle und
einfache Methode zur Erzeugung homogener Schichten definierter Dicke. Dazu gibt man auf
ein Substrat einen Überschuss an Lösungsmittel und darin gelösten Komponenten. Durch
die schnelle Drehung des Probentellers wird die Flüssigkeit über die Zentrifugalkraft nach
außen geschleudert. Abbildung 2-8 zeigt den typischen Aufbau einer spin-coating
Vorrichtung.
21

Grundlagen
Abbildung 2-8: Spin-coating Prozess
Beim spin-coating kann die Filmdicke durch die Rotationsgeschwindigkeit und die
Konzentration der Probelösung variiert werden. Die Schichtdicke wird durch folgendes
Verhältnis bestimmt: [105]
h = k η β ω α
2 0
h
k 2 , α und β
η 0
ω
Schichtdicke
empirisch ermittelte Material- und Prozessparameter (abhängig von
physikalischen Eigenschaften des Polymers, des Lösungsmittels, des
Substrates; β liegt typischerweise im Bereich 0,29-0,39 für
Polymerlösungen)
Anfangsviskosität der Lösung
Winkelgeschwindigkeit
Um auf einer Oberfläche eine möglichst dichte und gleichmäßige Beschichtung aus
Hyaluronsäure und/oder ihren Derivaten mittels spin-coating erzielen zu können, müssen
geeignete Funktionalisierungstechniken angewandt werden. Da Hyaluronsäure und ihre
Derivate nur in stark polaren Lösungsmitteln wie Wasser und Wasser-Ethanol-Gemischen
löslich sind, muss für eine gute Benetzbarkeit eine hydrophile Oberfläche gegeben sein.
Der Benetzungsgrad einer Oberfläche ist einerseits für die optimale Verteilung einer Lösung
während des spin-coatings entscheidend, andererseits kann damit auch eine Vorhersage
über die Anheftungswahrscheinlichkeit von Zellen und Proteinen getroffen werden. Ein
geeignetes Verfahren zur Bestimmung des Benetzungsverhaltens stellt die
Kontaktwinkelmessung dar, die in Kapitel 2.9.3 näher beschrieben wird.
Bei den im vorangegangenen Kapitel 2.3.2 erwähnten photochemischen Vernetzungen kann
durch das Auflegen verschiedener Quarzglasmasken während der Bestrahlung und
anschließendes Abwaschen nicht vernetzter Hyaluronsäure ein Muster erzeugt werden.
Bestrahlte Bereiche können dadurch andere Eigenschaften als unbestrahlte Bereiche
aufweisen. Abbildung 2-9 zeigt den Aufbau der zur Bestrahlung von Oberflächen verwendet
wird.
22

Grundlagen
Lichtquelle
Substrat
Fotomaske
Abbildung 2-9: UV-Bestrahlung durch eine Maske
Die Bestrahlung von Hyal-Derivaten mit UV der Wellenlänge λ > 350 nm ergibt einen Film,
der stark hydrophil ist, aber durch Wasser nicht abwaschbar ist. Die erfolgreiche
Strukturierung von AAHyal-S mittels einfachem Auftropfen und Trocknen einer
entsprechenden Lösung sowie anschließendem Photocrosslinking konnte bereits untersucht
werden. Abbildung 2-10 zeigt das Wachstum von HGTFN Zellen entlang der Kanten von
25 µm breiten Streifen aus AAHyal-S. [43]
Abbildung 2-10: REM-Aufnahme einer strukturierten AAHyal-S Oberfläche, auf der HGTFN
Zellen adhärieren [43]
2.4.2 Silanisierung von Glas, Gold, Silizium
Unter Silanisierung versteht man die chemische Anbindung einer Silanverbindung an eine
Oberfläche. Dadurch kann bei geeigneter Wahl der Silanverbindung eine Erhöhung der
Hydrophilie von Oberflächen erzeugt werden. [106] Nasschemisch wird beispielsweise mit 3-
(Aminopropyl)-trimethoxysilan (APS) eine dünne Schicht aus Aminogruppen erzeugt, welche
die Oberfläche von Glas, Gold oder Silizium hydrophilisiert und damit die Benetzbarkeit für
wässrige Hyaluronan-Lösungen verbessert. Möglicherweise können zudem kovalente
Bindungen während des Bestrahlungsprozesses mit UV zwischen den Aminogruppen der
APS-Beschichtung und den photoreaktiven Gruppen der Hyaluronsäure ausgebildet werden.
Jüngere Publikationen beschreiben die Synthese von silangruppentragenden
Hyaluronsäurederivaten, die ohne Bestrahlung als dünne Filme auf Glas aufgebracht werden
können. Die beschriebenen Synthesebedingungen lassen allerdings Zweifel aufkommen, ob
23

Grundlagen
tatsächlich Methoxysilane unter Vermeidung ihrer Hydrolyse gewonnen werden können.
[107]
2.4.3 Plasma-Behandlung von Polymeren
Die Behandlung mit Plasma kann zur Erhöhung der Hyrophilie von Polymeroberflächen
genutzt werden. [108] Der Prozess der Oberflächenmodifikation in einer Plasmakammer wird
durch radiofrequente Anregung eines Gases initiiert. Dabei werden energiereiche Teilchen,
wie Ionen, Elektronen, Radikale und Photonen im Plasma erzeugt, die ihre Energie durch
physikalische und chemische Prozesse beim Kontakt mit der Oberfläche an diese abgeben.
Abhängig von der Art des verwendeten Gases in der Ionisationskammer werden
unterschiedliche Oberflächenmodifikationen erzielt, die einer verbesserten Benetzbarkeit mit
Hyaluronan-Lösungen dienen können.
2.5 Biofunktionalisierung von Hyaluronsäure
Zur Biofunktionalisierung von Hyaluronsäure sind geeignete Aminosäuresequenzen, Peptide
bzw. Proteine zu wählen. Diese Biomoleküle sollen vernetzte und auf Oberflächen
immobilisierte Hyaluronsäure-Derivate für die Anheftung von Zellen attraktiv machen. Solche
Biomoleküle können entweder in die Gele eingebettet werden (kovalent bei der
vorangehenden Gelderivatisierung oder physisorptiv während der Gelfixierung), mittels Co-
Polymerisation in einem Gel kovalent gebunden werden oder nach der Vernetzung zum
Hydrogel auf einer Geloberfläche kovalent fixiert werden, wie die nachfolgende
schematische Übersicht (Abbildung 2-11) veranschaulicht.
24

Grundlagen
(a)
Vernetzung
(b)
+
Vernetzung
(c)
+
Vernetzung
(d)
+
Vernetzung
Vernetzung
Hyal-Strang oder anderes Polymer
mit vernetzbarer Funktionalität
Biomolekül
mit vernetzbarer Funktionalität
Abbildung 2-11: Funktionalisierung von Hydrogelen mit Biomolekülen
Die Vernetzung biofunktionalisierter Hyal-Stränge (a) liefert Hydrogele, die kovalent
gebundene Biomoleküle enthalten. Werden Biomoleküle und Hyal-Stränge vor der
Vernetzung miteinander vermischt (b), so werden die Biomolelküle in das entstehende
Hydrogel-Netz eingebettet. Mittels Co-Polymerisation (c) von Hyal-Strängen, einem weiteren
Polymer und einem entsprechend funktionalisierten Biomolekül können kovalente Netze
gebildet werden. Schließlich kann auch zuerst das Hydrogel gebildet werden (d) und im
Anschluss die Biomoleküle auf dessen Oberfläche mittels kovalentem Aufpfropfen (so
genanntes „Graften“ 3 ) angebunden werden. Für jede dieser Strategien und die
unterschiedlichen Wechselwirkungsmechanismen findet sich eine Vielzahl an Beispielen,
von denen einige im Folgenden beschrieben werden.
3 Als Graften wird ein Verfahren bezeichnet, bei dem an einem bereits bestehenden Polymer entlang
eines Rückrates weitere Polymerisationsreaktionen eingeleitet werden.
25

Grundlagen
2.5.1 Kovalent biofunktionalisierte Hyal-Stränge zur Hydrogelbildung
Eines der wenigen Beispiele, das die Verwendung kovalent gebundener Biomoleküle an
Hyal nutzt, mit dem Ziel, dies als funktionale Beschichtung zu verwenden, wird von Pitt et al.
beschrieben. Hierbei wird ein Peptid mit der Sequenz YGRGDS direkt an entsprechend
modifizierte Hyaluronsäure (freie Hydrazin-Funktionalität) gebunden. Die Immobilisierung
des Polymers auf Stahl mittels Methoxysilanen führt zur Anheftung von Blutplättchen auf der
ansonsten völlig inerten Metalloberfläche. Eine Anheftung an Peptid-freie Hyaluronsäure auf
Stahl findet nicht statt, was die Notwendigkeit der Integrinbinder unterstreicht. [109]
Generell verläuft die Anbindung von Biomolekülen an hochmolekulare Hyaluronsäure nur mit
relativ geringen Ausbeuten. [48] Verhältnismäßig teure Biomoleküle müssen in großem
Überschuß zur Reaktionslösung zugegeben werden und können nach der Aufreinigung des
Hyal-Produkts nicht wiedergewonnen werden. Zudem ist eine stöchiometrische Kontrolle der
Reaktion aufgrund verschiedener Faktoren (schwankende Molekulargewichte in einer
Charge, Bildung von Konzentrationsniederschlägen bei hochmolekularen Verbindungen) nur
schwer möglich. In Kapitel 4.1 werden die Probleme zur reproduzierbaren Bestimmung des
Modifizierungsgrades funktionalisierter Hyal-Derivate diskutiert.
2.5.2 Einbettung von Proteinen in Hydrogele
In vivo werden zur Steigerung der Zellinfiltration und Vaskularisierung häufig
Wachstumsfaktoren zu den Hyal-Gelen gegeben. Damit kann die biologische Funktion des
Hydrogels variiert werden; unterschiedliche Gewebetypen werden bei Ratten mit Hyal-
Implantaten gebildet. [110] Synergistische Effekte können ebenso bei der Verpflanzung von
Peptid-haltigem Hyal-Gel in Rattenhirn festgestellt werden. Hier adhärieren Astrozyten
besonders auf dem modifizierten Hydrogel. [104]
Die Anwendung des natürlichen Fibronektins (FN) zur Steigerung der Zelladhäsion auf Hyal-
Substraten ist bekannt. So ließ sich beispielhaft zeigen, dass eine Einbettung oder
Adsorption von Fibronektin (FN) in oder auf den Hydrogelen eine Zellansiedlung unterstützt,
sei es z.B. für interstitielle Klappenzellen [111] oder (NIH3T3) Fibroblasten [97, 112].
Untersuchungen von Welle haben gezeigt, dass die zelladhäsionsfördernde Dicke einer auf
UV-modifiziertem Polystyrol adsorbierten Lamininschicht etwa 15,4 nm beträgt. [113]
Neben natürlichen Biomolekülen (vor allem Proteine) steigern auch einige synthetische
Polypeptide wie Polylysin (PL) und Polyornithin (PO) oder Polyaminie wie das
Polyethylenimin (PEI) die Zelladhäsion. Sie regulieren die Zelladhäsion nicht über die
Bindung an zelluläre Rezeptoren, sondern über elektrostatische Wechselwirkungen
zwischen der negativ geladenen Zellmembran und dem positiven geladenen Polymer. Der
Mechanismus der Zell-Polykation-Wechselwirkung wird dabei als unspezifische
Wechselwirkung beschrieben, bei der die Moleküle der Zellmembran aufgrund der Ladung
neu angeordnet werden. [114] Diese elektrischen Effekte werden auch bei der Bildung
zellattraktiver Hydrogele aus Hyal genutzt. Dabei werden so genannte polyelektrische
Schichten abwechselnd aus Poly-L-Lysin (PLL) und Hyaluronsäure gebildet. Diese Schichten
26

Grundlagen
eignen sich als Interphotorezeptor-Matrix zur Einbettung biologisch aktiver Proteine und zur
Eindiffusion von Medikamenten und deren Freisetzung bei Anwendung in der Zellkultur.
[115, 83] Interessant ist PLL zudem als Beschichtung für Polymere. Es konnte gezeigt
werden, dass PLL auf Polymilchsäure (PLA) in großer Menge physisorbiert und auch nach
mehreren Waschschritten nicht entfernt werden kann. [116]
Die Einbettung von Proteinen oder Polypeptiden in Hydrogele stellt eine einfache und
schnelle Methode zur Überprüfung der Biofunktionalisierung dar. Aufgrund der zu
erwartenden Zellproliferation auf einem bioaktiven Hydrogel kann entschieden werden,
welche Faktoren im Hydrogel die Zellattraktion positiv beeinflussen können. Dies wird in der
vorliegenden Arbeit untersucht und diskutiert.
2.5.3 Co-Polymerisation von Hyal-Strängen mit einem weiteren Polymer und dem
funktionalisierten Biomolekül
Derzeit sind vielerlei Beispiele zur Immobilisierung von Peptiden in Polymeren bekannt, es
gibt jedoch nur wenige Beispiele für Hyaluronsäurefilme/-gele, die ausschließlich aus RGD-
Einheiten und Hyaluronan bestehen. [104, 109] Häufig sind weitere Polymere zur Hydrogelbzw.
Polymerbildung notwendig, wie in diesem Abschnitt vorgestellt.
Breite Anwendung findet der Gebrauch des wasserlöslichen, vollsynthetischen und je nach
Derivatisierung bioabbaubaren Polyethylenglykols (PEG) bei der Herstellung von
Biomaterialien. So bildet beispielsweise ein Gemisch aus diacryliertem PEG, dem Peptid mit
der Sequenz GCGYGRGDSPG und methacrylierter Hyaluronsäure nach den
entsprechenden Prozesschritten zur Photopolymerisation ein Hydrogel, auf dem
Fibroblasten-Proliferation beobachtet werden kann; zudem kann gezeigt werden, dass der
Abbau der Gele durch Hyaluronidase weiterhin möglich ist. [100]
Ein weiteres Beispiel zeigt Abbildung 2-12. Hier ist schematisch die Verknüpfung des Peptids
CRGDS mittels eines diacrylierten PEG-Linkers an das Thiol-funktionalisierte Hyaluronsäure-
Derivat Hyal-DTPH über eine S-S Brücke dargestellt. Durch geschickte Wahl der
stöchiometrischen Verhältnisse werden dabei einerseits das Peptid an die Hyaluronsäure
gekoppelt, andererseits die Hyal-Stränge miteinander vernetzt. Shu et al. gelang damit die
Herstellung eines Gels, das subcutan in Mäuse injiziert zu einer schnelleren Bildung eines
faserförmigen Gewebes und einer gesteigerten Produktion von ProCollagen in vivo führte.
[117]
27

Grundlagen
Abbildung 2-12: Crosslinking von PEG, Peptid und Hyaluronsäure
Die Bildung von Biopolymeren aus PEG wird von vielen Gruppen seit einigen Jahren intensiv
erforscht. In der vorliegenden Arbeit lag der Fokus auf der Untersuchung von Hydrogelen,
die allein aus Hyaluronan aufgebaut sind. Ein Co-Polymer, das neben Hyal ein weiteres
Polymer zur Hydrogelbildung verwendet wurde daher nicht untersucht.
2.5.4 Kovalente Immobilisierung von Peptiden auf Hydrogelen
Eine Anbindung photoreaktiver Peptide an eine Oberfläche stellt eine einfache und äußerst
effektive Möglichkeit zur Funktionalisierung dar. Sugawara und Matsuda synthetisierten dazu
zunächst RGD gebunden an einen wasserlöslichen flexiblen Peptid-Teil aus Gly-Gly-Gly, der
eine photosensitive Azido-Gruppe trägt (Abbildung 2-14).
N 3
O
O N
O O
+ GGGRGDSP
N 3
GGGRGDSP
O
Produktnachweis:
- Massendetektion
- IR Spektroskopie
Abbildung 2-13: Darstellung eines photoreaktiven Peptids
Das so gebildete photoreaktive Octapeptid wird mittels UV-Bestrahlung auf einem Film aus
zellabweisendem Polyvinylalkohol (PVA) verankert. Durch die Verwendung von Masken
können dabei sogar Strukturen im Mikrometer-Maßstab erzeugt werden. Das Wachstum von
Endothel-Zellen in den bestrahlten, also RGD-verankerten Bereichen kann beobachtet
werden. [118]
Bei der Anbindung von Peptiden auf einer Hydrogeloberfläche muss gewährleistet sein,
dass sowohl die an das Peptid anzukoppelnde(n) photoreaktive(n) Gruppe(n) als auch der
Anbindungsprozess an das Gel die Peptidfunktionalität nicht beeinträchtigt. In dieser Arbeit
wurden geeignete Kopplungsabläufe und Prozessbedingungen mittels Festphasensynthese
untersucht.
28

Grundlagen
2.6 Biofunktionalisierung mit zyklischen Peptiden
Zyklische RGD-Pentapeptide weisen gegenüber lineare RGD-Peptiden eine bis zu zehnfach
erhöht Affinität gegenüber speziellen Integrinen auf und haben den Vorteil, dass sie in vivo
nicht abgebaut werden können. [119, 120,121] Bekannt ist die Synthese von dem in
Abbildung 2-14 dargestellten zyklischen Peptid zyklo(RGDfK) mittels Fmoc-Strategie an der
Festphase. Eine Herausforderung stellt dabei das selektive Entschützen der Seitenketten
dar, welches das Anbringen von Spacern (Abstandshalter) und weiteren Funktionalitäten
ermöglicht. [119, 122]
H
N
Pbf
NH
Dde
HN
O
HN
O
HN
N
H
NH
O
NH
O
NH
O
O O
tBu
Abbildung 2-14: Vollständig geschütztes Pentapeptid zyklo(RGDfK) mit den Schutzgruppen
Pbf, tBu, Dde
Von Bedeutung für die Zelladhäsion an RGD-funktionalisierte Oberflächen ist ein
entsprechender Spacer, der der Zelle die Erreichbarkeit der integrinbindenden Sequenz
ermöglicht, ohne dabei unerwünschte Zell-Oberflächen-Abstoßungsreaktionen zu
provozieren. Untersuchungen dazu zeigen, dass ein Mindestabstand von 3,5 nm zwischen
Oberfläche und der etwa 1,35 nm großen, auf einem Ring angeordneten RGD-Einheit
notwendig ist, um effektiv Zelladhäsion zu ermöglichen. [102] Dennoch kann ein sehr langer
flexibler Spacer zu unerwünschten Effekten führen. Da substratabhängige Zellen im Inneren
ein Zytoskelett zwischen mehreren Anheftungspunkten ausbilden müssen, wirken sehr
bewegliche RGD-Einheiten ähnlich wie gelöste RGD-Moleküle. Diese blockieren also die
Integrin-Bindungstasche, ohne die Zytoskelettorganisation und damit die Langzeitvitalität der
Zelle zu ermöglichen. In den folgenden Kapitel 2.6.1 bis 2.6.3 werden einige funktionelle
Gruppen vorgestellt, die über einen Spacer an die Aminosäureseitenkette des Peptids
gekoppelt sind. In Kapitel 4.6.4 dieser Arbeit wird gezeigt, wie sich durch Anbindung eines
funktionalisierten Spacers aus drei Aminohexansäure-Einheiten an ein zyklisches RGD
Peptid Zelladhäsion erfolgreich steuern lässt.
2.6.1 Peptide, die eine Azid-Gruppe tragen
Über die Verwendung von Peptiden, die eine Azid-Gruppe zur photochemischen Vernetzung
tragen und damit der Steuerung der Zelladhäsion dienen, ist in der Literatur wenig bekannt.
Zwar konnte, wie in Kapitel 2.5.4 bereits erwähnt wurde, ein Azid-funktionalisiertes
29

Grundlagen
Octapeptid erfolgreich zur photolithographischen Strukturierung von PVA verwendet werden.
Zyklische RGD-Peptide, die eine photoreaktive Azid-Gruppe tragen und sich daher für die
Anbindung oder Einbettung mittels UV an eine Hyaluronan-Oberfläche bzw. in ein Hyal-Gel
eigneten, sind bisher jedoch noch nicht beschrieben worden. In dieser Arbeit wurde daher
die Herstellung entsprechend funktionalisierter linearer und zyklischer Pentapeptide und
deren Anwendung in der Zellkultur untersucht.
2.6.2 Peptide, die einen Acrylsäure-Rest tragen
Die Synthese acrylierter Peptide (sog. Acrylamidoyl-Peptide) ist bekannt. Bei Anknüpfung an
und gleichzeitiger Vernetzung von (PEG) wurden Diacrylat-PEG Hydrogele beschrieben, auf
denen sich ohne Abstandshalter weniger als 5 %, mit einem Abstandshalters (MW 3400)
zwischen der Peptid-Einheit und der Acrylsäuregruppe jedoch nahezu 100 % Fibroblasten
ansiedeln ließen. [101] Durch das Graften von acrylierten Peptiden auf präpolymerisiertem
Polymethylmethacrylat (PMMA) wurde ein gesteigertes Zellwachstum von Mausosteoblasten
MC3T3-H1 im Zusammenhang mit der RGD-Belegungsdichte beobachtet. [102]
Solche acrylierte, lineare und zyklische Peptide sowie ihre Anbindung auf Hyaluronan sind in
Kapitel 4.6.4 untersucht worden. Die photolithographische Strukturierung zur Steuerung der
Zelladhäsion stand dabei im Vordergrund.
2.6.3 Peptide, die über eine Thiol-Gruppe verfügen
Zur kovalenten Anbindung an Maleimid Diblock-Copolymere werden zyklische Pentapeptide
synthetisiert, die über eine Thiol-Gruppe verfügen und damit an die Doppelbindung von
Polymeroberflächen binden können. In den Studien zur Zelladhäsion zeigte sich, dass auf
den entsprechend RGD-funktionalisierten Diblock-Coblockpolymeren wesentlich mehr
humane Osteoblasten adhärieren als auf den entsprechenden Polymerfilmen ohne
integrinbindende Sequenzen. [123] Ebenso bewirkte die Immobilisierung von Thiol-Peptiden
auf Maleimid-funktionalisierten BSA-Oberflächen die Adhäsion von Mausfibroblasten MC3T3
[102] und primären humanen Chondrozyten [124].
Der Einsatz Thiol-funktionalisierter Peptide zur Gestaltung neuartiger Biopolymere ist
vielversprechend, für die Herstellung strukturierter funktionaler Oberflächen jedoch
ungeeignet, da lithographisch kein Muster erzeugt werden kann. Zudem sind Thiole äußerst
empfindlich gegenüber oxidativen Einflüssen. Die Biofunktionalisierung von Hyal-Derivaten
mit Thiol-Peptiden ist daher nicht Bestandteil dieser Arbeit.
30

Grundlagen
2.7 Neue Strategie zur Biofunktionalisierung von Hyaluronsäure-Hydrogelen
Neben den in Kapitel 2.5 vorgestellten Möglichkeiten der Biofunktionalisierung von
Hyaluronsäure soll zusätzlich ein Verfahren erprobt werden, bei dem ausschließlich Hyal-
Derivate und vollsynthetische, integrinbindende Peptide verwendet werden. Zahlreiche RGDmodifizierte
Polymere wurden bereits untersucht und es konnte gezeigt werden, dass der
Abstand von RGD zur Oberfläche, die RGD-Belegungsdichte, die Integrin-Selektivität und -
Affinität entscheidend durch das entsprechende Design der RGD-Peptide beeinflusst wird.
[31] Beispielsweise wird RGD auf einem Co-Polymer aus Polystyrol und Acrylsäure mittles
Carbodiimid-Kopplung und dann das Wachstum von Mausfibroblasten beobachtet. [125]
Auch die kovalente Anbindung von RGD an Polyacrylamidgel mittels NHS-Aktivierung
funktioniert und unterstützt damit die Fibroblasten-Adhäsion. [126] Eine Anbindung von
GRGDSY mit geschützten Seitenketten an Polyurethane verläuft erfolgreich mit EDC und
anschließender Entschützung des Peptids, sodass Endothelzellen auf dem modifizierten
Polymer adhärieren. [127]
Obwohl bedacht werden muss, dass bei einer radikalischen Polymerisation die Hyaluronan-
Gerüststruktur oder die zu einer Funktionalisierung verwendete Peptide zerstört werden
können, zeigen die Arbeiten von Kantlehner et al, dass eine kovalente Anbindung zyklischer
RGDfK Peptide an PMMA mittels eines Acrylamidankers erfolgreich verläuft und der
verbesserten Adhäsion und Proliferation von Osteoblasten dient. [102]
In Abbildung 2-15 (angelehnt und fortgeführt aus Abbildung 2-11) sind drei grundsätzliche
Prozessmöglichkeiten schematisch dargestellt, wie sie im Rahmen dieser Arbeit zur
Herstellung zellattraktive Hyaluronsäure-Hydrogele untersucht werden sollen.
(a)
(b)
Vernetzung
Kapitel 4.5.2
+
Vernetzung
Kapitel 4.6.2
(e)
Vernetzung
+
Vernetzung
Kapitel 4.6.4
Hyal-Strang
mit vernetzbarer Funktionalität
Biomolekül
Peptid mit vernetzbarer Funktionalität
Abbildung 2-15: Herstellung biofunktionaler Hyaluronsäurefilme, ausgehend von Peptidfunktionalisierter
Hyaluronsäure (a), von einem Gemisch aus funktioneller Hyal
und Biomolekülen (b) oder von pclHyal und funktionalisiertem Peptid (e)
31

Grundlagen
Zur Vermeidung aufwändiger Schutzgruppen-Strategien ist die Anbindung von RGD an
Hyaluronsäure mittels Festphasensynthese (SPPS) denkbar. Durch Dialyse kann dabei nach
Abspaltung des Trägermaterials das Produkt aus Hyaluronsäure und dem gewünschten
Peptid relativ einfach isoliert werden (a). In Abbildung 2-16 wird die SPPS-Synthese-
Strategie dargestellt, wobei über eine mit Fluor markierte Aminosäure im Kopplungsprodukt
mittels
19 F-NMR Spektroskopie eine erfolgreiche Anbindung an Hyaluronsäure
nachgewiesen werden könnte.
Hyal
COOH
2)
1) TFFH
19 FDGR
Hyal
O HN
RGDF
19
1) Harz-Abspaltung
2) Dialyse
Hyal
O HN
RGDF
19
Abbildung 2-16: Verknüpfung von Hyaluronsäure und NHS-aktivierten Molekülen
Zur strukturierten Peptid-Immobilisierung mittels Photolitographie besteht die Möglichkeit, auf
einer pclHyal Oberfläche photoreaktive Peptide aufzutragen und durch Bestrahlung mit UV
auf der pclHyal-Schicht anzubinden (e). Dabei kann durch das Auflegen einer Maske
während des Bestrahlungsprozesses das Peptid lokal immobilisiert werden. Ebenso denkbar
ist die UV-Bestrahlung eines Gemisches aus einem (natürlichen) Biomolekül und Hyal, wobei
das Biomolekül nicht nur auf der Oberfläche sondern im pclHyal verteilt kovalent
angebunden werden kann (b).
Bei der Bestrahlung mit UV und Verwendung eines Initiators können allerdings
unkontrollierbare Nebenreaktionen auftreten. Es können z.B. zelltoxische Verbindungen
gebildet werden, sodass die erreichte Funktionalisierung nicht zwangsläufig Zellattraktivität
begünstigt. Für Anwendungen in der Zellkultur müssen daher geeignete Prozesse entwickelt
werden, um den Stress auf die Zellen möglichst gering zu halten.
2.8 Einsatz von Hyal-Kompositen in der 3D-Zellkultur
Wie bereits im Einleitungsteil vorgestellt, reagieren Zellen auf chemisch strukturierte
Oberflächen. Zur Nachgestaltung einer natürlichen dreidimensionale Umgebung werden
zudem häufig Gerüststrukturen oder poröse Substrate wie Schwämme, Fasern oder
Mikrokapseln verwendet, die das Zellwachstum, die Zellorganisation und Differenzierung auf
oder in den Strukturen unterstützen.[36, 22, 9]
Eine weitere Möglichkeit Zellen dreidimensional zu kultivieren, ist die Verwendung so
genannter „microwell arrays“. Dabei handelt es sich um eine Matrix aus Mikrovertiefungen
die mit Zellen besiedelt wird. [128-130]. Häufig werden Polymere zur Herstellung dieser
mikrostrukturierten Substrate genutzt, die mittels Photolithographie, Plasmaätzen, Mikro-
Kontakt-Stempeln (µCP) oder Mikro-Thermoformen bearbeitet werden. [131] Je nach
verwendetem Polymermaterial und dessen Oberflächeneigenschaften kann die Zelladhäsion
nur global kontrolliert werden, sofern keine feinere Struktur angebracht wird. Wird das
Substrat mit einer Zelllösung inkubiert, so werden sich statistisch betrachtet die Zellen
sowohl zwischen den Vertiefungen als auch auf den verbindenden planaren Flächen
ansiedeln. Dies hat die Bildung einer Mischpopulation aus Zellen in der Monolage und Zellen
32

Grundlagen
in einer 3D-Situation zur Folge, was zu fehlerhaften Interpretationen gemessener
Zellaktivitäten führen kann. [132]
Verschiedenste Ansätze zur Kontrolle der Umgebung von Zellen werden daher beschrieben.
Mohr et al. beschichten ein ausgeformtes Polyurethansubstrat (PU) mit einer Proteinresistenten
sich selbst anordnenden Monolage aus Alkanthiolen zwischen den Vertiefungen
und einem Matrigel TM Adsorbat in den Vertiefungen (Abbildung 2-17). Damit ist es möglich
undifferenzierte hES-Zellen über Wochen ohne Passagieren der Zellen zu kultivieren. [133]
Ochsner et al. passivieren das Plateau einer Polydimethoxysilan (PDMS) Struktur durch
inverses µCP von Poly(L-lysin)-graft-poly(ethylenglykol). Anschließend werden durch
Inkubation des PDMS Substrates mit eine Fibronektin-Lösung ausschließlich die
Vertiefungen mit dem Zell-attraktiven Fn beschichtet, wodurch die dreidimensionale
Ausbildung einzelner menschlicher Nabelschnurendothelzellen kontrolliert werden kann.
[134] Mit einer Methode die als „reaktives Mikro-Kontakt-Stempeln“ bezeichnet wird, kann die
Topografie und die örtlich aufgelöste Anbindung regulativer Proteine zur Untersuchung
blutbildender Stammzellen untersucht werden. [135]
geformtes PU
Goldbeschichtung
Alkanthiole
Matrigel TM
hESCs
Abbildung 2-17: Selektive Beschichtungen von PU zur Kultivierung von hESC über mehrere
Wochen [133]
Eine Möglichkeit der Anwendung von Hyaluronsäure in 3D-Zellkultur-Substraten bietet das
Substrate Modification and Replication by Thermoforming“ (SMART) Verfahren. [129] Der
Vorteil des SMART Verfahrens gegenüber den oben erwähnten Methoden zur Definition
einer Zellnische basiert auf der Kombination des Formprozesses einer festen Phase mit der
Vor-Modifizierung eines planaren Polymerfilmes. Da das Formen des Films bei
Temperaturen durchgeführt wird, bei denen das Polymer zwar erwärmt, jedoch nicht
geschmolzen wird, bleiben wie in Abbildung 2-18 gezeigt zuvor ausgeführte
Polymermodifikationen erhalten. [136]
33

Grundlagen
Abbildung 2-18: Thermogeformter Polycarbonat Film mit einem Muster aus Silber. In der
Vertiefung ist die Verstreckung des Musters (ursprünglich 25x25 µm 2 ) deutlich
zu erkennen [129]
2.9 Untersuchungsmethoden zur Charakterisierung der Biofunktionalisierung
von Polymeroberflächen und deren Einsatz in der Zellkultur
2.9.1 Spektroskopische Verfahren
Chemisch-analytische Standardmethoden
Die Methoden zur Untersuchung modifizierter Hyaluronsäure sind abhängig von der Form, in
der die Hyaluronsäure vorliegt. Im unvernetzten Molekül erfolgt der Nachweis der Anbindung
funktioneller Gruppen durch die Beobachtung der Verschiebung der Protonensignale im 1 H-
NMR. Zusätzlich empfiehlt sich die Untersuchung der Hyal-Derivate mittels UV/Vis-
Spektroskopie (quantitative Analyse) oder IR-Spektroskopie (qualitativer Nachweis),
insbesondere auch, um die Art und Konzentration von Syntheserückständen zu ermitteln.
Zur Peptidsynthese werden chromatographische Verfahren gekoppelt an
Massenspektroskopie oder UV-Vis Spektroskopie verwendet. Bei der Synthese der Peptide
an der Festphase erfolgt die Charakterisierung der Produkte nach Abspaltung vom
Syntheseharz mittels LC-MS-µToF.
Für Anwendungen in der Zellkultur ist auf besondere Reinheit der eingesetzten
Hyaluronsäurederivate und Peptide zu achten. Dies wird durch entsprechend lange Dialyse-
Zeiten, Filtrationen und chromatographische Verfahren gewährleistet.
Werden Hyaluronsäuremoleküle auf einer Substratoberfläche immobilisiert, so bestätigt eine
einfache Voruntersuchung durch Anfärben mit Kristallviolett schnell, ob die Substrat-Hyal-
Vernetzung erfolgreich verlaufen ist. Das Farbsalz wird über das quaternäre Stickstoffatom
an die deprotonierten Carboxylgruppen der Hyaluronsäure gebunden.
34

Grundlagen
Mittels Photoelektronenspektroskopie wird Hyal auf einer Oberfläche nachgewiesen
Präziser lässt sich die Immobilisierung von Hyaluronsäure auf verschiedenen Substraten
durch die Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) feststellen. Dabei wird eine Probe
mit charakteristischer Röntgenstrahlung angeregt. Durch den photoelektrischen Effekt
werden gebundene Elektronen durch die einfallenden Photonen (hν) aus den inneren oder
äußeren Atomschalen des oberflächennahen Probenmaterials herausgeschlagen und
verlassen die Probe mit der kinetischen Energie E kin :
E kin = hν - E B - e Φ
E B ist die Bindungsenergie des betreffenden Photoelektrons und wird als charakteristische
Größe zum Elementnachweis benutzt; e Φ ist die Elektronenaustrittsarbeit, die aufgebracht
werden muss, um ein Elektron aus einem Festkörper ins Vakuum zu transferieren. [137]
Durch die Näherung nach Koopman [138] wird angenommen, dass sich die Lage der
Elektronen-Energieniveaus eines Atoms oder Moleküls bei dessen Ionisierung nicht ändert,
so dass die Photoemission über eine Einelektronennäherung gut beschrieben ist und damit
die Ionisationsenergie gleich der Bindungsenergie ist.
Die mittlere freie Weglänge λ von Photoelektronen mit kinetischen Energien zwischen 10
und 1000 eV liegt für alle elementaren Festkörper zwischen 0,2 und 3 nm. Somit beschränkt
sich die Informationstiefe von XPS auf einen Bereich von wenigen Monolagen. Die Intensität
des Signals nimmt aufgrund von Wechselwirkungen der Photoelektronen mit Materie mit
zunehmender Austrittstiefe exponentiell ab. Es lässt sich abschätzen, dass 95 % der
gemessenen Intensität einer Photolinie aus einer Schicht der Dicke 3 λ stammen, was einer
Informationstiefe von max. 10 nm entspricht. [139]
Der große Nutzen von XPS-Messungen besteht neben dem Elementnachweis in
oberflächennahen Schichten in der Möglichkeit zur Unterscheidung verschiedener
Oxidationsstufen eines Elements. Da eine unterschiedliche chemische Umgebung eines
Atoms eine Änderung der Valenzelektronenverteilung zur Folge hat, wird die Abschirmung
der Kernladung verändert und führt damit zu unterschiedlichen Bindungsenergien der
Photoelektronen des gleichen Elements. Dieser als chemische Verschiebung bezeichnete
Effekt ist als Differenz zwischen der Bindungsenergie eines Atoms in seiner chemischen
Umgebung und der Bindungsenergie des Reinelements definiert.
Quantitative Analyse mittels XPS
Zur Komponentenidentifizierung und Quantifizierung werden die XPS-Spektren der
relevanten Energiebereiche (C1s, O1s, N1s) mittels einer oder mehrerer Voigt-Funktionen
angepasst. Die sich aus den ermittelten Peakflächen ergebenden Intensitäten werden auf die
Wirkungsquerschnitte für die Photoionisation σ [140] sowie die energieanhängigen mittleren
freien Weglängen λ ( λ ∝ Ekin
) und die Transmissionsfunktion des Analysators korrigiert
[141]. Für den Analysator wurde in dieser Arbeit eine Passenergie von 20 eV gewählt. Im
Ergebnis liegen die Konzentrationsverhältnisse innerhalb des Informationsvolumens vor.
35

Grundlagen
Die XPS-Messungen wurden am KIT, Institut für Materialforschung III, von Frau Vanessa
Trouillet und Herrn Dr. Michael Bruns durchgeführt.
2.9.2 Mikroskopische Verfahren
Topografische Untersuchung von Hyaluronsäure-Filmen mittels AFM
Die Oberflächenbeschaffenheit eines Hyaluronsäurefilms kann durch Rasterkraftmikroskopie
(AFM) Aufnahmen untersucht werden. Zur Topographie-Detektion mittels AFM wählt man
den non-contact Modus. Dabei wird eine Messnadel, auch Cantilever genannt, mit einem
Piezoelement zur Schwingung angeregt. Die Spitze oszilliert dabei im attraktiven
Abstandsbereich des Oberflächenpotentials, wird aber geeignet kontrolliert, um einen
direkten Kontakt zu verhindern. Sobald sich die Cantilever-Spitze der Probe nähert,
beeinflussen van-der-Waals Kräfte die Amplitude und die Phase der Schwingung, was als
Änderung des Abstands zwischen Spitze und Probe detektiert wird. Den Aufbau eines AFM-
Gerätes zeigt Abbildung 2-19. [142] Durch den non-contact Betriebsmodus wird eine
Beschädigung des Polymers während der Messung verhindert, was im tapping-Modus, bei
dem der Cantilever im Schwingungstal die Probe berührt, nicht auszuschließen wäre. [143]
Durch das Abtasten der Oberfläche kann eine vollflächige Beschichtung oder eine erzeugte
Struktur nachgewiesen werden.
Abbildung 2-19: Aufbau eine AFM-Messgerätes [142]
36

Grundlagen
Dreidimensionale Betrachtung von Hyaluronsäurestrukturen mittels Laserscan-Mikroskopie
Zur Betrachtung erzeugter pclHyal-Strukturen eignet sich die berührungslose Laser
Profilometrie. Das in dieser Arbeit verwendete 3D-Lasersan-Farbmikroskop verwendet zwei
verschiedene Lichtquellen: kurzwelliges Laserlicht und eine weiße Lichtquelle zur
Beleuchtung. Durch den gleichzeitigen Einsatz beider Lichtquellentypen können
Informationen über Farbe, Lichtintensität und Profil der Probe gewonnen werden. Dabei
rastert ein fokussierter Laserstrahl einer bestimmten Wellenlänge die zu vermessende
Oberfläche in x- und y-Richtung ab. Das Objektiv wird entlang der z-Achse verschoben und
wiederholtes Scannen für jede z-Position liefert abhängig vom Profil der untersuchten Probe
unterschiedliche Intensitäten des reflektierten Lichts. Zur Lichtaufnahme wird ein
Photoelektronen-Vervielfacher verwendet. Entsprechend der Bewegung der Optik entlang
der vertikalen Achse auf jeder Einzelebene werden die maximalen Lichtintensitäten, die
Höhe der maximalen Lichtintensitäten sowie die dazugehörige Farbinformation ermittelt und
drei Bildtypen erzeugt: ein omnifokales Farbbild, ein schwarz-weiß Lichtintensitätsbild und
ein Vertikalbild.
Abbildung poröser Hyaluronsäure-Gele durch REM
Die Porenstruktur eines Hyaluronsäuregels kann durch Aufnahmen am
Rasterelektronenmikroskopie (REM) gezeigt werden (schematische Darstellung eines REM
in Abbildung 2-20). Bei dieser Methode wird ein Elektronenstrahl in einem bestimmten
Muster über das vergrößert abzubildende Objekt geführt (gerastert), wobei die
Wechselwirkungen der Elektronen mit dem Objekt zur Erzeugung eines Bildes genutzt
werden. Proben für REM-Aufnahmen müssen vakuumstabil sein, da die Untersuchung im
Hochvakuum stattfindet. Da Hyaluronsäure-Proben nicht leitend sind, müssen sie vor der
Elektronenbestrahlung mit einer dünnen Edelmetallschicht überzogen werden (z.B. durch
Aufdampfen von Gold), um das Aufladen der Proben zu verhindern. Für biologische Proben
ist eine spezielle Variante des REM, das ESEM (environmental scanning electron
microscope) von Bedeutung. Hierbei können auch Proben untersucht werden, die nicht
vakuumstabil sind, da in der Probenkammer ein erhöhter Restgasdruck angelegt werden
kann. Zudem müssen im ESEM die Proben nicht mit Gold bedampft werden, da das Restgas
in der Probenkammer der Aufladungskompensation dient.
37

Grundlagen
Abbildung 2-20: Schematischer Aufbau eines Rasterelektronenmikroskops
(www.pit.physik.uni-tuebingen.de)
Die REM-Aufnahmen wurden am KIT, Institut für Materialforschung I, von Frau Beate
Rabsch durchgeführt.
Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht Einblicke in das Zellwachstum auf Hyal-Filmen und
in Hyal-Gelen
Ein Anfärben von Zellen auf Hyal-Matrices kann mit Kristallviolett erfolgen. Zu beachten ist
dabei jedoch, dass Kristallviolett ebenfalls in Hyal-Filme eingelagert wird und entsprechend
als Hintergrundfärbung stört. Eine Zellfärbung mit fluoreszierenden Farbstoffen ist daher
sinnvoll. Werden Zellen in Hydrogelen immobilisiert, so ist neben einem geeigneten
Kulturbehältnis und zytokompatiblen Gelierungsprozessen auch die Zellzahl entscheidend
für die Vitalität der Zellen. Die Evaluierung von Mikrokontainern mit Hydrogelen für die
Zellkultur, das Überprüfen negativer Einflüsse von Photoinitiatoren bzw. UV-Strahlung auf
die Zellkultur sowie eine geeignete Zelldichte zum Inkubationsbeginn sind zu untersuchen.
Um im Anschluss die Viabilität der Zellen bestimmen zu können, sind geeignete Farbstoffe
zu wählen, die Aufnahmen der in 3D-Kultur-Gelen befindlichen Zellen am konfokalen
Lasermikroskop ermöglichen. Dabei können sich mögliche Farbstoffeinlagerungen im Gel
störend auswirken.
Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht es, die Zellen auf einem Hyaluronsäurefilm bzw. in
einem Hyaluronsäuregel detailliert abzubilden. Durch das intensive Anregungslicht einer
38

Grundlagen
bestimmten Wellenlänge wird der Fluoreszenzfarbstoff in der Probe angeregt und emittiert
meist nur sehr schwaches Licht, welches durch die Stokesverschiebung in der Regel
langwelliger ist als das anregende Licht. Mit Hilfe eines dichroitischen Strahlteilers wird das
Anregungslicht auf die Probe reflektiert, während das Fluoreszenzlicht transmittiert und das
von der Probe reflektierte Anregungslicht wiederum reflektiert wird.
Der schematische Aufbau der in dieser Arbeit verwendeten Mikroskope zur Fluoreszenz-
Detektion und zur Erzeugung dreidimensionaler Bildansichten ist in den Abbildungen 2-21
gezeigt.
(a)
(b)
Abbildungen 2-21: (a) Aufbau eines Fluoreszenzmikroskops, bei dem das Anregungslicht
zusätzlich zwei Glasplatten mit Gitterstrukturen passiert, um rechnerisch ein 3D
Bild rekonstruieren zu können und (b) Aufbau eines konfokalen
Fluoreszenzmikroskops (beide Abbildungen: Carl Zeiss AG)
Der in Abbildungen 2-21(a) gezeigte Aufbau gleicht dem eines konventionellen
Lichtmikroskops. Ein dreidimensionales Bild entsteht hierbei durch das Prinzip der
strukturierte Beleuchtung: dabei wird eine Gitterstruktur in den Fluoreszenz-Strahlengang
eingebracht und somit das Gittermuster auf die Probe projeziert. Dadurch erhält die Kamera
ein mit dunklen Streifen durchzogenes Bild des Präparates. Das Bild des Gitters ist an
defokussierten Stellen des Präparates nicht sichtbar und gibt damit an, welche Bereiche für
die Bildanalyse ausgewertet werden um einen fokussierten optischen Schnitt zu erhalten.
Um die gesamte Bildinformation rechnerisch zu rekonstruieren, müssen mindestens drei
Rohbilder mit unterschiedlichen Gitterpositionen aufgenommen werden. In Abbildungen
2-21(b) wird der Aufbau eines konfokalen Mikroskops gezeigt. Hierbei gelangt durch eine
Lochblende nur Fluoreszenzlicht aus dem Fokus der angeregten Probe in das Mikroskop.
Dadurch werden Hintergrundsignale eliminiert, das Bild wird insgesamt schärfer. Eine
dreidimensionale Ansicht entsteht durch die schichtweisen Aufnahmen, die als Bilder
abgelegt werden. Der Bilderstapel kann nachher von allen Seiten betrachtet werden.
39

Grundlagen
2.9.3 Weitere Analyseverfahren
Durch die Messung des Kontaktwinkels auf einem Substrat werden die geeigneten spincoating
Parameter ermittelt
Auf einer Oberfläche (s, fest) die von einem Gas (v, gasförmig), meist Luft, umgeben ist kann
sich der Tropfen einer Flüssigkeit (l, flüssig) entweder ausbreiten oder in Tropfenform
bestehen bleiben. Ist die Adhäsion zwischen Flüssigkeit und Festsoff groß genug, so ist das
Spreiten des Tropfens energetisch günstiger als die Kohäsion in der Flüssigkeit. In Abbildung
2-22 ist der Kontaktwinkel zwischen Tropfen und Oberfläche eingezeichnet.
Abbildung 2-22: Schematische Darstellung des Kontaktwinkels θ
Im thermodynamischen Gleichgewicht gilt für einen Flüssigkeitstropfen auf einer
Festkörperoberfläche die Young-Gleichung [144]:
δ
s
= δl
⋅cos θ + γ
sl
δ s
δ l
γ sl
θ
Oberflächenspannung des Feststoffs
Oberflächenspannung der Flüssigkeit
Grenzflächenspannung Feststoff/Flüssigkeit
Kontakt-/Randwinkel
Beim Arbeiten mit wässrigen Lösungen stellt der Kontaktwinkel ein Maß für die Hydrophilie
(griechisch: Wasserliebe) einer Oberfläche dar. Für eine gute Benetzung mit Wasser bzw.
eine hydrophile Oberfläche wird ein Kontaktwinkel von unter 90° gemessen. Bei Winkeln
größer 90° spricht man von einer hydrophoben, also schlecht mit Wasser benetzbaren
Oberfläche. Die vollständige Benetzung beobachtet man bei θ = 0 (siehe Abbildung 2-23).
40

Grundlagen
θ > 90°
schlechte Benetzung
θ < 90°
gute Benetzung
θ = 0°
vollständige Benetzung
Abbildung 2-23: Benetzungsverhalten auf Oberflächen [145]
Zur korrekten Messung darf die Materialoberfläche nicht durch den Tropfen deformiert
werden. Zudem muss auf eine zügige Durchführung der Analyse geachtet werden, damit
Volumen- oder Konzentrationsänderung des Tropfens vermieden werden.
Die in der vorliegenden Arbeit angewandte Methode zur Bestimmung des Kontaktwinkels
wird statische Kontaktwinkelanalyse genannt. Dabei wird ein liegender Tropfen aufgebläht
(Fortschreitwinkel) bzw. zusammengezogen (Rückzugswinkel).
Die Schichtdicke von Hyaluronsäurefilmen auf verschiedenen Substraten wird mit Hilfe der
Quarzmikrowaage bestimmt
Werden Hyaluronsäurederivate zu einem Wasser-unlöslichen Film vernetzt, so kann die
Filmdicke mit Hilfe der Quarzmikrowaage (QCM) auf verschiedenen Substraten ermittelt
werden. Das Messprinzip der QCM beruht auf der Änderung der Frequenz und der
Dämpfung eines Quarzkristalls (gezeigt in Abbildung 2-24), der durch Wechselstrom zur
Schwingung angeregt wird.
QCM-Kristall mit
Gold-Elektroden
auf Vorder-und
Rückseite
Anregung zur Schwingung
unbeschichteter
Kristall
beschichteter
Kristall
Frequenz
Fourier
Fourier
Transformation
Zeit
Abbildung 2-24: Schema zur Erklärung des Messprinzips einer Quarzmikrowaage (angelehnt
an Darstellungen von Dr. Ilya Reviakine, Universität Baskenland)
41

Grundlagen
Die Massenänderung auf dem Kristall wird durch Adsorptions- bzw. Desorptionsprozesse
bestimmt. Unter Vakuum-Bedingungen kann beispielsweise das Schichtwachstum dünner
Filme beobachtet werden. In Lösung kann höchst effizient die Affinität zwischen Molekülen
und einer entsprechend funktionalisierten Oberfläche gemessen werden. Durch konstante
Parameter im Betriebsmodus ist eine Änderung der Frequenz und der Dämpfung direkt von
der Schichtdicke auf dem Kristall abhängig. Sobald Masse auf dem Kristall deponiert wird
lässt sich nach Sauerbrey [146] die Frequenzänderung quantifizieren und mit der
Masseänderung verknüpfen:
∆ f = −
A
2 f
ρ
2
0
∆
q
µ
q
m
f 0
∆f
∆m
A
ρ q
Resonanzfrequenz
Frequenzänderung
Masseänderung
Fläche zwischen den Elektroden
Dichte des Schwingquarzes
µ q Schermodul des Schwingquarzes
Unter der Annahme, dass ein immobilisierter Hyaluronsäurefilm im trockenen Zustand fest
ist, gleichförmig auf der Oberfläche verteilt ist und eine Frequenzänderung kleiner 2 %
aufweist, lässt sich die oben genannte Gleichung anwenden.
Zetapotenzial-Messungen geben Aufschluss über die Oberflächenladung und das Verhalten
eines Hyal-Films in Lösung
An der Grenzfläche zwischen einem Festkörper und einer umgebenden Flüssigkeit lässt sich
eine zusätzliche Größe zur Beschreibung der Oberflächenchemie bestimmen: das
Zetapotenzial. In Gegenwart wässriger Lösungen entsteht eine Oberflächenladung, wenn
Ionen an einer hydrophoben Oberfläche adsorbieren oder funktionelle Gruppen einer
hydrophilen Oberfläche dissoziieren. Verändert man den pH-Wert der wässrigen Phase, so
lässt sich durch Verschiebung des Adsorptions-Dissoziations-Gleichgewichts das chemische
Verhalten einer Oberfläche beschreiben.
Experimentell erfolgt die Bestimmung des Zetapotenzials aus der Messung des
Strömungspotenzials und des Strömungsstroms. Dabei wird eine Oberfläche einem stetig
steigenden Druck durch Überströmen mit einer wässrigen Lösung ausgesetzt. Das
auftretende Strömungspotenzial dU (alternativ der Strömungsstrom dI) hängt linear mit der
Druckdifferenz dp zusammen. Die Steigung der Geraden dU/dp bzw. dI/dp ist proportional
zum Zetapotenzial.
42

Grundlagen
Die Berechnung des Zetapotenzials ζ basiert auf der Smoluchowski-Gleichung [147]:
U s
η L 1
ζ =
∆p
ε ⋅ Q R
ε 0
ζ
U s
∆p
L und Q
η
ε und ε 0
R
Zetapotenzial
Strömungspotential
Druckdifferenz
Länge und Querschnitt des Strömungskanals
Viskosität der Lösung
Permittivität der Lösung bzw. des Vakuums
elektrischer Widerstand
Als Standardelektrolyt wird eine 1 mmol/L Lösung eines einfachen Elektrolyts (meist KCl)
verwendet, um Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit der Messungen zu gewährleisten. Da
die Oberflächenladung eines Hyaluronsäure-Films einen Einfluss auf die Anheftung von
Proteinen bzw. Zellen an das Substrat hat, kann das Zetapotenzial der Oberfläche je nach
Modifikation eine Aussage über zu beobachtende Adhäsionsprozesse liefern. Der Aufbau
des verwendeten Messapparates ist in Abbildung 2-25 dargestellt.
Abbildung 2-25: Stempelmesszelle zur Bestimmung des Zetapotenzials (Anton Paar ® )
Die Zetapotenzial-Messungen wurden am KIT, Institut für Nukleare Entsorgung, von Herrn
Dr. Johannes Lützenkirchen durchgeführt.
43

Material und Methoden
3 Material und Methoden
3.1 Methoden
3.1.1 Oberflächenbehandlungen
Glasplättchen und QCM-Goldkristalle werden vor Silanisierung der Oberfläche gereinigt.
Dazu werden die Plättchen 15 min in einer Lösung aus 5:1:1 Volumenteilen
H 2 O:NH 3 (konz):H 2 O 2 (32 %) gekocht, anschließend mit reichlich H 2 O gewaschen und danach
im Stickstoffstrom getrocknet. Zur Silanisierung werden die Plättchen 20 min in eine Lösung
aus 94 Vol% angesäuertem Methanol (1 mM Essigsäure in MeOH + 5 Vol% Wasser +
1 Vol% 3-(Aminopropyl)-trimethoxysilan) eingetaucht. Anschließend mit reichlich EtOH und
H 2 O waschen und im Stickstoffstrom trocknen.
Polymerfilme aus Polystyrol (PS) oder Polymilchsäure (PLA) werden mit N 2 -Plasma
behandelt. Für die Behandlung von Polymeren in der Plasmakammer werden folgende
Parameter gewählt:
Flow:
Pressure:
RF-Leistung:
50 sccm
266,6 Pa
150 Watt
Polymerfilme aus PS werden durch Lösen von PS in Toluol und anschließendem spincoating
hergestellt. Polymerfilme aus PLA sind kommerziell erhältlich.
3.1.2 Bildung von Hyaluronsäurefilmen und –gelen
Aufschleudern (spin-coating) zur Erzeugung dünner Filme
Die Herstellung dünner gelartiger Filme auf Oberflächen wird mittels Aufschleudern erzielt.
Dazu werden die Versuchslösungen auf ein Plättchen, das auf der Schleuder befestigt ist,
aufgebracht und bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 2500 rpm auf dem Substrat verteilt.
Sinnvolle Pipettiermengen zur Erzeugung von Schichten sind in Tabelle 3-1 aufgeführt, die
Konzentrationen der verwendeten Lösungen, die zum Aufschleudern gewählt werden, sind in
Tabelle 3-2 aufgelistet.
Tabelle 3-1: Pipettiermengen zur Beschichtung mittels spin-coating
Art des Plättchens pipettierte Menge
d = 14 mm 25 µL
d = 32 mm 65 µL
d = 47 mm 100 µL
44

Material und Methoden
Tabelle 3-2: Zusammensetzung, Mischungsverhältnisse und Konzentrationen der
aufgeschleuderten Gemische aus Hyaluronsäurederivaten und
Adhäsionsvermittlern
Hyal-Derivate (Angabe der Mischungen
in Volumenanteilen)
AAHyal oder VAHyal oder GMHyal
AAHyal oder VAHyal oder GMHyal + FKS = 2:1
AAHyal oder VAHyal oder GMHyal + FN = 2:1
AAHyal oder VAHyal oder GMHyal + PLL = 2:1
Konzentrationen
15 mg/mL
15 mg/mL + FKS
15 mg/mL + 0,1 mg/mL
15 mg/mL + 0,01 w/v
Um mittels spin-coating gleichmäßige Schichten erzeugen zu können, ist ein Gemisch aus
EtOH:H 2 O = 1:1 als Lösungsmittel zu verwenden. Alle AAHyal-Lösungen werden vor dem
spin-coating durch einen Millipore-Spritzenfilter der Porengröße 0,45 µm filtriert. Für VAHyal
und GMHyal enthält das Lösungsmittel zudem 0,1 % Irgacure 2959 (Ic) und 0,1 % N-
Vinylpyrrolidon (Vp). Das Verdünnen der Lösungen aus den kommerziell erhältlichen
Stammlösungen fötales Kälberserum (FKS), Fibronectin (FN) oder Poly-L-Lysin (PLL) erfolgt
mit H 2 O dest. Peptide werden in reinem MeOH oder Gemischen aus MeOH:H 2 O = 1:1 in
einer Konzentration von 5 % w/v gelöst, durch einen Millipore-Spritzenfilter der Porengröße
0,25 µm filtriert und entsprechend verdünnt. Bei Hyal-Protein-Mischungen wird kein Ausfällen
bzw. keine Agglomeration der Proteine durch den Ethanol-Anteil im Lösungsmittel
beobachtet.
Gele in Mikroskop-Kammern
Die Herstellung von Gelen in Kavitäten wird in Mikroskop-Kammern der Firma ibidi (siehe
Abbildung 3-1) erzielt. Dazu werden 10 µL der zu gelierenden Hyaluronsäure-Lösungen in
die Vertiefungen pipettiert und mittels UV-Bestrahlung zu einem Gel vernetzt.
Abbildung 3-1: Mikroskop-Kammer der Firma ibidi (München)
Die Konzentrationen der verwendeten Lösungen, die zur Gelbildung verwendet werden, sind
in Tabelle 3-3 aufgelistet. Alle AAHyal-Lösungen werden vor der Gelierung durch einen
Millipore-Spritzenfilter der Porengröße 0,45 µm filtriert. Für VAHyal und GMHyal enthält das
Lösungsmittel zudem 0,1 % Ic und 0,1 % Vp. Zu 50 µL der Reaktionsmischung aus ATAHyal
45

Material und Methoden
und PAHyal wird zur Gelbildung 10-40 µL einer 0,1 %igen wässrigen CuCl-Lösung
zugegeben.
Tabelle 3-3: Konzentrationen der Hyaluronsäure-Lösungen zur Hydrogelbildung und zur
Hydrogelbildung bei Anwendungen in der Zellkultur
Hyal-Derivate
AAHyal oder VAHyal oder GMHyal
ATAHyal + PAHyal
Hyal-Derivate
AAHyal oder VAHyal oder GMHyal
ATAHyal + PAHyal
AAHyal oder VAHyal oder GMHyal
+ Collagen
Konzentrationen
15 mg/mL
15 mg/0,5 mL + 15 mg/0,5 mL
Konz. bei Anwendungen in der Zellkultur
30 mg/mL
15 mg/0,5 mL + 15 mg/0,5 mL
30 mg/mL
+ 2,5mg/mL oder 1,5mg/mL oder 0,5mg/mL
Für Anwendungen in der Zellkultur:
• beträgt der Gehalt an Ic und Vp 0,2 % im Lösungsmittel, da später bei Zellzugabe
eine 1:1 Verdünnung hergestellt wird,
• wird als Lösungsmittel steriler doppelt konzentrierter HKR-PenStrep Puffer oder
steriler doppelt konzentrierter PBS-/- Puffer 4 verwendet,
• werden je 3 µL verschieden konzentrierter CuCl Lösungen zur Bildung von Click-Hyal
zugesetzt, was einer Konzentration von 0,25-0,5 % CuCl pro 10 µl (= 0,25-0,5 µmol je
Mikroskopierkammer) entspricht,
• werden die Hyal-Lösungen vor Gelierung mittels UV-Bestrahlung mit der
Zellsuspension bzw. mit reinem Nährmedium im Verhältnis 1:1 vermischt.
Die Vernetzung von Hyaluronsäurederivaten mittels Photocrosslinking (Bildung von pclHyal)
und die Photoimmobilisierung von Peptiden auf pclHyal
Mit einer Hochdruck-Quecksilberdampflampe werden photoreaktive Hyal-Derivate für 15 min
in einem Abstand von 20 cm zwischen Lichtquelle und Proben-Plättchen oder Proben-Gefäß
bestrahlt. Zusätzlich können Musterschablonen (siehe Abbildungen 3-2) aufgelegt werden,
sodass Teilbereiche (in den Abbildungen dunkelblau bzw. schwarz eingefärbt) nicht bestrahlt
werden (M1-M7 und M9 Chrom auf Glas, M8 Gold auf Glas).
4 PBS-/- entspricht PBS ohne Ca 2+ und ohne Mg 2+ 46

Material und Methoden
M8
M9
Abbildungen 3-2: Masken zur Verwendung beim Bestrahlen mit UV
Die verwendete Hochdruck-Quecksilberdampflampe hat eine Strahlungsleistung von 22-
23 mW cm -2 bei 405 nm, 11-13 mW cm -2 bei 365 nm und 0.6-0.8 mW cm -2 bei 240 nm.
In der Literatur werden unterschiedliche Bestrahlungszeiten bei unterschiedlichen
Lampenleistungen angegeben. [37, 43, 76, 77, 98, 79, 80] In dieser Arbeit konnten bei
Anwendung unterschiedlicher UV-Lampen keine signifikanten Unterschiede in der Hyal-
Filmbildung oder während der Bildung von Hydrogelen beobachtet werden.
Die Photoimmobilisierung von Peptiden auf pclHyal verläuft entsprechen dem in Abbildung
3-3 gezeigten Schema.
47

Material und Methoden
Abbildung 3-3: Schematische Darstellung der Reihenfolge zur Immobilisierung und
Strukturierung photoreaktiver Peptide auf pclHyal
Nach allen Prozessen des Photocrosslinkings wird zur Entfernung unvernetzter Hyal-
Derivate oder überschüssiger Peptide ein Wasch-Schritt durchgeführt. Dabei wird das
Substrat für mindestens 10 min in H 2 O dest getaucht. Das Waschen der Substrate im
Ultraschallbad führt in manchen Fällen zum Ablösen der pclHyal-Schichten und ist daher
nicht zu empfehlen.
Peptid-Immobilisierung mittels Mikro-Kontakt-Stempeln auf pclHyal
Stempelherstellung: Zunächst wird das Silikon-Elastomer laut Herstellerangabe durch
Mischen mit dem Härter im Verhältnis 10:1 angerührt. Man gießt die PDMS-Mischung in eine
Petrischale, entfernt Gasblasen aus der Lösung durch das Anlegen von Vakuum (5 min) und
lässt das Silikon für 3 h bei 60°C aushärten. Nach dem Schneiden des Silikons in
entsprechend dimensionierte Stempel, wird die untere Seite des PDMS, die während des
Aushärtens in Kontakt mit der Petrischale war, zum Stempeln von Peptidlösungen
verwendet.
Peptidimmobilisierung: Dazu wird der Stempel mit Peptidlösung benetzt und diese durch
mehrfaches Abstempeln auf die gewünschte pclHyal-Oberfläche aufgebracht. Der
Stempelabdruck funktioniert durch einen geringen Anpressdruck über 30 s. Anschließend
wird die Probe UV-belichtet, sodass das Peptid photochemisch auf dem bereits vernetzten
Hyal-Derivat angebunden wird. Anschließend wird ein Wasch-Schritt durchgführt, um
überschüssiges Peptid zu entfernen.
48

Material und Methoden
3.1.3 SMART-Prozess: das Mikrothermoformen Hyaluronsäure-beschichteter PLA-
Substrate
In diesem Abschnitt wird das SMART-Verfahren zur Verformung eines Polymers unter
Beibehaltung seiner Oberflächenmodifizierung erläutert.
Zunächst wird die PLA-Folie auf einem Formwerkzeug mit Hilfe eines bioverträglichen
Klebstoffs fixiert, um ein Verschieben der Folie während des Formprozesses zu vermeiden.
Bei dem Formwerkzeug handelt es sich um eine mikrostrukturierte Messingplatte mit 25 x 25
gefrästen Löchern, die einen Durchmesser von 350 µm aufweisen (siehe Abbildung 3-4). Die
Dicke der Messingplatte entspricht der maximal möglichen Tiefe von 300 µm für PLA-
Mikrokavitäten, wie sie beim Thermoformprozess erzeugt werden können.
Abbildung 3-4: Das Formwerkzeug ist eine 300 µm dicke Messingplatte mit einer Größe von
50 x 50 mm 2 und gefrästen Löchern in einem Bereich von 10 x 10 mm
Die Verwendung des vorgestellten Formwerkzeugs bietet die Möglichkeit, dessen Muster
genau entlang dem Muster einer Photomaske auszurichten, sodass vor dem
Thermoformprozess ortspezifisch VAHyal photoimmobilisiert werden kann. Die Reihenfolge
der Behandlung einer PLA-Folie zur Beschichtung und zum Mikrothermoformens ist
schematisch in Abbildung 3-5 dargestellt.
49

Material und Methoden
Abbildung 3-5: Die Bearbeitung des PLA-Films umfasst N 2 -Plasma Behandlung, VAHyal
spin-coating, UV-Bestrahlung durch eine Maske, Muster-Entwicklung und
Mikrothermoformen
Der eigentliche Prozess des Mikrothermoformens wird auf einer Heißprägemaschine
durchgeführt. Wie in Abbildung 3-6 gezeigt, wird das Formwerkzeug mit dem Polymerfilm
zwischen zwei polierten Messingplatten eingesetzt, so dass die pclVAHyal-Fläche auf der
PLA-Folie nach unten in Richtung der Gaseinlässe zeigt. Nach dem Schließen und
Evakuieren der Prägemaschine wird der Aufbau auf 60°C erhitzt. Bei dieser Temperatur ist
das mechanische Verformen ohne Zerstörung der PLA-Polymerstruktur möglich. Durch das
Anlegen von 2-3 MPa über das Gegenwerkzeug wird die aufgeweichte PLA-Folie in die
Vertiefungen zwischen Formwerkzeug und Messingplatte gepresst. Nach dem Abkühlen der
Prägemaschine kann der thermogeformte Film mit Hilfe eines Skalpells vom Formwerkzeug
abgelöst werden. Die Einformtiefe variiert je nach angelegtem Druck zwischen 90-200 µm.
50

Material und Methoden
Abbildung 3-6: Der Thermoform-Prozess wird in einer Heißprägemaschine zwischen zwei
Hochglanz-Messingplatten durchgeführt
3.2 Synthesen der Hyaluronsäure-Derivate
3.2.1 Darstellung von AAHyal [43]
N 3
*
Na
O O OH
HO
O
O
O
O
HO OH NH
O
*
n
+
N 3
NH 2
a) EDC
b) EDC + NHS
c) EDC + sNHS
H 2 O, pH 7
4°C, 24 h
*
O NH OH
HO
O O
O
O
HO OH NH
O
*
n
Natriumhyaluronan (100 mg, 0,25 mmol) und 4-Azidoanilin (85 mg, 0,5 mmol) werden in ca.
20 mL H 2 O dest gelöst.
Syntheseweg a:
Dazu gibt man EDC (96 mg, 0,5 mmol) und stellt mit 0.1 N NaOH die Lösung auf pH 7 ein.
Anschließend wird für 24 h bei 4°C im Dunklen gerührt.
Syntheseweg b:
Dazu gibt man EDC (96 mg, 0,5 mmol) sowie NHS (58 mg, 0,5 mmol) und stellt mit 0.1 N
NaOH die Lösung auf pH 7 ein. Anschließend wird für 24 h bei 4°C im Dunkeln gerührt.
Syntheseweg c:
Dazu gibt man EDC (96 mg, 0,5 mmol) sowie sNHS (109 mg, 0,5 mmol) und stellt mit 0.1 N
NaOH die Lösung auf pH 7 ein. Anschließend wird für 24 h bei 4°C im Dunkeln gerührt.
Syntheseweg a, b und c:
Die Reaktionslösung wird 48 h gegen H 2 O dest dialysiert, in Falcon-Tubes überführt und
schließlich lyophilisiert.
51

Material und Methoden
Ausbeute bzw. Modifzierungsgrad:
Mittels UV/Vis Spektroskopie wird der Gehalt an gebundenem 4-Azidoanilin (AA) bestimmt.
Dazu wird die Absorption äquimolarer Lösungen (c = 0,04 µmol) aus AA bzw. AAHyal
bestimmt. Die Anbindung des 4-Azidoanilin kann zudem im 1 H-NMR nachgewiesen werden.
1 H-NMR (600 MHz, D 2 O, 25°C) δ = 7.58 (m, 1H, H-Aromat), 7.29 (m, 1H, H-Aromat),
7.20-7.09 (m, 2H, H-Aromat), 4.54-4.46 (m, 2H, OH-CH 2 -), 3.83-3.10 (m, 10H,
H-Polysaccharid), 2.02 (s, 3H, CH 3 -).
3.2.2 Darstellung von VAHyal [98]
*
Na
O O OH
HO
O
O
O
O
HO OH NH
O
*
n
+
NH 2
EDC
O NH OH
PBS, pH 3
HO
4°C, 24 h O O
* O
O
HO OH NH
O
*
n
Natriumhyaluronan (100 mg, 0,25 mmol) werden in 100 mL PBS-/- gelöst. Man gibt EDC
(96 mg, 0,5 mmol) zu, rührt für 15 min und stellt dann den pH-Wert der Reaktionslösung mit
1 N HCl auf 3 ein. Nach der Zugabe von 4-Vinylanilin (VA) (120 µL, 1 mmol) wird für 24 h bei
4°C gerührt. Die Reaktionslösung wird 48 h gegen H 2 O dest dialysiert, in Falcon-Tubes
überführt und schließlich lyophilisiert.
Mittels UV/Vis Spektroskopie wird der Gehalt an gebundenem VA bestimmt. Dazu wird die
Absorption von Lösungen aus VA (c = 0,04 nmol) bzw. VAHyal (c = 0,04 µmol) bestimmt. Die
Anbindung des 4-Vinylanilins kann zudem im 1 H-NMR nachgewiesen werden.
1 H-NMR (250 MHz, D 2 O, 25°C) δ = 7.49 (m, 4H, H-Aromat), 6.75 (m, 1H, Vinyl-CH-),
5.22 (m, 1H, Vinyl-CH 2 -), 4.56 (m, 2H, OH-CH 2 -), 3.63-3.41 (m, 10H, H-
Polysaccharid), 1.93 (s, 3H, CH 3 -).
52

Material und Methoden
3.2.3 Darstellung von ATAHyal [95]
N 3
O
N 3
O
*
Na
O O OH
HO
O
O
O
O
HO OH NH
O
*
n
+
O
O
O
H 2 N
O
EDC, NHS
O NH OH
MES, pH 4
HO
4°C, 24 h O
* O
O
O
HO OH NH
O
*
n
Zu Natriumhyaluronan (100 mg, 0,25 mmol) gelöst in 4 mL MES wird 11-Azido-3,6,9-
trioxaundecan-1-amin (385 µL, 1,94 mmol) pipettiert. Nach Zugabe von EDC (239 mg,
1,25 mmol) und NHS (144 mg, 1,25 mmol) wird für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Die
Reaktionslösung wird dann 24 h lang gegen eine gesättigte NaCl-Lösung dialysiert,
anschließend für 5 Tage gegen H 2 O. Man erhält das Produkt nach Lyophilisation als weißen
Feststoff.
Die Anbindung von 11-Azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amin kann über 1 H-NMR nachgewiesen
werden.
1 H-NMR (250 MHz, D 2 O, 25°C) δ = 4.56 (m, 2H, OH-CH 2 -), 3.79-3.27 (m, 24H, H-
Polysaccharid und H-Trioxaundecan), 2.62 (m, 1H, -CH 2 -N 3 ), 2.39 (m, 1H, -
CH 2 -N 3 ), 1.98 (s, 3H, CH 3 -).
3.2.4 Darstellung von PAHyal [95]
*
Na
O O OH
HO
O
O
O
O
HO OH NH
O
*
n
+
EDC, NHS
O NH OH
MES, pH 4
HO
4°C, 24 h O O
* O
O
HO OH NH
NH 2
53
O
*
n

Material und Methoden
Zu Natriumhyaluronan (100 mg, 0,25 mmol) gelöst in 4 mL MES wird Propargylamin (122 µL,
1,78 µmol) pipettiert. Nach Zugabe von EDC (239 mg, 1,25 mmol) und NHS (144 mg,
1,25 mmol) wird für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wird dann 24 h
lang gegen eine gesättigte NaCl-Lösung dialysiert, anschließend für 5 Tage gegen H 2 O. Man
erhält das Produkt nach Lyophilisation als weißen Feststoff.
Die Anbindung von Propargylamin kann über 1 H-NMR nachgewiesen werden.
1 H-NMR (250 MHz, D 2 O, 25°C) δ = 4.56 (m, 2H, OH-CH 2 -), 3.97-3.32 (m, 12H, H-
Polysaccharid und –NH-CH 2 ), 2.58 (m, 1H, -C≡CH), 1.98 (s, 3H, CH 3 -).
3.2.5 Darstellung von GMHyal
*
Na
O O OH
HO
O
O
O
O
HO OH NH
O
*
n
+
O
O
O
a, d, e) NEt 3 , Bu 4 NBr
b) pH = 8
c) pH = 8
a) 25 °C, 12 h
60 °C, 1 h
b) 4°C, 24 h
c) 0°C, 12 h
d) 25°C, 24 h
e) 25°C, 5d
*
O
O
Na
O O O
HO
O
O
O
O
HO OH NH
O
*
n
Syntheseweg a:[37]
Zu Natriumhyaluronan (50 mg, 0,13 mol) gelöst in 5 mL H 2 O, werden nacheinander NEt 3
(0,15 mL, 1,08 mol), GMA (0,15 mL, 1,13 mol), tBu 4 NBr (110,0 mg, 0,34 mol) gegeben und
über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird die Reaktionslösung 1 h lang auf 65°C
erhitzt und noch lauwarm auf das 20ig-fache Volumen an Aceton (20 mL) gegossen. Es
bildet sich ein weißer Niederschlag, der abfiltriert werden kann. Beim Versuch, den
Niederschlag noch zweimal mit H 2 O zu waschen, bildet sich ein fester weißer Brocken, der
sich nicht mehr in wässrigen Lösungsmitteln löst. Das Lösungsmittel wird am
Rotationsverdampfer entfernt und das Produkt lyophilisiert.
Syntheseweg b:[77]
Natriumhyaluronan (100 mg, 0,25 mmol) werden in 5 mL H 2 O dest gelöst. GMA (0,67 ml,
4,98 mmol) wird hinzu pipettiert und die Lösung mit 0.1 N NaOH auf pH 8 eingestellt. Es wird
über Nacht bei 4°C gerührt, anschließend auf EtOH gegossen. Es bildet sich ein weißer
Niederschlag, der abfiltriert wird und mit EtOH gewaschen wird. Das Produkt wird im
Exsikkator getrocknet.
Syntheseweg c:[76]
Natriumhyaluronan (30 mg, 0,08 mmol) wird in 3 mL H 2 O dest. gelöst und mit 0.1 N NaOH
wird auf pH 8 eingestellt. Nach Zugabe von GMA (0,02 mL, 1,51 mmol) wird über Nacht auf
Eis gerührt. Anschließend wird das Produkt gegen H 2 O dest für 48 h dialysiert und danach
gefriergetrocknet.
54

Material und Methoden
Syntheseweg d:[81]
Zu Natriumhyaluronan (100 mg, 0,25 mmol) gelöst in 10 mL H 2 O dest gelöst und mit dem
20ig-fachen Überschuss an GMA (0,67 mL, 4,98 mmol) versetzt. Zudem gibt man NEt 3
(6,96 µL, 0,05 mmol) und tBu 4 NBr (16,0 mg, 0,05 mmol) hinzu und rührt bei Raumtemperatur
für 24 h. Anschließend wird das Produkt zunächst gegen 0.1 M NaCl-Lösung für 24 h,
anschließend gegen H 2 O dest für 48 h dialysiert und anschließend lyophilisiert.
Syntheseweg e:[80]
Natriumhyaluronan (200 mg, 0,5mmol) wird in 40 mL PBS-/- und 14 mL DMF gelöst. Nach
Zugabe von GMA (2,47 mL, 18,7 mmol) und NEt 3 (1,84 mL, 13,2 mmol) wird für 5 Tage bei
Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wird auf das 20ig-fache Volumen an Aceton
gegossen; ein weißer Niederschlag fällt aus. Dieser wird abfiltriert und der feste weiße
Rückstand wird im Trockenschrank bei 50°C getrocknet. Anschließend wird das Produkt in
H 2 O dest gelöst, für 72 h gegen H 2 O dest. dialysiert und schließlich lyophilisiert.
Die Anbindung von Glycidylmethacrylat kann über 1 H-NMR nachgewiesen werden.
1 H-NMR (600 MHz, D 2 O, 25°C) δ = 6.18 (m, 1H, =CH 2 ), 5.74 (m, 1H, =CH 2 ), 4.55-4.46
(m, 2H, OH-CH 2 -), 3.83-3.34 (m, 10H, H-Polysaccharid, 2.02 (s, 3H, CH 3 -),
1.94 (m, 1H, -CH).
3.2.6 Darstellung von MAHyal
*
Na
O O OH
HO
O
O
O
O
HO OH NH
O
*
n
+
O
O
O
a) 1%ige Lsg., pH = 8
b) 2%ige Lsg., pH = 8
a) auf Eis, 24 h, Dialyse
b) 4°C, 24 h,
mit EtOH fällen
*
O
O
Na
O O O
HO
O
O
O
O
HO OH NH
O
*
n
Syntheseweg a:[76]
Natriumhyaluronan (500,0 mg, 1,25 mmol) wird in 45 mL H 2 O dest gelöst und mit 0.1 N
NaOH wird auf pH-Wert von 8 eingestellt. Nach der Zugabe von Methacrylsäureanhydrid
(3,7 mL, 25,0 mmol) wird für 24 h auf Eis gerührt. Anschließend wird das Produkt gegen H 2 O
dest für 48 h dialysiert und danach gefriergetrocknet.
Syntheseweg b:[77]
Natriumhyaluronan (500,0 mg, 1,25 mmol) wird in 20 mL H 2 O dest gelöst und mit 0.1 N
NaOH wird ein pH-Wert von 8 eingestellt. Nach der Zugabe von Methacrylsäureanhydrid
(3,7 mL, 25,0 mmol) wird für 24 h bei 4°C gerührt. Das Produkt wird anschließend mit EtOH
ausgefällt, mit EtOH gewaschen und danach im Exsikkator getrocknet.
55

Material und Methoden
Die Anbindung von Methacrylsäureanhydrid kann nicht über 1 H-NMR nachgewiesen werden.
3.2.7 Darstellung von GMHyal und MAHyal mit Hyal (MW 50; 350; 1100 kDa)
Je 50 mg Hyaluronan (0,125 mmol) werden in 5 mL H 2 O dest gelöst. Einzig der pH-Wert der
verwendeten Lösungen wird nicht justiert, da die Lösungen hochviskos sind. Eine
Überprüfung zeigt jedoch pH-Werte von 8,67 (50 kDa) und 9,08 (350 kDa) und 8,55 (1100
kDa).
GMHyal: Es wird zu jeder Hyal-Lösung GMA (496 µL, 3,75 mmol) pipettiert.
MAHyal: Es wird zu jeder Hyal-Lösung MA (556 µL, 3,75 mmol) pipettiert
Die Reaktionslösungen werden bei 4°C über Nacht gerührt, anschließend gegen H 2 O dest.
dialysiert und schließlich die Produkte lyophilisiert.
3.3 Synthesen der Peptid-Derivate
3.3.1 Darstellung von Ahx 3 [148]
H 2 N
O
H
N
O
N
H
O
OH
Harzbeladung:
Die Durchführung erfolgt wie in Anhang B beschrieben.
Tabelle 3-4: Harzbeladung in 5 mL NMP
TCP (1,55 mmol/g) 500,0 mg 0.75 mmol
Fmoc-ε-Ahx-OH 603,0 mg 1,70 mmol 2.2 eq zum Harz
DIEA 1,131 mL 6,82 mmol 4.0 eq zur AS
Aminosäure-Kopplungen:
Die Durchführung erfolgt wie in Anhang B beschrieben.
Tabelle 3-5: Sequentielle Synthese in 3 mL DMF:NMP = 1:1
Fmoc-ε-Ahx-TCP (0,346 mmol/g) 350,0 mg 0,12 mmol
Fmoc-ε-Ahx-OH 90,10 mg 0,25 mmol 2.1 eq zum Harz
HOBt 32,72 mg 0,24 mmol 2.0 eq zum Harz
HBTU 87,27 mg 0,23 mmol 1.9 eq zum Harz
DIEA 80,3 µL 0,48 mmol 2.0 eq zur AS
56

Material und Methoden
Die Abspaltung des Reaktionsproduktes vom Trägermaterial erfolgt wie in Anhang B
beschrieben mit TFA.
Massenspektrum:
(m/z) 580 (M+Fmoc)
3.3.2 Darstellung von AZB-Ahx 3
O
N 3
O O
N
O
+
H
N
H
O
3
DMF
25°C, 2h
O
N
H
O
3
N 3
Die Synthese wird an der Festphase durchgeführt. AZB-NHS (35,6 mg, 0,14 mmol) und EDC
(78,4 mg, 0,41 mmol) werden in 1 mL DMSO:H2O = 1:1 aufgeschlämmt (es erfolgt keine
vollständige Lösung) und zu Fmoc-entschütztem Ahx 3 gebunden an TCP-Harz (100 mg,
0,1 mmol) gegeben. Man lässt für 2 h reagieren und wäscht anschließend dreimal mit dem
Lösungsmittelgemisch nach. Die Abspaltung des Produktes vom Harz erfolgt wie unter
Kapitel xy beschrieben mit TFA.
Massenspektrum: (m/z) 503.3 (M+H + )
3.3.3 Darstellung von VIB-Ahx 3
O
O
N
O
O
+
H
N
H
O
3
DMF
25°C, 2h
O
N
H
O
3
Die Synthese wird an der Festphase durchgeführt. VIB-NHS (34,3 mg, 0,14 mmol) wird in
1 mL DMF gelöst und zu Fmoc-entschütztem Ahx 3 gebunden an TCP-Harz (100 mg,
0,1 mmol) gegeben. Man lässt für 2 h reagieren und wäscht anschließend dreimal mit DMF
nach. Die Abspaltung des Produktes vom Harz erfolgt wie unter Kapitel xy beschrieben mit
TFA.
Massenspektrum: (m/z) 488.3 (M+H + )
57

Material und Methoden
3.3.3.1 Darstellung von N-((4-Azidobenzoyl)oxy)succinimid [149]
N 3
N 3
+
O
O
OH
HO
N
O
THF, DCC
25°C, 12 h
O
O
N
O
O
Die Reaktion wird im Dunkeln durchgeführt. Zu einer Lösung aus 4-Azidobenzoesäure
(4,79 g, 29,36 mmol) und NHS (3,72 g, 32,32 mmol) in 75 mL THF wird über 3 h unter
Eiskühlung eine Lösung aus DCC (6,67 g, 32,33 mmol) in 25 mL THF zugetropft. Es bildet
sich ein weißlicher Niederschlag. Man lässt das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmen
und rührt über Nacht. Der Rückstand wird abfiltriert und das Filtrat am Rotationsverdampfer
eingeengt. Das Produkt wird aus Isopropylalkohol/Isopropylether = 1:1 umkristallisiert. Man
erhält ein hellrosa gefärbtes Pulver, Ausbeute: 3,90 g (51 %).
1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3 , 25 °C) δ = 8.06 (m, 2H, H-Aromat), 7.31 (m, 2H, H-Aromat),
2.85 (m, 4H, -CH 2 CH 2 -).
3.3.3.2 Darstellung von N-((4-Vinylbenzoyl)oxy)succinimid
O
O
OH
+
HO
N
O
THF, DCC
0-25°C, 12 h
O
O
N
O
O
Zu einer Lösung aus 4-Vinylbenzoesäure (1,0 g, 6,75 mmol) und NHS (0,87 g, 7,56 mmol) in
20 mL THF wird über 45 min unter Eiskühlung eine Lösung aus DCC (1,55 g, 7,52 mmol) in
6 mL THF zugetropft. Danach lässt man die Reaktionslösung auf Raumtemperatur erwärmen
und rührt über Nacht. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer entfernt und
säulenchromatographisch aufgereinigt (Eluens Ethylacetat:Pentan = 1:1). Man erhält ein
weißes Pulver, Ausbeute: 1,63 g (98 %).
1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3 , 25 °C) δ = 8.09 (m, 2H, H-Aromat), 7.53 (m, 2H, H-Aromat),
6.82-6.72 (m, 1H, H-Vinyl), 5.93 (m, 1H, H-cis), 5.46 (m, 1H, H-trans), 2.91 (m,
4H, -CH 2 CH 2 -).
58

Material und Methoden
3.3.4 Darstellung linearer Peptide
GGGR(Pbf)GD(tBu)S(Mtr)P-TCP bzw. GGGR(Pbf)D(tBu)GS(Mtr)P-TCP
An der Festphase (TCP) wird am automatischen Peptid-Synthesizer mittels Fmoc-Strategie
die Aminosäuresequenz GGGRGDSP bzw. GGGRDGSP hergestellt.
Massenspektrum: (m/z) 702.4 (M+H + )
Darstellung von AZB-GGGRGDSP bzw. AZB-GGGRDGSP
N 3
O
O N
O
O
+ GGGR(Pbf)GD(tBu)GS(Mtr)P
1) DMF, 25 °C, 3 h
2) cleavage (TFA)
N 3
GGGRGDGSP
Das Peptid wird nicht zuvor vom Harz abgespalten, stattdessen wird das Peptid Fmocentschützt.
Anschließend lässt man das Harz 15 min in DMF quellen, entfernt das
Lösungsmittel wieder und gibt 1,5 Äquivalente AZB-NHS hinzu (ausgehend von einer
Harzbeladung mit 1 mmol/g). Nach einer Reaktionszeit von 3 h wird das Produkt mit TFA
vom Harz abgespalten und dabei vollständig entschützt.
O
Massenspektrum: (m/z) 847.5 (M+H + )
Darstellung von VIB-GGGRGDSP bzw. VIB-GGGRDGSP
O
O N
O
O
+ GGGR(Pbf)GD(tBu)GS(Mtr)P
1) DMF, 25 °C, 3 h
2) cleavage (TFA)
GGGRGDGSP
Das Peptid wird nicht zuvor vom Harz abgespalten, stattdessen wird das Peptid Fmocentschützt.
Anschließend lässt man das Harz 15 min in DMF quellen, entfernt das
Lösungsmittel wieder und gibt 1,5 Äquivalente VIB-NHS hinzu (ausgehend von einer
Harzbeladung mit 1 mmol/g). Nach einer Reaktionszeit von 3 h wird das Produkt mit TFA
vom Harz abgespalten und dabei vollständig entschützt.
O
Massenspektrum: (m/z) 832.4 (M+H + )
59

Material und Methoden
3.3.5 Darstellung zyklischer Peptide
Zyklo[R(Pbf)GD(tBu)fK(Dde)]
O
HN
O NH
S NH
O
O
O HN
HN
O O
NH
O
O
NH
O
H
N
O
N
H
O
Das lineare Peptid Fmoc-Asp(tBu)-D-Phe-Lys(Dde)-Arg(Pbf)-Gly-OH wird mittels Fmoc-
SPPS auf TCP-Harz am Peptid-Synthesizer hergestellt. Das Abspalten des Trägermaterials
erfolgt mit dem in Kapitel xy vorgestellten HFIP-cleavage cocktail. Die Zyklisierung erfolgt in
stark verdünnter Lösung (100 mg Peptid in 200 mL DCM:DMF = 1:1) mit den in 0,5 mL DMF
gelösten Kopplungsreagenzien HOBt (1.2 eq) und DIC (1.2 eq). Nach 5 Tagen Rühren bei
Raumtemperatur wird die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt und schließlich das
Lösungsmittel abdestilliert. Das Produkt wird in AN:H 2 O = 1:1 erneut gelöst und lyophilisiert.
Massenspektrum:
(m/z) 1076.7 (M)
Selektives Entfernen der Schutzgruppe Dde
Zu dem zyklische Peptid (R(Pbf)GD(tBu)fK(Dde) wird eine Lösung aus 2 % Hydrazin-Hydrat
in DMF gegeben. Nach 10 min ist das Produkt vollständig Dde-entschützt. Für die
Aufarbeitung wird zur Reaktionslösung das 10-fache Volumen H 2 O dest. gegeben. Man
schüttelt mehrmals mit Essigsäureethylester aus und erhält das Produkt in der organischen
Phase. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer entfernt und das Peptid in
AN:H 2 O = 1:1 erneut gelöst und lyophilisiert.
Massenspektrum: (m/z) 912.5 (M+H + )
Darstellung von AZB-Ahx 3 -zyklo[RGDfK]
NH 2
O
HN
O
N
H
O
H
N
O
N
H
HN NH
O H
N
HN
O
N 3
60
HN
O
NH
O
O
NH
O
OH

Material und Methoden
Syntheseweg a: [102]
Das Zyklopeptid (24,5 mg, 0,027 mmol) wird in 165 µL DMF bei Zugabe von 1 mol
Äquivalent 2,3,5-Collidin gelöst und für 30 min gerührt. Der Linker Azido-Ahx 3 (13,5 mg,
0,027 mmol) wird ebenfalls in 165 µL DMF gelöst bei Zugabe von 1 mol Äquivalent 2,3,5-
Collidin, 1.2 mol Äquivalenten HATU und 1.2mol Äquivalenten HOAT, diese Reaktionslösung
wird für 10 min auf Eis gerührt. Beide Reaktionslösungen werden anschließend vereinigt. Die
Reaktionskontrolle erfolgt mittels LC-MS.
Syntheseweg b:
Das Zyklopeptid (30,1 mg, 0,033 mmol) wird in 198 µL DMF gelöst bei Zugabe von 1 mol
Äquivalent DIC gelöst und für 30 min gerührt. Der Linker Azido-Ahx 3 (16,6 mg, 0,033 mmol)
wird ebenfalls in 198 µL DMF gelöst bei Zugabe von 1 mol Äquivalent DIC, 1.2 mol
Äquivalenten HOBt, diese Reaktionslösung wird für 10 min auf Eis gerührt. Beide
Reaktionslösungen werden anschließend vereinigt. Die Reaktionskontrolle erfolgt mittels LC-
MS.
Syntheseweg c:
Das Zyklopeptid (20,1 mg, 0,022 mmol) wird in 250 µL DCM gelöst bei Zugabe von 1 mol
Äquivalent 2,3,5-Collidin gelöst und für 30 min gerührt. Der Linker Azido-Ahx 3 (13,7 mg,
0,027 mmol) wird ebenfalls in 250 µL DCM gelöst bei Zugabe von 1 mol Äquivalent 2,3,5-
Collidin, 2 mol Äquivalenten TFFH diese Reaktionslösung wird für 10 min auf Eis gerührt.
Beide Reaktionslösungen werden anschließend vereinigt. Die Reaktionskontrolle erfolgt
mittels LC-MS.
Massenspektrum: (m/z) 1088.8 (M+H + )
Darstellung von VIB-Ahx 3 -zyklo[RGDfK]
NH 2
O
HN
O
N
H
O
H
N
O
N
H
HN
NH
O
H
N
HN
O
HN
O
O
O
NH
NH
O
OH
Das Zyklopeptid (30,8 mg, 0,034 mmol) wird in 770 µL DMF gelöst bei Zugabe von 1 mol
Äquivalent DIC gelöst und für 30 min gerührt. Der Linker Azido-Ahx 3 (16,6 mg, 0,034 mmol)
wird in 415 µL DMF gelöst bei Zugabe von 1 mol Äquivalent DIC, 1.2 mol Äquivalenten
HOBt, diese Reaktionslösung wird für 10 min auf Eis gerührt. Beide Reaktionslösungen
werden anschließend vereinigt. Die Reaktionskontrolle erfolgt mittels LC-MS.
Massenspektrum: (m/z) 1073.9 (M+H + )
61

Material und Methoden
3.4 Zellkulturversuche
3.4.1 L929 Zellen auf pclHyal-Substraten, pclHyal/Peptid-Substraten
Beschichtete Substrate (Glasplättchen oder Polystyrol, d = 32 mm) werden in Bakterien-
Petrischalen mit 500000 Zellen in 3 mL Nährmedium inkubiert. Je nach Zelldichte muss
täglich ein vollständiger Mediumwechsel erfolgen. Nach Inkubationszeiten von 2-5 Tagen
wird das Adhäsionsverhalten durch Anfärben mit Kristallviolett oder May-Grünwalds Lösung
unter dem Mikroskop beobachtet.
3.4.2 HepG2-Zellen auf pclVAHyal/PLL-PLA
PLA-Folien (d = 47 mm) werden entsprechend beschichtet, gegebenenfalls thermogeformt
und vor der Besiedelung mit Zellen durch eine Alkohol-Wasser-PBS-/- Reihe sterilisiert.
Nach dem Auflegen eines Silikonringes, der das Aufschwimmen der beschichteten PLA-Folie
in der Bakterien-Petrischale verhindert, wird über Nacht in Nährmedium vor-inkubiert. Vor
dem Absaugen des Mediums werden in den thermogeformten Kavitäten mit Hilfe einer
Pipette die Luftblasen entfernt und 0,5-1 Mio Zellen in 300 µL Nährmedium nur über den
Kavitäten verteilt. Nach dem Absitzenlassen der Zellen (ca. 2-3 h) wird mit Nährmedium
aufgefüllt und je nach Zelldichte alle 2-3 Tage ein vollständiger Mediumwechsel
durchgeführt. Nach Inkubationszeiten von 2-5 Tagen wird das Adhäsionsverhalten durch
Anfärben mit Kristallviolett, May-Grünwalds Lösung oder Vitalfarbstoffen unter dem
Mikroskop beobachtet.
3.4.3 EOMA-Zellen und Hela-Zellen in pclHyal-Hydrogelen
Entsprechend hergestellte Hyal-Stammlösungen und Zell-Stammlösungen (siehe Kapitel
3.1.2 und Anhang B) werden im Verhältnis 1:1 vermengt und zügig in die Kavitäten der ibidi-
Mikroskop-Kammern pipettiert. Die UV-Bestrahlung für 15 min im Abstand von 20 cm erfolgt
ohne ibidi-Kammer-Deckel. Anschließend werden die Hyal-Zell-Gele mit 50 µL Kulturmedium
überschichtet, mit dem Kammer-Deckel verschlossen und im Brutschrank auf Petrischalen
gesetzt, die steriles Wasser enthalten, um eine optimale Feuchtigkeitsversorgung zu
gewährleisten (siehe Abbildung 3-7).
H 2 O
A
B
C
Abbildung 3-7: Kultivierung von Zellen in Hyal-Gelen in Mikroskop-Kammern (Draufsicht)
62

Material und Methoden
Für Zelle in Gelen, die via Click-Chemie erzeugt werden, werden zunächst ATAHyal und
PAHyal in sterilem HKR-PenStrep gemischt, dann im Verhältnis 1:1 mit den
Zellstammlösungen vermengt, in die Mikroskop-Kammern pipettiert und zuletzt je Kavität
3 µL einer 0,5 %igen wässrigen CuCl-Lösung hinzu pipettiert.
Nach Inkubationszeiten von 1-3 Tagen wird die Zellvitalität durch Anfärben mit den
Vitalfarbstoffen PI, CalceinAM und Alexa 488 überprüft, wie in Anhang B beschrieben.
3.4.4 Zellen in Collagen-Gelen
Zur vergleichenden Beobachtung von Zellen in Hydrogelen werden Zellen ebenfalls in
Collagen-Gelen kultiviert. Alle Arbeiten sind auf Eis durchzuführen, da die Viskosität von
Collagenen mit der Temperatur abnimmt. Es werden Stammlösungen aus Collagen
hergestellt. Dazu werden 588 µL steriles H 2 O mit 100 µL 10fach konzentriertem minimal
essential medium (MEM) -Medium, 12 µL NaOH und 300 µL einer Collagen-Lösung
(2,5 mg/mL) gemischt. Diese Stammlösung wird mit der Zellstammlösung im Verhältnis 9:1
gemischt, das Ausgelieren erfolgt im Inkubator bei 37°C.
63

Ergebnisse und Diskussion
4 Ergebnisse und Diskussion
4.1 Kopplungsprodukte der Hyaluronsäure
4.1.1 Die Synthesen von AAHyal und VAHyal wurden gewählt, um photoaktivierbare
Gruppen an Hyaluronsäure zu binden
Die Reaktion zur Bildung von AAHyal führtne sowohl mit EDC als auch mit EDC + sNHS und
EDC + NHS zum gewünschten Produkt. Untersuchungen mit UV/Vis zeigten allerdings, dass
nicht alle Carboxylgruppen der Hyaluronsäure mit AA umgesetzt werden konnten. In
Diagramme 4-1 (links) sind die UV/Vis Spektren wässriger Lösungen (c = 40 nmol) aus AA,
AAHyal (mittels EDC+NHS), AAHyal (mittels EDC+sNHS), AAHyal (mittels EDC) sowie Hyal
(keine Absorptionsbande) dargestellt. Die rot-Verschiebung der Absorption für den
Azidophenylrest im AAHyal gegenüber der Absorption für 4-Azidoanilin kann auf eine
Elektronendelokalisation durch die Amidbindung zurückgeführt werden. Unter der Annahme,
dass der Absorptionskoeffizient für den Azidophenylrest im AAHyal-Disaccharid bei 264 nm
dem des reinen 4-Azidoanlin bei 256 nm entspricht, konnte der Gehalt an Azidophenyl im
Polymer bestimmt werden.
Absorption [%]
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
Hyal 40 nmol
AA 40 nmol
AAHyal 40 nmol
via EDC
AAHyal 40 nmol
via EDC+NHS
AAHyal 40 nmol
via EDC+sNHS
Absorption[%]
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
Hyal 40 nmol
VA 0,04 nmol
VAHyal 40 nmol
0,1
0,1
0,0
200 250 300 350 400
λ [nm]
0,0
200 250 300 350 400
λ [nm]
Diagramme 4-1: Graphische Darstellung der Absorption im UV/Vis als Maß für den
Modifizierungsgrad von Hyal mit 4-Azidoanilin (links) oder 4-Vinylanilin (rechts)
Zur Berechnung der prozentualen Umsetzung der Carboxylgruppen der Hyaluronsäure mit
AA nutzt man das Verhältnis aus der Absorption für reines 4-Azidoanilin zur Absorption für
die gewonnenen AAHyal-Produkte. Für die Reaktion mit EDC+NHS als
Kopplungsreagenzien erfolgte eine Anbindung von 44 % AA im Hyal-Molekül, für
EDC+sNHS lag die Anbindung bei 18 %. Wurde nur EDC als Kopplungsreagenz verwendet,
so ließen sich lediglich 7 % Azidoanilin nachweisen. In der Literatur werden für die Kopplung
von Hyal-S mit 4-Azidoanlin bei Verwendung von EDC sogar 100 % Umsatz erzielt. [75]
Die Untersuchung der AAHyal Produkte mittels 1 H-NMR Spektroskopie erbringt zwar den
Nachweis der Ankopplung des photoreaktiven Moleküls, allerdings weist der Vergleich der
Integration der Verschiebung der chemischen Signale für die Protonen einen geringeren
Modifizierungsgrad auf. Statt der zu erwartenden vier Protonen für den Aromaten wurden nur
64

Ergebnisse und Diskussion
etwa 1,5 Protonen durch Integration ermittelt. Damit betrug die Ankopplung des Azidoanilins
etwa 37 %.
Insgesamt war es aufgrund der unterschiedlichen Ergebnisse durch UV/Vis bzw. 1 H-NMR
schwierig, den Modifizierungsgrad eindeutig zu bestimmen. Durchschnittlich wurden 35-45 %
des Hyal-Moleküls funktionalisiert.
Obwohl mittels EDC/NHS-Kopplung augenscheinlich der höchste Substitutionsgrad erzielt
werden konnte, hat das gewonnene AAHyal-Produkt eine starke gelbbraune Färbung, was
ein Hinweis auf viele unerwünschte Nebenreaktionen ist. Möglicherweise sind andere
Polymer-ähnliche Produkte entstanden, die trotz Dialyse nicht heraus gelöst werden
konnten. Da auf hohe Reinheit des Polymers bei Anwendungen in der Zellkultur geachtet
werden musste, wurde die Ankopplung von Azidoanilin mittels EDC/sNHS favorisiert.
Die Kopplung von 4-Vinylanilin an Hyaluronsäure in PBS bei pH = 3 verlief mit Hilfe des
Kopplungsreagenz EDC erfolgreich. Auch hierbei wurde wie bei der Anbindung von 4-
Azidoanilin deutlich, dass nicht alle Carboxylgruppen im Hyal-Strang umgesetzt werden
konnten. In Diagramme 4-1 (rechts) sind die UV/Vis Spektren der wässrigen Lösungen von
VA (0,04 nmol), VAHyal (40 nmol) und Hyal (40 nmol) dargestellt. Das Absorptionsmaximum
liegt für VA und für VAHyal bei 270 nm. Da die 4-Vinylanilin-Lösung stark verdünnt werden
musste, um eine Absorption im Messbereich der Absorption für VAHyal zu erhalten, zeigte
sich, dass die Anbindung des Moleküls an Hyaluronsäure nur in geringem Maß
stattgefunden hat. Berechnet man die Anzahl der Styrolreste im Hyaluronsäuremolekül über
das Lambert-Beersche Gesetz, so findet man lediglich 2,5 funktionelle Gruppen pro Hyal-
Molekül derivatisiert. Dies ist ein Zehntel dessen, was in der Literatur andere Gruppen bei
der Umsetzung von Hyaluronsäure mit 4-Vinylanilin erreichen können. [98]
Die Beurteilung der erfolgten Funktionalisierung mittels UV/Vis scheint dennoch stimmig zu
sein, betrachtet man zusätzlich die 1 H-NMR Spektren des erzeugten VAHyals. Hierbei lassen
sich die Signale für die aromatischen Protonen oft nur schwach nachweisen, da die
Spektroskopie hier aufgrund des hohen Molekulargewichts des Hyal-Polymers stets an die
Grenzen der Signalauflösung stößt. Bei der Modifizierung des Hyaluronsäure-Stranges mit
Vinylanilin muss von einem äußerst geringen Substitutionsgrad ausgegangen werden.
4.1.2 Zur Erzeugung von Hydrogelen via Click-Chemie wurden die Synthesen von
ATAHyal und PAHyal durchgeführt
Zur Herstellung von ATAHyal wurden 11-Azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amin (ATA) als auch
die Kopplungsreagenzien EDC und NHS in großem Überschuss zu Hyaluronsäure gegeben.
Man erhielt das Azid-funktionalisierte Hyal-Derivat in guter Ausbeute mit hervorragendem
Modifizierungsgrad. Dieser lässt sich anhand des 1 H-NMR Spektrums bestimmen, in dem
deutlich die Verschiebung der Protonen für die Ethoxyl-Kette zu erkennen ist. Durch
Integration aller gemessenen Signale kann das Verhältnis aus Protonen der Ethoxyl-Kette zu
den Protonen der Methylgruppe in Hyal bestimmt werden. Es zeigte sich, dass ATA zu etwa
60 % angebunden werden konnte.
65

Ergebnisse und Diskussion
Die Darstellung von PAHyal gelang über die Kopplung von Propargylamin (PA) an
Hyaluronsäure mittels EDC und NHS. PA und die Kopplungsreagenzien wurden in großem
Überschuss zugegeben und man erhielt das Ethinyl-haltige Hyal-Derivat, was mittels 1 H-
NMR Spektroskopie nachgewiesen werden kann. Deutlich ist bei einer Verschiebung von
2.5 ppm das Signal für das Ethinyl-Proton im PAHyal zu erkennen. Ebenso wie für ATAHyal
lässt sich der Modifikationsgrad berechnen. Integriert man die Signale, die durch die
Verschiebung der Protonen gemessen werden, so erhält man ein Verhältnis aus dem Signal
für das Proton der Ethinylgruppe gegenüber dem Signal der Methylgruppe mit etwa 2:1.
Daraus lässt sich schließen, dass eine Substitution von 50 % der Carboxylgruppen durch PA
erfolgt ist.
Für beide Hyal-Derivate sind in der Literatur [95] keine Angaben zum Modifikationsgrad
erhältlich, da die Derivate ausschließlich zur Gelbildung, d.h. Verknüpfung miteinander
genutzt werden.
4.1.3 MAHyal und GMHyal wurden aufgrund vielversprechender Literaturbeispiele
für die Anwendung als Zellkultursubstrate hergestellt
Literaturbekannt ist die Synthese von MAHyal aus Hyaluronsäure mit Molekulargewichten im
Bereich 50-1100 kDa und Methacrylsäureanhydrid. MAHyal wurde zur Herstellung von
Hydrogelen verwendet, mit denen der Quellungsgrad, die Bioabbaubarkeit und die Kontrolle
der Zellumgebung in Mikroreaktoren untersucht wurden. [76, 77, 79]
Für alle in der vorliegenden Arbeit untersuchten Synthesewege ließ sich allerdings keine
sinnvolle Synthese für MAHyal aus Hyaluronsäure unterschiedlicher Molekulargewichte
erzielen. Sowohl die aufgenommen 1 H-NMR Spektren als auch die UV-Vis Spektren zeigten
keine Signale für die zu erwartende Acrylsäuregruppe. Allerdings ließ sich deutlich erkennen,
dass nach der Reaktionszeit und Dialyse des vermeintlichen Produktes eine Reaktion
stattgefunden haben muss, da die Produkte nicht mehr in Wasser oder anderen
Lösungsmitteln gelöst werden konnten. Es muss davon ausgegangen werden, dass die
Hyaluronsäurestränge durch zahlreiche Quervernetzungen während dem
Herstellungsprozess zu einem unlöslichen Polymer verknüpft wurden.
Erfolgreich hingegen verlief die Modifizierung der Hyaluronsäure mit
Methacrylsäureglycidylester. Dabei gelang die Reaktion für das Hyal-Polymer mit einem
Molekulargewicht von 1,1 x 10 3 kDa durch einfaches Rühren in H 2 O dest. mit anschließender
Dialyse. Für das Polymer mit 1,2-2,6 x 10 3 kDa verlief die Reaktion zum Produkt ideal bei der
Umsetzung in PBS unter Zugabe von DMF und NEt 3 . Nach dem Fällen in Aceton und wurde
das Produkt ebenfalls noch dialysiert. In Diagramm 4-2 sind die NMR-Spektren der beiden
gewonnenen Produkte vergleichend dargestellt.
66

Ergebnisse und Diskussion
R = Hyal
O
H
D 2
O
O
R
CH 2
H
CH 2
1,1 x 10 3 kDa
0.56
0.57
2.67
12.99 4.00
CH 2
H
1,2-2,6 x 10 3 kDa
0.58 0.56
2.66 13.12 4.00 0.76
6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
ppm
Diagramm 4-2: Integrale im 1 H-NMR-Spektrum für GMHyal verschiedener Molekulargewichte
In der Ansicht wird deutlich, dass erfolgreich substituiert werden konnte. Bei einer
chemischen Verschiebung von 1.95 ppm wird das einzelne Proton des Acrylsäurerestes
nachgewiesen, bei 5.75 ppm und 6.40 ppm liegen die Signale für die Protonen der CH 2 -
Gruppe. Durch den Vergleich mit den Signalen der Protonen des Methylrestes lässt sich der
Methacrylierungsgrad der Hyaluronsäure bestimmen. Dieser wird in der Literatur je nach
verwendetem Lösungsmittel in völlig unterschiedlichen Bereichen angegeben. Bei
Umsetzungen in wässrigen Lösungen mit NEt 3 und tBu 4 werden 5-11 % erreicht. [37, 81] Die
Reaktion in PBS mit DMF und NEt 3 liefert bis zu 90 % Metacrylierung. [80] Im Rahmen
dieser Arbeit konnte für die Durchführung in reinem Wasser (vergleichbar der Darstellung für
MAHyal beschrieben von Burdick et al. [76]) wie auch in PBS/DMF/NEt 3 ein
Methacrylierungsgrad von etwa 50 % erzielt werden.
4.2 Hyaluronsäure-Filmbildung
4.2.1 Bestimmung geeigneter Parameter (Lösungsmittel, Plasma) zur Hyal-
Anbindung an verschiedene Substrate durch Kontaktwinkelmessungen
bestimmt
Für eine erfolgreiche Anbindung von Hyal-Derivaten auf verschiedenen Substratoberflächen
müssen zuvor substratspezifische Modifikationen durchgeführt werden. In dieser Arbeit
wurden Silanisierungen auf Glas und Plasma-Behandlungen auf Polystyrol (PS) sowie
Polymilchsäure (PLA) angewendet.
67

Ergebnisse und Diskussion
Zur Ermittlung der Oberflächenhydrophilie von verschiedenen Substraten wurde das
Kontaktwinkel-Messverfahren angewendet. So konnte überprüft werden, ob die
Benetzbarkeit der Oberfläche mit wässrigen Lösungen durch die gewählten
Oberflächenbehandlungen (Silanisierung oder Plasma-Behandlung) verbessert werden
konnte. Zudem kann das geeignete Lösungsmittel ermittelt werden, in dem eine optimale
Verteilung von Hyaluronan-Derivaten mittels spin-coating auf der Oberfläche zu erwarten ist.
Die folgende Tabelle 4-1 gibt einen Überblick, welche Oberflächenmodifikationen gewählt
wurden, die gemessenen Kontaktwinkel und das verwendete Lösungsmittel; (F) nennt den
Fortschreitwinkel, (R) nennt den Rückzugswinkel.
Tabelle 4-1: Behandlung von Oberflächen und Kontaktwinkelmessungen
Material Behandlung Kontaktwinkel mit H 2 O Kontaktwinkel mit
EtOH : H 2 O = 1:1
Glas - (F) 45°, (R) 24° (F) 27°, (R) 11°
Glas Silanisieren (F) 61°, (R) 23° (F) und (R) nicht messbar,
vollständige Benetzung
PS - (F) 90°, (R) 74° (F) 46°, (R) 19°
PS N 2 -Plasma (F) und (R) nicht messbar,
vollständige Benetzung
(F) und (R) nicht messbar,
vollständige Benetzung
PLA - (F) 78°, (R) 59° (F) 51°, (R) 25°
PLA N 2 -Plasma (F) 53°, (R) kaum messbar (F) und (R) nicht messbar,
vollständige Benetzung
Es zeigt sich, dass die Oberflächenmodifikationen für Glas durch Silanisieren, für Polystyrol
und für PLA durch N 2 -Plasma gut geeignet sind, um eine hydrophile Oberfläche zu schaffen.
Am besten eignete sich als Lösungsmittel zum Aufschleudern von Hyal-Derivaten das
Gemisch aus EtOH:H 2 O = 1:1.
Die Herstellung von pclHyal-Filmen erfolgte wie in Kapitel 3.1.2 beschrieben. Durch das
Anfärben mit Kristallviolett kann ein Eindruck der Mustergebung und Verteilung
verschiedener Hyaluronan-Derivate auf den Oberflächen gewonnen werden. Violett gefärbt
sind diejenigen Bereiche, in denen Hyal-Derivate mittels UV-Bestrahlung photovernetzt
wurde. Das Farbsalz wird über das quaternäre Stickstoffatom an die deprotonierten und
unmodifizierten Carboxylgruppen der Hyaluronsäure gebunden, die nicht zur
Quervernetzung beitragen. Die ungefärbten Bereiche zeigen den Teil des Substrates, der
während der UV-Bestrahlung abgedeckt war und somit keine photovernetzten Hyal-Derivate
aufweist, in die Kristallviolett eingelagert werden könnte.
Oberfläche Behandlung Färbung mit Kristallviolett
spin-coating von
AAHyal, VAHyal oder GMHyal
auf beliebigem Substrat
spin-coating von
AAHyal, VAHyal oder GMHyal
auf beliebigem Substrat
UV-Bestrahlung
→ Photovernetzung
Bildung von pclHyal
keine UV-Bestrahlung
→ keine Photovernetzung
keine Bildung von pclHyal
belichtete, pclHyal
beschichtete Bereiche
werden violett gefärbt
unbelichtete, pclHyal-freie
Bereiche bleiben ungefärbt
68

Ergebnisse und Diskussion
Die folgenden Abbildungen 4-1, 4-2 und 4-3 zeigen die erzielten Beschichtungen auf
unterschiedlichen Substraten.
(a)
(b)
Abbildungen 4-1: Strukturbildung auf silanisiertem Glas (Maske M2): (a) pclAAHyal und (b)
pclVAHyal
(a)
(b)
Abbildungen 4-2: Kleinst mögliche Strukturen auf N 2 -Plasma behandeltem Polystyrol (Maske
M5): (a) pclAAHyal und b) pclVAHyal
(a)
(b)
Abbildungen 4-3: Filmprozessierung auf N 2 -Plasma behandeltem PLA (Maske M2): (a)
pclAAHyal und b) pclVAHyal
Auf allen modifizierten Oberflächen konnten mittels spin-coating und Bestrahlung mit UV
durch eine Maske strukturierte pclHyal-Filme aus AAHyal und VAHyal erzeugt werden.
Auffällig ist, dass ein konturscharfes Muster besser für pclVAHyal als für pclAAHyal erzielt
werden konnte, wie aus den Abbildungen 4-1b und 4-3b ersichtlich wird. Vor allem auf PS
konnten deutlich sichtbare kleine Strukturen erzeugt werden. Obwohl alle Substrate nach
69

Ergebnisse und Diskussion
Immobilisierung der entsprechenden Hyal-Derivate gewaschen wurden, sind teilweise auch
auf UV-unbestrahlten Bereichen Hyal-Rückstände zu erkennen. Zur Entfernung dieser
Rückstände ist das Waschen der Substrate im Ultraschallbad möglich, führte jedoch zur
Ablösung gebildeter pclHyal-Schichten vom Substrat, wie auch bereits Capila et al. zeigen
konnten. [150] In allen Fällen ließ sich besonders GMHyal relativ schlecht auf den
verwendeten Substrat immobilisieren. Häufig waren Beschichtungen nicht reproduzierbar,
nicht im Mikroskop zu erkennen oder die pclGMHyal Schicht war teilweise abgelöst. Vor
allem in Abbildung 4-4a wird die schwache Strukturbildung deutlich.
(a)
(b)
Abbildungen 4-4: Strukturbildung von pclGMHyal (1,1 x 10 3 kDa) auf silanisiertem Glas (a)
und auf N 2 -Plasma behandeltem Polystyrol (b)
4.2.2 Bioabbaubarkeit der Hyal-Derivate
Die Bioabbaubarkeit der in dieser Arbeit hergestellten Derivate pclAAHyal und pclVAHyal
wurde durch Inkubation strukturierter pclHyal-Filme mit Hyaluronidase untersucht. Nach
einer Inkubationszeit von drei Tagen konnten keine pclHyal-Strukturen mehr nachgewiesen
werden, die vernetzten pclHyal-Stränge wurden enzymatisch abgebaut. Für pclGMHyal
wurde dies bereits durch Leach et al. nachgewiesen. [37]
4.2.3 QCM-Messungen, AFM-Untersuchungen und 3D-Laserscan-Mikroskopie
zeigen die Film- und Profilbildung von pclHyaluronsäurefilmen auf
verschiedenen Substraten
Die Messung der erzeugten pclHyal-Schichtdicken auf unterschiedlichen Substraten erfolgte
mit Hilfe der Quarzmikrowaage. Dabei wurden die Frequenz und die Dämpfung der
verwendeten Schwingquarze zunächst ohne Beschichtung gemessen, anschließend wurde
Hyal entsprechend immobilisiert und der Schwingquarz wurde erneut vermessen. Durch
Bildung der Differenz aus den Messwerten vor und nach der Beschichtung ließ sich die
Schichtdicke ermitteln. Die Tabelle 3-1 zeigt die gemessenen pclHyal Schichtdicken auf
silanisierten Quarzen und mit Polystyrol beschichteten Quarzen.
70

Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 4-2: Mit der Quarzmikrowaage bestimmte Schichtdicken [nm] von pclAAHyal und
pclVAHyal auf verschiedenen Substraten
Messung auf
unterschiedlichen
Schwingquarzen
Schichtdicken [nm]
von pclAAHyal auf...
...silanisiertem
Quarz
...N 2 -Plasma
behandeltem
PS
Schichtdicken [nm]
von pclVAHyal auf...
...silanisiertem
Quarz
...N 2 -Plasma
behandeltem
PS
1 121 128 69 54
2 112 140 46 79
3 142 122 7 5
4 143 96 83 45
Es zeigt sich, dass die ermittelten Schichtdicken für ein pclHyal-Derivat auf einem Substrat
deutlich unterschiedliche Werte aufweisen, obwohl der Beschichtungsprozess stets gleich
war. Offenbar wird durch das Entnehmen, Beschichten und wieder Einsetzen der
Schwingquarze ein verhältnismäßig großer Fehler erzeugt. Das Verfahren eignet sich daher
nur für eine Abschätzung der erzeugten Schichtdicken. Für pclGMHyal konnten in keinem
Fall sinnvolle Schichtdicken ermittelt werden. Es ist davon auszugehen, dass die Filmdicken
zu gering sind und daher keine signifikanten Unterschiede bei der Messung des
unbeschichteten und des beschichteten Schwingquarzes festzustellen sind. Weiterhin
konnten die in dieser Arbeit verwendeten PLA-Substrate nicht zur Schichtdickenbestimmung
in der Quarzmikrowaage eingesetzt werden, da eine Befestigung der PLA-Folien auf dem
Schwingquarz nicht möglich ist.
AFM-Untersuchungen von Barbucci et al. [151] zeigen, dass durch das Auflegen von
Masken beim Bestrahlungsvorgang regelrechte „Stufen“ mit einer Tiefe von 0,3-1,0 µm
zwischen bestrahlten und unbestrahlten Bereichen, also zwischen vernetztem
Hyaluronsäurefilm und unvernetzten Bereichen, ausgebildet werden können. Diese
Messungen wurden an Luft im contact- bzw. tapping-Modus durchgeführt.
Die Untersuchungen der in dieser Arbeit hergestellten Strukturen mittels AFM im non-contact
Modus zeigen, dass abhängig sowohl vom verwendeten Hyal-Derivat als auch vom
Trägersubstrat unterschiedliche Profiltiefen entstehen. Dazu wurden sowohl auf silanisiertem
Glas als auch auf N 2 -Plasma-behandeltem Polystyrol sowie PLA Hyal-Lösungen
aufgeschleudert, durch eine Maske mit UV bestrahlt, anschließend mit Wasser gewaschen
und schließlich mit Kristallviolett gefärbt. Die Färbung musste durchgeführt werden, um den
Cantilever des AFM auf die korrekte Arbeitsebene mit Hilfe eines Lichtmikroskops zu
fokussieren.
Im Folgenden sind die erzielten Ergebnisse für verschiedene pclHyal-Derivate auf Glas
abgebildet (Abbildungen 4-5, 4-6 und 4-7).
71

Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4-5: pclAAHyal auf silanisiertem Glas (Maske M5), detektierte Profilhöhe ca.
100 nm
Abbildung 4-6: pclVAHyal auf silanisiertem Glas (Maske M5), detektierte Profilhöhe ca.
40 nm
72

Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4-7: pclGMHyal 1,2-2,6 x 10 3 kDa auf silanisiertem Glas (Maske M4), detektierte
Profilhöhe ca. 8 nm
Es zeigt sich, dass für pclAAHyal eine deutliche Strukturbildung erzielt werden konnte,
während für pclVAHyal und pclGMHyal weniger ausgeprägte Tiefenprofile gemessen
wurden. Dies wird mit dem Modifizierungsgrad eines Hyaluronsäure-Stranges und der damit
möglichen Vernetzung durch UV begründet. Je höher die Anzahl der vernetzbaren Gruppen
je Molekülstrang, umso mehr vernetzen die Hyal-Stränge untereinander und werden später
beim Wasch-Prozess nicht weg gespült.
Nachfolgend sind die Ergebnisse der Untersuchungen auf Polystyrol abgebildet
(Abbildungen 4-8 und 4-9).
Abbildung 4-8: pclAAHyal auf N 2 -behandeltem Polystyrol (Maske M5), detektierte Profilhöhe
ca. 40 nm
73

Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4-9: pclVAHyal auf N 2 -behandeltem Polystyrol (Maske M5), detektierte Profilhöhe
ca. 46 nm
Da Polystyrol eine hohe Oberflächenrauheit aufweist, konnte auf diesem Substrat keine
Strukturierung für pclGMHyal im Größenbereich von 8 nm (wie auf Glas) mittels AFM
gemessen werden. Außerdem wurde für pclVAHyal ein geringfügig höheres Profil gemessen
als für pclAAHyal. Möglicherweise spielt bei der Strukturbildung auf Poylstyrol nicht nur die
Vernetzbarkeit der pclHyal-Stränge untereinander eine wichtige Rolle, sondern auch die
Vernetzung des Biopolymers mit dem Polystrol. Da VAHyal durch Zugabe von
Photoinitiatoren während des Bestrahlungsprozesses immobilisiert wird, ist davon
auszugehen, dass die aromatischen Doppelbindungen des Polystyrols ebenfalls an der
Vernetzung beteiligt sind.
Für Untersuchungen von pclHyal-Derivaten auf PLA konnten keine Strukturen mittels AFM
detektiert werden. Aufgrund der Oberflächentopographie von PLA ist die Empfindlichkeit der
Detektion zu gering, um Strukturen im Größenbereich von 40 nm aufzulösen.
Vergleichend und zur Validierung der Profiltiefen wurden zusätzlich Untersuchungen am 3D-
Laserscan-Mikroskop durchgeführt. Dabei mussten die pclHyal-Filme nicht angefärbt
werden. Mittels spezieller Software (KEYENCE VK-9700 Analyzer) konnten Tiefenprofile
gemessen werden. In den folgenden Abbildungen 4-10 bis 4-14 sind jeweils links oben die
Aufnahmen der Lichtintensität, rechts davon die dreidimensionale Ansicht in Falschfarben
und unten die Profilhöhenanalyse gezeigt. In der Profilhöhenanalyse können Segmente
einzeln angewählt und damit genau vermessen werden. Zur Interpretation der Ergebnisse
wurden zudem Höhenprofile der unbehandelten Substrate aufgenommen (ohne
Abbildungen), wie die folgende Tabelle 4-3 zeigt.
Tabelle 4-3: Profilhöhendifferenzen der Substrate vor dem Beschichten mit Hyal-Derivaten
Substrat Höhendifferenzen [nm] Interpretation
silanisiertes Glas 217 ± 182 relativ glatte Oberfläche
N 2 -behandeltes PS 2360 ± 2386 sehr raue Oberfläche
N 2 -behandletes PLA 508 ± 440 mittlere Rauheit
74

Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4-10: pclAAHyal auf silanisiertem Glas (Maske M5)
Die Analyse für Abbildung 4-10 zeigt ein unerwartetes Höhenprofil: die unbestrahlte Bereiche
(Segmente Nr. 4 und 8, Substrat) sind mit 726 nm und 735 nm höher, als die UV-bestrahlten
Punktbereiche (Segmente Nr. 2 und 4, pcl-Hyal-Schicht), die eine Höhe von 645 bzw.
620 nm aufweisen. Diese Beobachtung wird beim Vergleich der Profilmessungen mittels
QCM, AFM und Laserscan-Analysen ab Seite 79 diskutiert. Zudem haben sich Ränder (1),
(3), (5), (7) und (9) um die Punkte gebildet, die bis zu 867 nm hoch sind. Die Vermessungen
der Segmente 1-9 ist in Tabelle 4-4 aufgeführt.
Tabelle 4-4: Profilanalyse für pclAAHyal auf silanisiertem Glas
Segment Nr. Profilhöhe [nm] Beschreibung Höhe der pclAAHyal-Schicht
1 836 Randbereich zwischen Substrat (4) und pclHyal-
2 645 pclHyal-Schicht
Schicht (2): 81 nm
3 804 Randbereich
4 726 Substrat
5 805 Randbereich
6 620 pclHyal-Schicht
7 809 Randbereich
8 735 Substrat
9 867 Randbereich
zwischen Substrat (4) und pclHyal-
Schicht (6): 106 nm, zwischen (6)
und Substrat (8): 115 nm
75

Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4-11: pclVAHyal auf silanisiertem Glas (Maske M4)
Aus Abbildung 4-11 lässt sich für die Profilhöhenanalyse keine eindeutige Strukturierung
nachweisen. Die ausgewählten Bereiche weisen Profilhöhen im Bereich von 677-690 nm auf.
Obwohl in der Falschfarbendarstellung die Struktur aus pclVAHyal auf dem Glasplättchen
erkennbar ist, konnte mit dem 3D-Laserscan-Verfahren nur relativ schlecht eine
Profilbestimmung durchgeführt werden. In Tabelle 4-5 sind die Profilanalysen für die
Segmente 1-6 gezeigt, die eine maximale Höhendifferenz von 13 nm aufweisen.
Tabelle 4-5: Profilanalyse für pclVAHyal auf silanisiertem Glas
Segment Nr. Profilhöhe [nm] Beschreibung Höhe der pclVAHyal-Schicht
1 690 pclHyal-Schicht 13 nm
2 677 Substrat
3 682 pclHyal-Schicht 5 nm
4 685 pclHyal-Schicht 7 nm
5 678 Substrat
6 684 pclHyal-Schicht 6 nm
76

Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4-12: pclAAHyal auf N 2 -behandeltem Polystyrol (Maske M4)
Die Untersuchung der Strukturbildung von pclAAHyal auf PS (Abbildung 4-12) mittels
Laserscan-Mikroskopie vermittelt einen Eindruck von der äußerst rauen Oberflächen, wie es
bereits für unbeschichtetes PS zu erkennen war (siehe Tabelle 4-3) die auch durch
Beschichtung mit pclAAHal nicht deutlich glatter wird. Das Auswählen von Segmenten zur
Profilanalyse gestaltete sich schwierig, da kaum deutliche Profilhöhen auszumachen waren.
Zusammenfassend lässt sich erkennen, dass zwischen den UV-bestrahlten Bereichen (1),
(3) und (5) und den nicht-bestrahlten Bereichen (2) und (4) eine Höhendifferenz von 7-30 nm
besteht. Die Zahlenwerte sind als Übersicht in Tabelle 4-6 dargestellt.
Tabelle 4-6: Profilanalyse für pclAAHyal auf N 2 -behandeltem Polystyrol
Segment Nr. Profilhöhe [nm] Beschreibung Höhe der pclAAHyal-Schicht
1 697 pclHyal-Schicht 30 nm
2 667 Substrat
3 670 pclHyal-Schicht 17 nm
4 653 Substrat
5 660 pclHyal-Schicht 7 nm
77

Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4-13: pclVAHyal auf N 2 -behandeltem Polystyrol (Maske M5)
Die Profilanalyse für Abbildung 4-13 gibt ein analysierbares Höhenprofil wider. Mit Hilfe der
Falschfarbendarstellung wurden die Segmente bestimmt und vermessen. Im Vergleich zu
pclAAHyal auf N 2 -PS konnte bei pclVAHyal auf N 2 -PS eine weniger raue Oberfläche
vermessen werden. Wie bereits bei den AFM-Untersuchungen für pclVAhyal auf N 2 -PS
diskutiert, kann dies auf Polymerisationseffekte durch die Zugabe der Photoinitiatoren Ic und
Vp zurückgeführt werden. Die Profilhöhen für UV-bestrahlte Bereiche und nicht-bestrahlte
Bereiche sind in Tabelle 4-7 aufgeführt.
Tabelle 4-7: Profilanalyse für pclVAHyal auf N 2 -behandeltem Polystyrol
Segment Nr. Profilhöhe [nm] Beschreibung Höhe der pclVAHyal-Schicht
1 636 pclHyal-Schicht 22 nm
2 614 Substrat
3 633 pclHyal-Schicht 19 nm
78

Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4-14: pclGMHyal (1,2-2,6 x 10 3 kDa) auf N 2 -behandeltem PLA (Maske M4)
Für die Analyse von pclGMHyal auf PLA (Abbildung 4-14) lässt sich in der
Falschfarbendarstellung keine Struktur erkennen, da die Profilhöhendifferenzen insgesamt
zu gering sind. Eine Profilbestimmung mittels 3D-Laserscan-Mikroskopie war nicht möglich,
da keine Höhendifferenzen ausgemessen werden konnten. Die Profilhöhendifferenz über
das gesamte Analyse-Segment lag durchschnittlich nur bei 18 nm.
Vergleich der QCM-Messungen, der AFM-Analysen und der 3D-Laserscan-Mikroskopie-
Aufnahmen zur Ermittlung der Filmdicke und Strukturbildung auf einem Substrat
Vergleicht man die mit der Quarzmikrowaage gemessenen Schichtdicken mit den ermittelten
Profilhöhen aus der AFM-Untersuchung und den Laserscan-Analysen, so lassen sich Trends
für die Strukturbildung verschiedener Hyal-Derivate auf unterschiedlichen Substraten
erkennen. Für pclAAHyal auf Glas wurden Filmdicken von 112-143 nm (QCM) und
Profilhöhen von 100 nm (AFM) bzw. durchschnittlich 100 nm (3D-Laser) erzeugt. pclAAHyal
auf Polystyrol ergab 96-140 nm (QCM) bzw. 40 nm (AFM) bzw. durchschnittlich 18 nm (3D-
Laser) hohe Strukturen. Bei der Verwendung von pclVAHyal war anhand der Resultate aus
AFM- bzw. 3D-Laser-Analysen eine höhere Struktur auf Polystyrol zu erkennen. Hierbei
wurden Profilhöhen von 46 nm (AFM) bzw. durchschnittlich 20 nm (3D-Laser) erzielt, im
Vergleich dazu auf Glas nur etwa 40 nm (AFM) bzw. 8 nm (3D-Laser). Die QCM-Messungen
zeigten hingegen das Gegenteil: bis 83 nm auf Glas und bis 79 nm auf PS. Für pclGMHyal
konnte nur auf Glas mittels AFM eine Untersuchung des Oberflächenprofils durchgeführt
werden, es ergaben sich Profilhöhen von etwa 8 nm. Bei der Untersuchung von pclHyal-
Derivaten auf Polymilchsäure (PLA) war einzig für pclGMHyal ein Kontrast im
79

Ergebnisse und Diskussion
Lichtintensitätsbild zu erkennen. Hier ließ jedoch die Rauheit der Oberfläche, wie in der
dreidimensionalen Darstellung gut zu erkennen, keine Aussage zur Profilhöhe zu.
Für die Untersuchung der Substrate mittels AFM war zu berücksichtigen, dass alle pclHyal-
Strukturen mit Kristallviolett angefärbt wurden, um den Cantilever des AFMs mit Hilfe des
Mikroskops auf der Oberfläche platzieren zu können. Durch Anbindung des Farbstoffs an
pclHyal-Filme (vgl. Kapitel 4.2.1) wurden dadurch unterschiedlich höhere Strukturen ermittelt
als bei der Profilanalyse mittels 3D-Laserscan-Mikroskopie. Bemerkenswert ist hierbei, dass
pclHyal-Strukturen auf Polystyrol nach der Färbung mit Kristallviolett 10-33 nm höher
gemessen wurden; vergleichbar dazu wurden pclHyal-Strukturen auf silanisiertem Glas
allerdings abhängig vom verwendeten Hyal-Derivat etwa gleich hoch (± 17 nm bei
pclAAHyal) oder ebenfalls höher (27-35 nm höher bei pclAAHyal) gemessen. Insgesamt
zeigen jedoch alle Messverfahren für die erzeugten Strukturen eine erfolgreiche Film- bzw.
Profilbildung an. Es stellte sich nach Untersuchung der Substrate die Frage, in wie weit die
nicht-bestrahlten Oberflächen tatsächlich Hyaluronsäure-frei gewaschen werden konnten, da
für pclAAHyal auf silanisiertem Glas höhere Schichten auf den eigentlich pclHyal-freien
Bereichen gemessen wurden. Möglicherweise verbleiben unvernetzte Hyal-Reste auf der
Oberfläche, die durch Luftfeuchtigkeit stärker aufquellen, als das pclHyal. Dieser Sachverhalt
und der Einfluss, den die erzeugten Strukturen auf Anwendungen in der Zellkultur haben,
werden in den folgenden Kapiteln zu XPS-Messungen und zur Untersuchung des
Zellwachstums auf pclHyal-Strukturen beleuchtet.
4.2.4 XPS-Messungen unterschiedlicher Substrate zeigen Probleme bei der
Strukturbildung auf und liefern den Nachweis für eine erfolgreiche
Immobilisierung unterschiedlicher Hyal-Komposite
Durch XPS-Untersuchungen verschiedener Substrate (Silizium, PS und PLA) zu
unterschiedlichen Zeitpunkten im Beschichtungsprozess mit Hyaluronsäure-Derivaten wurde
schrittweise die Modifikation der Oberfläche überprüft. Alle Beschichtungen wurden wie in
Kapitel 3.1.2 erwähnt hergestellt. Da eine Fokussierung auf erzeugte Muster im
Mikrometerbereich mittels röntgeninduzierter Photoelektronen-Spektroskopie nicht möglich
ist, wurden die zu untersuchenden Substrate entweder vollflächig oder gar nicht mit UV
bestrahlt. Alle Substrate wurden vor der XPS-Analyse mit H 2 O dest. gewaschen. Zur
Bestimmung des prozentualen Anteils von Atomen auf einer Oberfläche wurden die
experimentell gemessenen Intensitäten durch den signalspezifischen Wirkungsquerschnitt σ
dividert. [140] Durch die Differenz aus jeweiliger korrigierter Intensität und der Summe aller
korrigierten Intensitäten ergaben sich die Atomprozente jeder Probe.
In Tabelle 4-8 sind die Ergebnisse der ermittelten Atomprozente auf PS-Substrat aufgelistet.
80

Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 4-8: Untersuchung der Immobilisierung von AAHyal bzw. VAHyal als pclHyal-
Derivate auf Polystyrol (PS)
Atomprozent für: C O N
PS + UV 99,4 0,6 -
PS + N 2 + UV 82,4 17,0 0,7
PS + Ic/Vp + UV 99,8 0,2 -
PS + N 2 + Ic/Vp + UV 83,1 16,4 0,5
PS + VAHyal + Ic/Vp + UV 69,7 26,8 3,5
PS + N 2 + VAHyal + Ic/Vp + UV 60,7 34,2 5,1
PS + AAHyal + UV 66,4 27,9 5,7
PS + N 2 + AAHyal + UV 58,5 34,1 7,4
Deutlich lassen sich aus Tabelle 4-8 die Unterschiede der Atomprozente insgesamt für
Kohlenstoff und Sauerstoff mit bzw. ohne pclHyal-Derivat auf der PS-Oberfläche ablesen.
Am Beispiel von AAHyal auf PS zeigen die folgenden Diagramme 4-3 die ermittelten
Bindungsenergien für Kohlenstoff 1s und Sauerstoff 1s zum jeweiligen
Beschichtungszeitpunkt. (Zur visuellen Verdeutlichung angepasst mit Hilfe der Software
UNIFIT [141]).
Diagramme 4-3: Bindungsenergien (normiert auf maximale Intensität) der C1s (links) und
O1s Orbitale (rechts) von unterschiedlich behandeltem PS zur Untersuchung
der Anbindung von AAHyal an PS
81

Ergebnisse und Diskussion
In den Darstellungen der Bindungsenergie wurde die Energieskala über die bekannten
Photoelektronenlinien von metallischem Gold, Silber und Kupfer kalibriert. Die Spektren sind
auf die C1s = 285,0 eV Photoelektronenlinie von Kohlenwasserstoffen referenziert. Die
experimentelle Unsicherheit beträgt aufgrund der Aufladung der Proben während der
Messung 0,2 eV.
Die Zuordnung der spezifischen Bindungsenergien erfolgt über den Vergleich mit
Literaturangaben, wie in Tabelle 4-9 aufgelistet.
Tabelle 4-9: gemessene Bindungsenergien der Kohlenstoffe und ihre spezifische Zuordnung
C-Atom
im Spektrum
Bindungenergie
[eV]
spezifisches
C-Atom
Literaturwert
der BE [eV]
C-1 290.2 C 12 H 10 290.15 [152]
C-2 288.3 (-CH 2 C(CH 3 )(C(O)NH 2 )-) n 288.3 [153]
Poly(methacrylamid)
C-3 286.5 C-C-O oder
(-C 6 H 5 NH-) n Polyanilin
286.6 [154] oder
286.5 [155]
C-4 285.0 C-C-H 285.0 [154]
Fragestellung: Welchen Einfluß hat dieVorbehandlung von PS mit N 2 -Plasma und welche
Rolle spielen die Photoinitatoren Ic undVp?
Durch das Aufschleudern konnte eine saubere Schicht aus Polystyrol auf Silizium erzeugt
werden. Die Bestrahlung der PS-Oberfläche mit UV der Wellenlänge 365 nm bewirkte keine
Änderung der Beschichtung, die Behandlung mit N 2 -Plasma führte jedoch zur Oxidation des
PS Films durch das reaktive Plasma. Aus Tabelle 4-8 wird zudem ersichtlich, dass es nur auf
einer N 2 -behandelten PS-Schicht durch Bestrahlung mit UV zur Anbindung der beiden
Photoinitiatoren Irgacure 2959 (Ic) und N-Vinylpyrrolidon (Vp) kommt. Anders verhalten sich
hier die beiden Hyal-Derivate: sie konnten auf PS eine Adsorbatschicht bilden und mit UV-
Bestrahlung angebunden werden, ohne dass PS mit N 2 -Plasma zuvor hydrophiliert wurde.
Fazit: Eine Strukturierung der PS-Oberfläche, nachgewiesen durch Raster-Kraft- und 3D-
Laserscan-Mikroskopie, erfolgte demnach nicht durch vorherige UV- oder N 2 -Plasma
Behandlung der Polystyrol-Schicht sondern durch die erfolgreiche Anbindung von AAHyal
mittels UV-Bestrahlung (bei Anwesenheit der Photoinitiatoren Ic und Vp entsprechend für
VAHyal).
Zur Überprüfung der Anbindung von AAHyal und VAHyal auf PLA wurden analog zu den
Messungen auf PS Untersuchungen mittels XPS zu verschiedenen Zeitpunkten während der
Filmprozessierung auf PLA durchgeführt. Die Ergebnisse der ermittelten Atomprozente auf
PLA sind in Tabelle 4-10 aufgelistet.
82

Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 4-10: Untersuchung der Immobilisierung von AAHyal bzw. VAHyal als pclHyal-
Derivate auf Polymilchsäure (PLA)
Atomprozent für: C O N
PLA + UV 63,2 36,8 -
PLA + N 2 + UV 62,7 37,3 -
PLA + Ic/Vp + UV 63,5 36,4 -
PLA + N 2 + Ic/Vp + UV 61,1 38,9 -
PLA + VAHyal + Ic/Vp + UV 64,9 32,0 3,2
PLA + N 2 + VAHyal + Ic/Vp+ UV 68,6 27,4 4,1
PLA + AAHyal + UV 61,5 31,8 6,8
PLA + N 2 + AAHyal + UV 59,9 33,8 6,3
Es zeigt sich, dass sich die relative Zusammensetzung der PLA Oberfläche – mit Ausnahme
einer geringen Zunahme des Sauerstoffanteils – kaum ändert, weder durch die Bestrahlung
mit UV der Wellenlänge 365 nm noch durch Behandlung mit N 2 -Plasma. Ebenso ist der
Nachweis einer möglichen Anbindung von Ic und Vp negativ. Erfolgreich wird damit die
Anbindung der beiden Hyal-Derivate auf PLA bzw. PLA + N 2 nachgewiesen. Dies wird
insbesondere durch die fehlenden Signale für PLA nach Beschichtung mit VAHyal + UV
deutlich, wie die Bindungsenergien für C1s aufgetragen gegen die Intensität in den
Diagramme 4-4 zeigen. Bei einer durchschnittlichen Schichtdicke von 35 nm für pclVAHyal
auf Glas bzw. PS (siehe Kapitel 4.2.3) ist die PLA-Folie mittels XPS (wegen der geringen
Austrittstiefe der detektierbaren Elektronen) nicht mehr zu erkennen.
Da die Unterschiede der Atomprozente insgesamt für Kohlenstoff und Sauerstoff mit bzw.
ohne pclHyal-Derivat auf der PLA-Oberfläche verhältnismäßig gering waren, zeigen die
folgenden Diagramme 4-4 (am Beispiel von VAHyal auf PLA) die ermittelten
Bindungsenergien für Kohlenstoff 1s und Sauerstoff 1s zum jeweiligen
Beschichtungszeitpunkt. (Zur visuellen Verdeutlichung angepasst mit Hilfe der Software
UNIFIT [141]). Die Kalibrierung und Referenzierung erfolgte wie für Diagramme 4-3
beschrieben. Die experimentelle Unsicherheit beträgt aufgrund der Aufladung der Proben
während der Messung 0,2 eV.
83

Ergebnisse und Diskussion
Diagramme 4-4: Bindungsenergien (normiert auf maximale Intensität) der C1s (links) und
O1s Orbitale (rechts) von unterschiedlich behandeltem PLA zur Untersuchung
der Anbindung von VAHyal an PLA
Für die Anbindung von AAHyal an PLA ergibt sich die gleiche chemische Verschiebung der
Kohlenstoff 1s-Rumpfniveaus der verschiedenen Kohlenstoffatome; dies gilt ebenso für
Sauerstoff. Eine erhöhte Bindungsenergie tritt dadurch auf, dass elektronegativere
Nachbaratome Elektronen partiell vom Kohlenstoff anziehen und bei der Photoemission
diese Partialladung zusätzlich aufgebracht werden muss. Die Bindungsenergie ist daher
spezifisch für die im Molekül vorhandenen verschiedenen Kohlenstoffatome, die Zuordnung
erfolgt über den Vergleich mit Literaturangaben, wie in Tabelle 4-11 aufgelistet.
Tabelle 4-11: gemessene Bindungsenergien der Kohlenstoffe und ihre spezifische
Zuordnung
C-Atom
im Spektrum
Bindungenergie
[eV]
spezifisches
C-Atom
Literaturwert
der BE [eV]
C-1 289.0 O-C=O 288.9 [154]
C-2 288.1 (-CH 2 C(CH 3 )(C(O)NH 2 )-) n 288.3 [153]
Poly(methacrylamid)
C-3 287.0 (-OC(O)CH(CH 3 )-) n 286.98 [153]
Polymilchsäure
C-4 286.6 C-C-O oder
(-C 6 H 5 NH-) n Polyanilin
286.6 [154] oder
286.5 [155]
C-5 285.0 C-C-H 285.0 [154]
84

Ergebnisse und Diskussion
Da bei der Messung der Oberflächenprofile in Kapitel 4.2.3 nicht eindeutig gezeigt werden
konnte, ob unbestrahlte Bereiche einer Oberfläche während des Hyal-
Immobilisierungsprozesses auch tatsächlich Hyal-frei bleiben, wurden XPS-Messungen von
VAHyal mit PLL an PLA-Substraten mit und ohne Betsrahlung mit UV stellvertretend für alle
in dieser Arbeit verwendeten Substrate und Beschichtungen durchgeführt (siehe Tabelle
4-12).
Tabelle 4-12: Untersuchung der Immobilisierung von PLL in VAHyal auf N 2 -behandeltem
PLA
Atomprozent für: C O N
PLA – UV 62,4 37,6 -
PLA + UV 62,7 37,3 -
PLA + PLL - UV 63,6 35,7 0,7
PLA + PLL + UV 66,0 32,4 1,6
PLA + VAHyal + PLL - UV 66,1 31,6 2,3
PLA + VAHyal + PLL + UV 64,4 31,4 4,2
Aus Tabelle 4-12 wird klar, dass Hyal-Rückstände, die beim spin-coating auf die Oberfläche
gelangen, jedoch nicht photovernetzt wurden, nicht durch Waschen des Substrates entfernt
werden konnten. Die Unterschiede der ermittelten Atomprozente für UV- bzw. nicht-UV
bestrahlte Schichten auf PLA sind auf die unterschiedlichen Schichtdicken zurückzuführen,
die abhängig von der Belichtung gebildet werden. Während ohne UV-Bestrahlung nur sehr
dünne Adsorbatschichten auf PLA verblieben, bildete sich durch UV-Bestrahlung eine
quervernetzte Schicht. Aufgund der geringen Informationstiefe für die XP-Spektroskopie
haben schon kleine Unterschiede in der Schichtdicke einen großen Unterschied im Ergebnis
zur Folge. Untersuchungen auf Silizium mit VAHyal und den Zusätzen PLL sowie FN zeigen
ebenso, dass trotz Waschens der nicht-bestrahlten Proben mit H 2 O dest. keine reine
Silizium-Oberfläche erhalten werden. Die ermittelten Atomprozente für unterschiedliche
Beschichtungen mit und ohne UV-Exposition sind in Tabelle 4-13 aufgelistet.
Tabelle 4-13: Untersuchung der Immobilisierung von VAHyal, VAHyal mit PLL und VAHyal
mit FN auf Silizium in Abhängigkeit von der Bestrahlung mit UV
Atomprozent für: C O N
Si + VAHyal - UV 49,8 33,9 3,4
Si + VAHyal + UV 48,8 36,0 3,9
Si + VAHyal + PLL - UV 53,6 31,6 3,5
Si + VAHyal + PLL + UV 51,9 33,7 3,9
Si + VAHyal + FN - UV 34,6 44,3 4,3
Si + VAHyal + FN + UV 37,5 42,4 4,7
Die XPS-Untersuchungen unterschiedlich behandelter Substrate zeigen, dass
Hyaluronsäure-Derivate auf Silizium, Polystyrol und Polymilchsäure immobilisiert werden
konnten. Die Ergebnisse zeigen desweiteren, dass die Strukturierung von Polymersubstraten
mittels UV- Bestrahlung durch eine Maske einzig durch Immobilisierung und Quervernetzung
85

Ergebnisse und Diskussion
von pclHyal-Derviaten auf den Substraten erfolgt und nicht durch andere Mechanismen oder
Prozessierungsschritte. Eine Hyal-freie Oberfläche zwischen den erzeugten pclHyal-
Strukturen konnte mit der in dieser Arbeit verwendeten Oberflächenbeschichtungsmethode
allerdings nicht hergestellt werden. Die Anwendungen der Substrate in der Zellkultur sollten
daher Hinweise auf eine geschickte Oberflächenfunktionalisierung unter Verwendung
verschiedener Hyal-Derivate liefern.
4.2.5 Die Analyse des Zetapotenzials gibt Aufschluss über die Oberflächenladung
verschiedener Hyaluronsäurefilme
Die Modifikation einer Oberfläche kann die Benetzbarkeit, die Biokompatibilität oder auch
das Adhäsionsverhalten gegenüber anderen Molekülen verändern. Die Bestimmung des
Zetapotenzials mittels Messung des Strömungspotentials und des Strömungsstroms dient
der Oberflächencharakterisierung.
Auf unterschiedlichen Substraten wurde für verschieden konzentrierte Salzlösungen das
Zetapotenzial in Abhängigkeit vom pH-Wert bestimmt. Diese Oberflächentitration führt zur
Dissoziation funktioneller Gruppen auf der Oberfläche und kann qualitative Aussagen über
die Chemie dieser funktionellen Gruppen liefern. In Diagramm 4-5 ist das Zetapotenzial für
silanisierte Glasplättchen aufgetragen, die Fehlerbalken geben die Standardabweichung zum
Mittelwert aus sechs Messungen an. Das Glas entspricht also in diesem Fall einer
„unfunktionalisierten“ Oberfläche, es sind keine Hyaluronsäure-Moleküle vorhanden.
40
1 mM KCl 10 mM KCl 1 mM NaCl
20
Zetapotenzial [mV]
0
-20
-40
-60
-80
-100
2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
Diagramm 4-5: Zetapotenzial zweier Elektrolyte in Abhängigkeit von Konzentration und pH-
Wert auf silanisiertem Glas
86

Ergebnisse und Diskussion
Für verschiedene Elektrolytkonzentrationen und ebenfalls unabhängig von der
Salzzusammensetzung (KCl bzw. NaCl) zeigt die Glasoberfläche einen Isoeletrischen Punkt
(IEP) von 4, d.h. bei pH = 4 erscheint die Oberfläche ungeladen. Im nächsten Schritt wurden
pclHyal-Filme auf Glas untersucht. Die beiden Diagramme 4-6 und 4-7 zeigen die
Bestimmung des Zetapotenzials für pclAAHyal und pclVAHyal Oberflächen (mit Angabe der
Standardabweichungen als Fehlerbalken für sechs Messungen je pH-Wert).
-10
0 1 mM KCl 10 mM KCl 56 mM KCl
Zetapotenzial [mV]
-20
-30
-40
-50
-60
-70
2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
Diagramm 4-6: Zetapotenzial bei verschiedenen pH-Werten für einen pclAAHyal-Film ohne
weitere Zusätze, der nacheinander verschiedenen Konzentrationen ausgesetzt
wurde
40 0,1 mM KCl 1mM KCl
3 mM KCl 56 mM KCl 100 mM KCl
20
Zetapotenzial [mV]
0
-20
-40
-60
-80
-100
2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
Diagramm 4-7: Zetapotenzial bei verschiedenen pH-Werten für einen pclVAHyal-Film ohne
weitere Zusätze, der nacheinander verschiedenen Konzentrationen ausgesetzt
wurde
87

Ergebnisse und Diskussion
Für die beiden pclHyal-Oberflächen lassen sich in Bezug auf eine Anwendung in der
Zellkultur folgende Aussagen treffen:
• Bei einem physiologischen pH-Wert von 7,4 liegt das Zetapotenzial für alle
Elektrolytlösungen im negativen Bereich. Das bedeutet, die Oberfläche ist dann stets
negativ geladen.
• Der IEP liegt deutlich niedriger als der der Glasoberfläche. Für pclAAHyal liegt der
IEP sogar außerhalb der untersuchten pH-Werte. Die pclHyal-Oberflächen liegen also
nie elektrisch neutral vor.
• Bei den für die Messmethode verhältnismäßig hohen Ionenkonzentrationen von bis
zu 100 mM verhalten sich die pclHyal-Filme wie erwartet: bei steigender
Salzkonzentration werden mehr Ionen an der Grenzfläche angelagert und die
gemessenen, absoluten Zetapotenziale gehen betragsmäßig nach unten, d.h. die
Oberfläche scheint nach außen hin weniger negativ geladen.
• Die Lage des IEP hängt bei pclAAHyal und pclVAHyal nicht von der
Salzkonzentration und auch nicht von der Salzzusammensetzung ab, wie in einer
weiteren Messung bestätigt werden konnte. Es ist deshalb davon auszugehen, dass
die Protonen, Alkoholatanionen und Carboxylatanionen des pclHyal-Films für die
Ladungseffekte an der Grenzfläche verantwortlich sind.
Da XPS-Untersuchungen (Kapitel 4.2.4) ergeben hatten, dass eine Fläche nach Hyal-
Exposition, jedoch ohne UV-Bestrahlung nicht völlig Hyal-frei gewaschen werden kann,
wurden VAHyal Beschichtungen hergestellt, die zusätzlich das polykationische PLL
enthalten. In den Diagrammen 4-8 sind die gemessenen Potentiale bei unterschiedlichen
KCl-Konzentrationen gegen die verschiedenen pH-Werte aufgetragen.
20
0
0,1 mM KCl 1 mM KCl
10 mM KCl 54 mM KCl
20
0
1mM KCl
10 mM KCl
Zetapotenzial [mV]
-20
-40
-60
Zetapotenzial [mV]
-20
-40
-60
-80
2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
-80
2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
Diagramme 4-8: VAHyal/PLL ohne UV-Bestrahlung (links) und nach UV-Bestrahlung (rechts)
Es wird deutlich, dass im pH Plateau-Bereich die Zetapotenziale für nicht UV-bestrahlte
Oberflächen relativ wenig von der Ionenstärke abhängig sind. Der IEP liegt sehr niedrig, was
auf eine Rest-Schicht an Hyaluronsäure deutet, die nicht weggewaschen werden konnte.
Dieses Ergebnis deckt sich mit der XPS-Analyse von UV unbehandelten Hyal-Substraten.
Für die nicht UV-behandelten Proben sind die Zetapotenziale bei den niedrigeren
Ionenstärken (1 mM) vom Betrag her signifikant kleiner (-50 mV) als bei den UV-behandelten
88

Ergebnisse und Diskussion
Proben (-70 mV). Weiterhin ließ sich keine Zunahme des Zetapotenzials bei steigender
Ionenstärke feststellen, wie es bei den UV-bestrahlten Oberflächen beobachtet werden kann.
Möglicherweise führt eine Rest-Schicht PLL zusammen mit der Rest-Schicht Hyal dazu, dass
sich eine weniger stark geladene Oberfläche gebildet hat, auf der sich selbst bei höheren
Ionenstärken Kationen und Anionen gleichermaßen anlagern. Bei den UV-bestrahlten
Oberflächen war die übliche Zunahme des Zetapotenzials bei abnehmender Ionenstärke zu
beobachten, was auf ein Quellen des pclHyal/PLL-Films zurück geführt werden kann.
Dadurch können Ionen in die pclHyal/PLL Schicht eindringen und damit die Oberfläche nach
außen hin neutral erscheinen lassen. Auffällig ist, dass der IEP für die UV-bestrahlte
Oberfläche aus pclVAHyal/PLL relativ hoch liegt, vergleichbar dem auf silanisierten Glas.
Dies spricht für die Theorie des gequollenen Films, der bei pH = 4 nach außen hin neutral
geladen ist.
4.2.6 Hyaluronsäure-Filme zur Anwendung im Mikrothermoform-Verfahren
Zur Untersuchung von Polymeren, die in einer Formanlage thermisch gezogen und
verstreckt werden, wurde Polymilchsäure als Substrat gewählt. PLA ist ein durch Wärme
verformbarer biokompatibler Kunststoff. Während dem Thermoformprozess wird PLA auf bis
zu 60°C erhitzt und einem Druck von 2-3 MPa ausgesetzt. Untersuchungen zur
Beständigkeit von Hyaluronsäure Beschichtungen auf PLA zeigen, dass dieser Prozess für
pclAAHyal auf PLA ungeeignet ist. Die pclAAHyal-Schicht löste sich vom PLA-Substrat ab.
Die Entwicklung thermogeformter Strukturen von pclVAHyal auf PLA verlief hingegen
erfolgreich. Wie in den Abbildungen 4-15 dargestellt, wurden aus einem mit pclVAHyal
beschichteten PLA-Substrat relativ tiefe Kavitäten bei 3 MPa geformt, in denen die
pclVAHyal-Beschichtung bei den gewählten Prozessparamtern ein- und abreißt, zwischen
den Kavitäten dagegen unbeschädigt bleibt.
(a)
(b)
Abbildungen 4-15: Filmprozessierung von VAHyal auf PLA (vgl. Kapitel 3.1.2): UV-
Bestrahlung vollflächig (a) oder durch eine Maske (b); Thermoformen des
Substrates (vgl. Kapitel 3.1.3), Einformtiefe 170 µm (links) oder 200 µm
(rechts); Färbung mit Kristallviolett
Wurde bei einem geringeren Druck von 2 MPa thermogeformt, so blieb (wie in den
Abbildungen 4-16 gezeigt) ein zuvor erzeugtes pclHyal-Muster auch in den weniger tief
eingeformten Kavitäten erhalten und wurde dort lediglich verzerrt.
89

Ergebnisse und Diskussion
(a)
(b)
Abbildungen 4-16: Filmprozessierung von VAHyal auf PLA (vgl. Kapitel 3.1.2): UV-
Bestrahlung durch eine Maske; Thermoformen des Substrates (vgl. Kapitel
3.1.3), Einformtiefe 90 µm. Beide Abbildungen (a und b) zeigen den gleichen
Probenbereich in verschiedenen Fokusebenen, wobei deutlich die intakte
Wellenstruktur zwischen den Kavitäten sowie das verstreckte, eingerissene
Muster in der Kavität zu erkennen ist
Um auszuschließen, dass sich pclVAHyal während dem Thermoformprozess zersetzt, wurde
versucht, die Schmelztemperatur von pclVAHyal zu bestimmen. Dabei kommt es ab 180°C
zur langsamen Zersetzung des Polymers.
4.3 Hyaluronsäure-Gelbildung
4.3.1 Photocrosslinking von AAHyal durch Bildung reaktiver Nitrene
Die Herstellung vernetzter Schichten aus Hyaluronsäure mittels Photocrosslinking auf
silanisierten Glasplättchen oder in Mikroskopierkammern erfolgte durch Bestrahlung von
AAHyal mit UV.
Die Reaktion zur Erzeugung von AAHyal liefert bei Verwendung verschiedener
Kopplungsreagenzien unterschiedlich stark modifizierte AAHyal-Produkte. Obwohl das
Reaktionsprodukt, welches die meisten Azidophenylreste aufweist, den besten
Vernetzungsgrad liefern müsste, zeigte sich bei der Gelbildung durch die Bestrahlung mit
UV, dass AAHyal mit einem Modifizierungsgrad von 44 % AA im Molekül eher braun
verbrannt wirkt und eine echte Gelbildung nicht beobachtet werden kann. Auch bei der
Bestrahlung von AAHyal (7 % Modifikation) konnte keine Gelbildung beobachtet werden.
Erfolgreich hingegen verlief die Gelbildung von AAHyal, das einen Modifizierungsgrad von
18 % aufweist. Während der Bestrahlung mit UV kann der Beginn der Gelbildung nach etwa
10 min beobachtet werden, nach 20 min ist die Gelbildung beendet, länger andauernde UV-
Bestrahlung führte lediglich zu braun verbrannten Gelen. Die Abbildungen 4-17 zeigen
pcalAAHyal-Gele die sich während des Bestrahlungsprozesses leicht braun färben, was auf
die Bildung von Nebenprodukten hin deutet. Die Braunfärbung blieb auch nach dem
Inkubieren der Gele mit Zellen und Kulturmedium bestehen und lässt sich demnach nicht
durch Waschen entfernen.
90

Ergebnisse und Diskussion
(a)
(b)
Abbildungen 4-17: Gele aus AAHyal nach 10 min (a) und nach 20 min (b) UV-Bestrahlung
Ebenso wurde die Gelbildung für AAHyal mit zellattraktiven Substanzen untersucht. Dazu
wurde der Polymerisationslösung Collagen beigemischt, das häufig zur Beschichtung von
Zellkulturträgern verwendet wird. In Abbildung 4-18 sind die erzeugten Gele abgebildet.
Abbildung 4-18: Gele aus AAHyal (15 mg/mL) mit 1,5 mg/mL Collagen
Offenbar wurden bei der Gelbildung von AAHyal mit Collagen viele Nebenprodukte gebildet;
das Gel war sehr dunkel und wies eine sehr feste Konsistenz auf.
Die Betrachtung der gebildeten pclAAHyal-Hydrogele im Rasterelektronenmikroskop
verstärkte den Befund, dass äußerst dicht gepackte Hydrogele mit AAHyal erzeugt wurden
(Abbildung 4-19). Es war daher fraglich, inwiefern diese Hydrogele als Zellkultursubstrate
geeignet sind, da die Nährstoffversorgung der Zellen, die in einem derartigen Gerüst sitzen
durch die Poren gewährleistet sein muss.
91

Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4-19: REM-Aufnahme eines Schnittes durch ein gefriergetrocknetes pclAAHyal
Hydrogel
4.3.2 Polymerisation von VAHyal durch Bildung reaktiver Carbene
Zur Erzeugung von Hyaluronsäuregelen aus VAHyal wurden Initiatorsubstanzen der
Polymerlösung beigemischt, die bei Bestrahlung mit UV Primärradikale erzeugen. Diese
greifen in situ den Vinylrest im modifizierten Hyaluronsäuremolekül an. Infolge werden
Kohlenstoffradikale gebildet, die zu einer Quervernetzung beitragen. Die hochviskose
Lösung aus 15 mg/mL VAHyal gelöst in PBS, die 0,1 % N-Vinylpyrrolidon und 0,1 % Irgacure
enthält, wurde in eine Mikroskopierkammer pipettiert und nach 15 min mit UV-Bestrahlung
war die Gelbildung abgeschlossen. Das Gel wirkt gelb-braun gefärbt, ist jedoch
durchscheinend. Ebenso wurde eine erfolgreiche Gelbildung bei Zugabe von 2,5 mg/mL
Collagen beobachtet (Abbildungen 4-20).
(a)
Abbildungen 4-20: Gele aus VAHyal (a) und VAHyal mit 2,5 mg/mL Collagen (b)
(b)
Im Rasterelektronenmikroskop zeigt die Schnittfläche eines pclVAHyal-Hydrogels nach der
Gefriertrocknung eine relativ gleichmäßig poröse Struktur mit Kavitäten zwischen 1-10 µm,
die sich zur Einbettung von Zellen unter Beibehaltung der Durchlässigkeit für Nährmedium
nutzen ließen (Abbildung 4-21).
92

Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4-21: REM-Aufnahme eines Schnittes durch ein gefriergetrocknetes pclVAHyal
Hydrogel
4.3.3 Click-Gele werden aus ATAHyal und PAHyal gebildet
Die Kupfer-vermittelte Click-Reaktion zwischen einer Azidogruppe und einem Alkin kann
auch zur Quervernetzung entsprechend funktionalisierter Hyaluronsäurestränge genutzt
werden. Der Gelierungsprozess war bei Verwendung von CuCl bereits nach wenigen
Sekunden vollendet. In Abbildung 4-22 sind die IR-Spektren der Ausgangssubstanzen
ATAHyal und PAHyal dargestellt, ebenso das IR-Spektrum des resultierenden Click-
Derivates. Damit ließ sich der Verlust der Azido-Gruppe und des Alkin-Restes während der
Bildung des Fünfrings nachweisen.
Abbildung 4-22: IR-Spektren von ATAHyal und PAHyal die nach der CuCl katalysierten
Click-Reaktion zu einem Hydrogel vernetzen: IR-Spektrum Click-Hyal
93

Ergebnisse und Diskussion
Die Verwendung geringster Mengen des Katalysators war vor allem für die späteren
Anwendungen in der Zellkultur interessant. In den folgenden Abbildungen 4-23 sind die
Ergebnisse unterschiedlicher Zugaben einer wässrigen, 0,1 %igen CuCl-Suspension zu
sehen.
Abbildungen 4-23: Click-Gele (von links nach rechts) nach Zugabe von: 10 µL, 20 µL, 30 µL,
und 40 µL CuCl mit Durchmessern von 2 mm, 3 mm, 5 mm und 5 mm
Die unterschiedliche Größe der Gel-Stücke war allein auf die zusätzliche Flüssigkeitsmenge
zurück zu führen, die im Gel durch die Zugabe unterschiedlicher Mengen an Katalysator-
Lösung vorhanden ist. In der Literatur wird beschrieben, dass der Vernetzungsgrad direkt
über die Änderung der stöchiometrischen Reaktionsbedingungen beeinflusst werden kann.
[95]
4.3.4 Die Polymerisation von GMHyal und MAHyal
Für die Gelierung von GMHyal aus Hyal unterschiedlicher Molekulargewichte gibt die
folgende Tabelle 4-14 einen Überblick der gewonnen Gele.
Tabelle 4-14: Gele aus GMHyal mit unterschiedlichem Anteil an Photoinitiatoren
10 mg/mL gelöst in PBS
mit 0,05 % Ic und 0,05 % Vp
pclGMHyal 50 kDa → sehr viskos
pclGMHyal 350 kDa → Gel-Bröckchen
pclGMHyal 1100 kDa → Hydrogel
pclGMHyal 1200-2600 kDa → sehr viskos
10 mg/mL gelöst in PBS
mit 0,1 % Ic und 0,1 % Vp
pclGMHyal 50 kDa → sehr viskos
pclGMHyal 350 kDa → Gel-Bröckchen
pclGMHyal 1100 kDa → Hydrogel
pclGMHyal 1200-2600 kDa → sehr viskos
Aufgrund der guten Ergebnisse bei der Verwendung von GMHyal 1100 kDa wurden diese
Gele bei der Verwendung mit Zellen eingesetzt. Die REM-Aufnahmen eines Schnittes durch
ein pclGMHyal-Hydrogel nach der Gefriertrocknung zeigen die Porösität des Gels, das gut
zur Einbettung von Zellen geeignet scheint (Abbildungen 4-24)
94

Ergebnisse und Diskussion
Abbildungen 4-24: GMHyal gelöst in PBS in einer Konzentration von 20 mg/mL wird nach
Zugabe von 0,1 % Ic und 0,1 % Vp nach Bestrahlung mit UV zum Hydrogel
vernetzt, Mikroskopaufnahme (a) und REM-Aufnahme (b)
Obwohl keinerlei Modifikation der Hyaluronsäure durch MA feststellbar war, wurden dennoch
Gelbildungsversuche durchgeführt. Für alle MAHyal-Proben konnte jedoch keine Gelbildung
erzielt werden. Allerdings war es unmöglich, die Derivate in Puffer oder H 2 O dest. zu lösen.
Demzufolge war davon auszugehen, dass zwar eine Modifizierung der Hyaluronsäure
stattgefunden hat, die sich jedoch nicht sinnvoll als Trägersubstrat bzw. Gerüststruktur in der
Zellkultur einsetzen lässt.
4.4 Peptidsynthesen
4.4.1 Synthesevorstufen zur Darstellung funktionalisierter Peptide
Ahx 3
Die Darstellung des Linkers aus drei Aminohexansäure-Einheiten (Ahx 3 ) konnte mittels
Festphasensynthese durchgeführt werden. Das UV Spektrum der LC-Analyse zeigt die reine
Substanz.
AZB-NHS und VIB-NHS
Die Synthese der NHS-aktivierten Benzol-Derivate Azidobenzyl-N-hydroxysuccinimid (AZB-
NHS) und Vinylbenzyl-N-hydroxysuccinimid (VIB-NHS) konnte erfolgreich durchgeführt
werden. Die Reaktionsbedingungen entsprachen standardmäßigen Kopplungsprozessen.
Das Kopplungsreagenz DCC ließ sich durch säulenchromatographische Aufreinigung
vollständig abtrennen. Der Produktnachweis erfolgte mittels 1 H-NMR Spektroskopie.
95

Ergebnisse und Diskussion
AZB-Ahx 3 und VIB-Ahx 3
Die Kopplung des NHS-aktivierten Azidobenzoyls mit Ahx 3 an der festen Phasen erschien
zunächst problematisch, da sich das Kopplungsreagenz EDC nur im Wässrigen löst, darin
war jedoch das AZB-NHS unlöslich. Umgekehrt ist AZB-NHS in DMSO löslich, EDC
wiederum nicht. Daher wurde für die Reaktion zunächst ein Lösungsmittelgemisch aus
DMSO:H 2 O = 1:1 gewählt womit die Ankopplung erfolgreich durchgeführt werden konnte.
Das UV Spektrum bei λ = 220 nm der LCMS-Analyse zeigt das gewünschte Produkt in
ausreichender Reinheit. Eine weitere Aufreinigung vor der nächsten Umsetzung wurde nicht
vorgenommen. Das Vorhandensein der Azido-Funktionalität wurde mittels ATR-IR
nachgewiesen.
Die Kopplung des NHS-aktivierten Vinylbenzoyls mit Ahx 3 an der festen Phase lieferte nach
kurzer Reaktionszeit das gewünschte Produkt, sofern beide Edukte in DMF gelöst wurden.
Das UV Spektrum bei λ = 220 nm der LCMS-Analyse zeigte das gewünschte Produkt in
ausreichender Reinheit. Eine weitere Aufreinigung vor der nächsten Umsetzung wurde nicht
vorgenommen.
GGGR(Pbf)GD(tBu)S(Mtr)P und GGGR(Pbf)D(tBu)GS(Mtr)P
Die Synthesen ausgehend von Fmoc-Prolin-OH am Trägerharz 2-Cl-Trityl verliefen
erfolgreich mittels Fmoc-Synthesestrategie. Beide Produkte konnten massenspektrometrisch
nachgewiesen werden.
Zyklo[D(tBu)fKR(Pbf)G]
Mittels der Fmoc-Synthesestrategie konnte das lineare Peptid NH 2 -Asp(tBu)-D-Phe-
Lys(Dde)-Arg(Pbf)-Gly-OH auf dem Trägerharz 2-Cl-Trityl hergestellt werden. Es war dabei
empfehlenswert, die Synthese mit Fmoc-Glycin-OH am Harz zu beginnen, da so im späteren
Zyklisierungsschritt Racemisierung vermieden werden konnte. Die Abspaltung vom Harz
unter Beibehaltung aller Seitenketten-Schutzgruppen gelang mit 30 % HFIP in DCM.
Zyklisiert wurde das Pentapeptid in stark verdünnter Lösung. Um dabei eine unkontrollierte
Polymerisation des Produktes zu vermeiden, wurden die Kopplungsreagenzien DIC und
HOBt verwendet. Die Zyklisisierung konnte massenspektrometrisch verfolgt werden. Die
chemoselektive Abspaltung der Schutzgruppe Dde an Lysin mit Hydrazin verlief ebenfalls
bereits nach wenigen Minuten erfolgreich. Das UV-Spektrum der LCMS-Analyse bei
λ = 220 nm zeigt das gewünschte Produkt in ausreichender Reinheit. Die Isolierung des
Peptids wurde erst nach Anbindung eines Linkers durchgeführt, um verlustreiche
Reinigungsschritte zu vermeiden.
96

Ergebnisse und Diskussion
4.4.2 Die Synthese der linearen Peptide AZB-GGGRGDSP und AZB-GGGRDGSP:
Peptide, die als Linker eine Glycin-Kette tragen, an der photoreaktives Azid
gebunden ist
An der Festphase gelang die Funktionalisierung des Peptids mit der photoreaktiven Gruppe
ausgehend vom zuvor hergestellten AZB-NHS. Durch das Abspalten des Produkts vom
Trägerharz wurden gleichzeitig die Seitenketten entschützt und im UV Spektrum bei
λ = 220 nm (siehe Diagramme 4-9) der LCMS-Analyse konnte die Reinheit überprüft werden.
3000
5000
Intensität [mAu]
2500
2000
1500
1000
500
AZB-GGGRGDSP
(m/z) 847.4
Intensität [mAu]
4500
4000
500
AZB-GGGRDGSP
(m/z) 847.4
0
0 5 10 15 20 25 30
Zeit [min]
0
0 5 10 15 20 25 30
Zeit [min]
Diagramme 4-9: UV-VIS Spektren von AZB-GGGRGDSP und AZB-GGGRDGSP
4.4.3 Die Synthese der linearen Peptide VIB-GGGRGDSP und VIB-GGGRDGSP:
Peptide, die als Linker eine Glycin-Kette tragen, die den polymerisierbaren
Vinyl-Rest trägt
An der Festphase gelang die Funktionalisierung des Peptids mit der photoreaktiven Gruppe
ausgehend vom zuvor hergestellten VIB-NHS. Durch das Abspalten des Produkts vom
Trägerharz, wurden gleichzeitig die Seitenketten entschützt und im UV Spektrum bei
λ = 220 nm (siehe Diagramme 4-10) der LCMS-Analyse konnte die Reinheit überprüft
werden.
3000
1000
Vib-GGGRGDSP
(m/z) 832.5
800
Vib-GGGRDGSP
(m/z) 832.4
Intensität [mAu]
2500
500
Intensität [mAu]
600
400
200
GGGRDGSP (m/z 702.4) und
weitere Verbindung (m/z 1022.6)
0
0 5 10 15 20 25 30
Zeit [min]
0
0 5 10 15 20 25 30
Zeit [min]
Diagramme 4-10: UV-VIS Spektren von VIB-GGGRGDSP und VIB-GGGRDGSP
97

Ergebnisse und Diskussion
4.4.4 Die Synthese von AZB-Ahx 3 -zyklo[DfKRG]. Ein ringförmig aufgebautes Peptid,
das als Linker drei Aminohexansäure-Einheiten trägt, an dessen Ende ein
photoreaktiver Azid-Rest gebunden ist
Die Anbindung des photoreaktiven Linkers AZB-Ahx 3 an die freie Aminogruppe des
zyklo[D(tBu)fKR(Pbf)G] gestaltete sich zunächst schwierig. Ausgehend von der in der
Literatur beschriebenen Methode [102] mit den Kopplungsreagenzien HATU und HOAT
unter Zusatz von 2,3,5-Collidin konnte nur sehr langsam die Produktbildung sowie die
Bildung zahlreicher Nebenprodukte beobachtet werden. Vielversprechend hingegen verlief
die Kopplung unter Verwendung von HOBt unter Zusatz von DIC. Hierbei wurden deutlich
weniger Nebenprodukte beobachtet und nach 5 Tagen war die Reaktion beendet. Das
Produktgemisch wurde mit der Gradienten-HPLC-Methode aufgetrennt und das gewünschte
Produkt fraktioniert gesammelt. Anschließend wurde das Zyklopeptid vollständig entschützt
und man erhielt AZB-Ahx 3 -zyklo[DfKRG] mit nur 6,33 % Verunreinigungen. Diagramm 4-11
zeigt das UV Spektrum (λ = 220 nm) des Produktes, wie es in der Zellkultur eingesetzt
wurde.
Intensität [mAu]
400
350
300
250
200
150
100
50
Injektionssignal
3,21 %
93,67 %
AZB-zyklo(RGDfK)
(m/z) 1088.8
3,12 %
0
0 5 10 15 20 25 30
Zeit [min]
Diagramm 4-11: UV-VIS Spektrum von AZB-Ahx 3 -zyklo[DfKRG]
4.4.5 Die Synthese von VIB-Ahx 3 -zyklo[DfKRG]. Ein ringförmig aufgebautes Peptid,
das als Linker drei Aminohexansäure-Einheiten trägt, an dessen Ende ein
polymerisierbarer Vinyl-Rest gebunden ist
Die Anbindung des Linkers VIB-Ahx 3 an die freie Aminogruppe des zyklo[D(tBu)fKR(Pbf)G]
verlief analog der Darstellung des Azido-Gruppe tragenden Derivates. Ebenso wurden hier
die Kopplungsreagenzien HOBt und DIC verwendet und nach 5 Tagen konnte kein weiterer
Reaktionsumsatz mehr beobachtet werden. Die Gradienten-HPLC-Methode lieferte
fraktioniert das geschützte Zyklopeptid, das nach vollständiger Entschützung als VIB-Ahx 3 -
zyklo[DfKRG] gewonnen wurde. Es ließen sich Verunreinigungen im UV Spektrum erkennen,
allerdings zeigten nur 5,43 % davon eine detektierbare Masse. In Diagramm 4-12 ist das UV
Spektrum bei λ = 220 nm dargestellt, welches das für die Zellkultur verwendete Produkt
zeigt.
98

Ergebnisse und Diskussion
1600
51,80 %
1400
1200
VIB-zyklo(RGDfK)
(m/z) 1073.9
Intensität [mAu]
1000
800
600
400
Injektionssignal
kein Masse-Signal,
nur UV-Signal
200
1,35 %
1,94 %
2,14 %
0
0 5 10 15 20 25 30
Zeit [min]
Diagramm 4-12: UV-VIS Spektrum von VIB-Ahx 3 -zyklo[DfKRG]
4.5 RGD-Immobilisierung auf Hyaluronan
4.5.1 Die Immobilisierung photoreaktiver Peptide
Die Immobilisierung photoreaktiver Peptide auf einem Hyaluronsäuresubstrat gelang nur bei
Beachtung der Prozessreihenfolge. Dazu wurde zunächst das Hyaluronsäurederivat
immobilisiert und anschließend darauf ein strukturiertes Peptidmuster erzeugt. Eine
geeignete Reihenfolge zur Peptidimmobilisierung auf pclHyal beschreibt Kapitel 3.1.2.
4.5.2 Die Anbindung von RGDF 19 an Hyaluronsäure mittels Festphasensynthese
Die Anbindung von RGDF 19 an Hyaluronsäure mittels Festphasensynthese unter
Verwendung des Kopplungsreagenzes TFFH konnte anhand des 19 F-Spektrums nicht
gezeigt werden. Die Polymerstruktur der Hyaluronsäure ließ die eindeutige Zuweisung eines
19 F-Signals nicht zu.
4.6 Hyaluronsäurefilme und deren Einfluss auf das Zellwachstum
Zur Untersuchung von Zell-Substrat-Interaktionen bietet sich die Kultivierung von L929
Zellen auf den erzeugten Hyaluronsäurefilmen an. Es handelt sich dabei um Fibroblasten,
die aus areolaren und adipotischen Gewebe einer männlichen C3H/An Maus stammen.
Diese Mäuse weisen eine sehr hohe Inzidenz von Mammatumoren auf, aus denen die Zellen
gewonnen werden. Die L929-Zellkultur ist ein sensibles in vitro Testsystem für die
Bioverträglichkeitsprüfung von Biomaterialien.
99

Ergebnisse und Diskussion
4.6.1 Die Zelladhäsion auf verschiedenen Hyaluronsäurestrukturen lässt sich gut
bei Verwendung von GMHyal beobachten
Zur Untersuchung der Zelladhäsion auf verschiedenen Hyaluronsäurefilmen wurden
silanisierte Glasplättchen sowie N 2 -Plasma behandelte PS Substrate durch Aufschleudern
von Hyal-Lösungen beschichtet. Durch das Auflegen einer Maske während der
nachfolgenden Bestrahlung mit UV wurden Muster aus vernetzten Hyal-Strängen und
unvernetztem Hyal erzeugt. Beim anschließenden Waschen der Substrate mit Wasser wurde
das unvernetzte Hyal so weit entfernt, dass messbare Hyal-Strukturen zurück blieben. Die
Kultivierung von Zellen auf den gemusterten Substraten erfolgte in Nährmedium bei 37°C in
einem Inkubator unter 5 % CO 2 Begasung und gesättigter Luftfeuchtigkeit. Die folgende
Tabelle 4-15 wurde angelehnt an die Übersicht aus Kapitel 4.2.1 und um eine Spalte mit der
zu beobachtenden Zeladhäsion erweitert.
Tabelle 4-15: Hyal-Substratoberflächen und deren Einsatz in der Zellkultur – Übersicht mit
folgender Symbolik: „+“ entspricht „ja“, „-“ entspricht „nein“
spin-coating
von...
UV-Bestrahlung
→ Fazit
Zelladhäsion: Kristallviolett: Zellen
werden gefärbt und...
...AAHyal +
→ Photovernetzung
Bildung von pclAAHyal
..AAHyal -
→ keine Photovernetzung
AAHyal Rest-Schicht
...VAHyal +
→ Photovernetzung
Bildung von pclVAHyal
...VAHyal -
→ keine Photovernetzung
VAHyal Rest-Schicht
...GMHyal +
→ Photovernetzung
Bildung von pclGMHyal
...GMHyal -
→ keine Photovernetzung
GMHyal Rest-Schicht
-
-
-
+
nur bei gering
konzentrierter
VAHyal-Lösung
-
+
belichtete, pclAAHyal
beschichtete Bereiche
werden violett gefärbt,
wie in Kapitel 4.2.1
beobachtet
unbelichtete, pclAAHyalfreie
Bereiche
(AAHyal Rest-Schicht)
bleiben ungefärbt
belichtete, pclVAHyal
beschichtete Bereiche
werden nicht gefärbt,
obwohl in Kapitel 4.2.1
so beschrieben
unbelichtete, pclVAHyalfreie
Bereiche
(VAHyal Rest-Schicht)
bleiben ungefärbt
belichtete, pclGMHyal
beschichtete Bereiche
werden nicht gefärbt,
obwohl in Kapitel 4.2.1
so beschrieben
unbelichtete, pclGMHyalfreie
Bereiche
(GMHyal Rest-Schicht)
bleiben ungefärbt
100

Ergebnisse und Diskussion
Die Bereiche, die pclHyal-beschichtet wurden (also mit Kristallviolett anfärbbar sein sollten),
ließen bei der Besiedelung der benachbarten Hyal-beschichteten Bereiche mit Zellen häufig
keine auffällige Färbung mehr erkennen. Möglicherweise ist hier der Kontrast zwischen stark
violett gefärbter Zelle im Gegensatz zum mäßig gefärbten pclHyal-Film relativ stark, sodass
die pclHyal Bereiche „weiß“ bzw. „durchlässig“ erscheinen.
Die folgenden Abbildungen 4-25 zeigen pclAAHyal- und pclVAHyal-Strukturen auf
silanisiertem Glas nach Inkubation mit L929 nach zwei bzw. drei Tagen in vitro (DIV). Es wird
deutlich, dass die Musterbildung gelungen ist, die Zellen auf dem pclAAHyal-Substrat jedoch
ausschließlich außerhalb des pclHyal-Musters adhärierten, also auf den Hyal-Rest-
Schichten. Bei pclVAHyal-Substraten konnte bei der Verwendung sehr gering konzentrierter
VAHyal-Lösungen (1 mg/mL) zum Aufschleudern Zellwachstum auf den freigewaschenen
Bereichen des vorgegebenen Musters beobachtet werden. Deutlich ist allerdings erkennbar,
dass die Zellen das Muster an vielen Stellen bereits überwucherten. Möglicherweise sind die
Hyaluronsäurestränge hierbei derart gering vernetzt, dass sie von den Zellen schneller
verstoffwechselt werden können.
(a)
(b)
Abbildungen 4-25: L929 Zellen adhärieren nicht auf AAHyal (Muster M2) auf silanisiertem
Glas nach 2 DIV angefärbt mit Kristallviolett (a) und nur auf sehr gering
konzentrierter VAHyal (Muster M2) auf silanisiertem Glas nach 3 DIV angefärbt
mit May-Grünwalds Eosin (b)
Im Vergleich zu pclAAHyal und pclVAHyal war die Verwendung von GMHyal zur Bildung
zellweisender Muster besser geeignet. Dies zeigt sich in den Abbildungen 4-26, hier
proliferierten L929 konfluent in den Bereichen zwischen den vernetzten Hyal-Strängen.
101

Ergebnisse und Diskussion
(a)
(b)
Abbildungen 4-26: L929 Zellen adhärieren auf GMHyal (Muster M2) auf silanisiertem Glas
nach 2 DIV (a) und angefärbt mit Kristallviolett (b)
Ebenso gelang die Kultivierung von L929 auf N 2 -behandeltem PS, sofern GMHyal zur
Strukturierung verwendet wurde. Hierbei wird allerdings deutlich, dass die Musterbildung
bzw. GMHyal Immobilisierung an PS zu gering ist, die Zellen überwucherten schnell
strukturierte Bereiche (Abbildungen 4-27). Bei der Verwendung von pclAAHyal oder
pclVAHyal konnte auf PS keinerlei Zelladhäsion beobachten werden.
(a)
Abbildungen 4-27: L929 Zellen adhärieren auf GMHyal (Muster M2) auf N 2 -behandeltem PS
nach 2 DIV angefärbt mit Kristallviolett (a und b)
Generell lässt sich feststellen, dass die verwendeten Hyal-Derivate nur bedingt zur
Steuerung der Zelladhäsion geeignet sind. Auf den vernetzten Hyal-Bereichen konnte in
keinem Fall Zelladhäsion beobachtet werden. In den unvernetzten Bereichen, die zwar frei
von photochemisch immobilisierten Hyal-Strängen, jedoch nicht Hyal-frei sind, wie durch
XPS Analysen (siehe Kapitel 4.2.4) gezeigt werden konnte, wurde nur für gering
konzentriertes VAHyal und bei der Verwendung von GMHyal die Adhäsion von L929
beobachtet.
Die Zetapotenzial-Analysen bieten eine Erklärung für die verhinderte Adhäsion von Zellen
auf den pclHyal-Substraten: Bei physiologischem pH ist die Hyal-Oberfläche stets negativ
geladen. Dies gilt auch für hohe Salzkonzentrationen, wie sie in einem Nährmedium
vorliegen. Da Zellmembranen negativ geladen sind [156], ist die Adhäsion auf einem ebenso
negativ geladenen Substrat ungünstig; daher bleiben die pclHyal-beschichteten Bereiche
unbesiedelt. Die Zellen adhärierten daher auch nur schlecht bis gar nicht auf den dünnen
Rest-Schichten aus Hyal, die sich zwischen dem pclHyal befinden.
(b)
102

Ergebnisse und Diskussion
4.6.2 Durch Zugabe von FKS, FN oder PLL wird die Zelladhäsion für alle pclHyal-
Substrate ermöglicht
Die Zugabe von Fibronektin, einem natürlichen zelladhäsiven Protein, die Beimischung von
FKS zur Hyaluronsäurelösung oder die Einbettung von Poly-L-Lysin, einem synthetischen
Adhäsionsvermittler, ermöglichten die Adhäsion von L929 auf Hyalstrukturen aus pclAAHyal
und pclVAHyal. Hierbei wurden ebenso wie in Kapitel 4.6.1 tabellarisch dargestellt, pclHyal-
Bereiche nicht mit Kristallviolett angefärbt, obwohl man dies aus den Beobachtungen in
Kapitel 4.2.1 erwartet hätte. Die folgenden Abbildungen 4-28 und 4-29 zeigen beispielhaft
auf silanisiertem Glas die pclAAHyal-Strukturen zur Steuerung der Zelladhäsion.
(a)
Abbildungen 4-28: L929 Zellen angefärbt mit Kristallviolett adhärieren auf AAHyal/FN
(Muster M1) auf silanisiertem Glas nach 2 DIV (a und b)
(b)
(a)
(b)
Abbildungen 4-29: L929 Zellen angefärbt mit Kristallviolett adhärieren auf AAHyal/PLL
(Muster M2) auf silanisiertem Glas nach 2 DIV (a und b)
Auf Strukturen aus AAHyal und FKS konnte keine Zelladhäsion beobachtet werden.
Bei der Verwendung von VAHyal konnten unter Zugabe von FKS, FN und PLL sowohl auf
silanisiertem Glas als auch auf dem bioabbaubaren, mit N 2 -Plasma behandelten PLA Muster
zur Steuerung der Zelladhäsion erzeugt werden (Abbildungen 4-30, 4-31 und 4-32).
103

Ergebnisse und Diskussion
(a)
(b)
Abbildungen 4-30: L929 Zellen adhärieren auf VAHyal/FN (Muster M1) auf silanisiertem Glas
nach 2 DIV (a und b)
(a)
Abbildungen 4-31: L929 Zellen angefärbt mit Kristallviolett adhärieren auf VAHyal/PLL
(Muster M2) auf silanisiertem Glas nach 2 DIV (a und b)
(b)
(a)
Abbildungen 4-32: L929 Zellen angefärbt mit Kristallviolett adhärieren auf VAHyal/FKS
(Muster G1) auf silanisiertem Glas nach 2 DIV (a und b)
Insgesamt ist die Besiedelung mit Zellen auf den pclHyal-Substraten, die mit
Adhäsionsvermittlern gemischt hergestellt wurden, auf das Vorhandensein adsorbierter FN-,
FKS- oder PLL- Schichten zurück zu führen. In Kapitel 4.2.4 konnte durch XPS
Untersuchungen gezeigt werden, dass beispielsweise auf PLA stets eine PLL Schicht
unabhängig von einer Bestrahlung mit UV nachzuweisen ist. Es ist davon auszugehen, dass
auf allen Substraten in den nicht bestrahlten Bereichen dünne Schichten aus Hyaluronsäure
und Adhäsionsvermittler vorhanden sind, wobei der Adhäsionsvermittler dominiert und die
Anheftung von Zellen in diesen Bereichen begünstigt.
(b)
104

Ergebnisse und Diskussion
Bei der Untersuchung bioabbaubarer PLA-Membranen als Trägermaterial für eine
Beschichtung aus Hyaluronsäure und Adhäsionsvermittler zeigte sich, dass pclVAHyal-PLL-
Komposite sehr gut als Zellkultursubstrat geeignet sind. In den Abbildungen 4-33 und 4-34
sind die erzielten Ergebnisse verschiedener pclVAHyal-Komposite vergleichend dargestellt.
(a)
(b)
Abbildungen 4-33: L929 Zellen adhärieren auf VAHyal/FN (Maske M8) auf N 2 -behandeltem
PLA nach 2 DIV (a) und angefärbt mit May-Grünwalds Eosin (b)
(a)
(b)
Abbildungen 4-34: L929 Zellen adhärieren auf VAHyal/PLL (Maske M8) auf N 2 -behandeltem
PLA nach 2 DIV (a) und angefärbt mit May-Grünwalds Eosin (b)
Zusammenfassend wird deutlich, dass zur Kultivierung von L929 Zellen auf N 2 -behandeltem
PLA die Verwendung von pclVAHyal/PLL sehr gut geeignet war. Hierbei wurde die
Zelladhäsion besser durch die Strukturgebung eingegrenzt als bei der Verwendung von FN.
Für die Beimischung von FKS zur VAHyal-Lösung konnten auf PLA keine Beschichtungen
hergestellt werden, die das Zellwachstum zwischen den pclHyal-Strukturen ermöglichen.
4.6.3 Zelladhäsion auf thermogeformten, pclVAHyal/PLL bzw. VAHyal/PLLbeschichteten
Substraten eröffnet Wege zu dreidimensionaler Zellkultivierung
Die in den Kapiteln 4.6.1 und 4.6.2 beobachtete Eigenschaft der Hyaluronsäure, die
Adhäsion von Zellen zu verhindern, eröffnet neue Anwendungsmöglichkeiten auf dem Gebiet
des Tissue Engineering. Auf der Grundlage von Vorversuchen der Arbeitsgruppe Giselbrecht
wurden HepG2-Zellen (humane Hepatomzellen) zur Kultivierung auf einem thermogeformten
Substrat aus PLA und VAHyal gewählt. Bisher gelang es zwar, in den Kavitäten Zellen zu
105

Ergebnisse und Diskussion
kultivieren, auf den Stegen zwischen den Kavitäten heften sich jedoch häufig ebenfalls
Zellen an, so dass eine Mischkultur aus Zellen in einer 3D-Umgebung (in den Kavitäten) und
Zellen auf einem 2D-Untergrund (zwischen den Kavitäten) entsteht. Die folgenden Abbildung
4-35, Abbildung 4-36 undAbbildung 4-37 zeigen die Verteilung von HepG2-Zellen auf
unterschiedlich behandelten PLA Substraten als Maximumprojektionen 5 der Laserinduzierten
Fluoreszenz, die mit dem Hellfeldbild überlagert wurden. Die konfokalen
Mikroskopaufnahmen von HepG2-Zellen nach einer Vitalfärbung mit Syto16 und
Propidiumiodid (PI) belegen, dass unabhängig von ihrer Verteilung die Mehrheit der Zellen
auf allen Substraten nach 3 DIV lebt. Syto16 wird von lebenden Zellen aufgenommen, bindet
spezifisch an die DNA und fluoresziert grün; PI durchdringt die perforierte Membran toter
Zellen und fluoresziert rot.
Abbildung 4-35: HepG2-Zellen adhärieren nach 3 DIV auf PLA. Die Bestrahlung mit UV
erfolgte durch eine Maske, die eine Belichtung der Flächen um die Kavitäten
ermöglicht (Maske M8). Die Einformtiefe der Kavitäten beträgt 130 µm: Zellen
befinden sich sowohl in den Kavitäten als auch auf den Flächen dazwischen
5 Unter Maximumprojektion versteht man die Umrechnung dreidimensionaler Bilddatensätze in
zweidimensionale Projektionsbilder.
106

Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4-36: HepG2-Zellen nach 3 DIV adhärieren zwischen pclVAHyal auf PLA. Die
Bestrahlung mit UV erfolgte durch eine Maske, die eine Belichtung der Flächen
um die Kavitäten ermöglicht (Maske M8). Die Einformtiefe der Kavitäten beträgt
100 µm: Zellen befinden sich sowohl in den Kavitäten als auch am
Kavitätenrand
Abbildung 4-37: HepG2-Zellen nach 3 DIV adhärieren auf VAHyal/PLL auf PLA. Die
Bestrahlung mit UV erfolgte durch eine Maske, die eine Belichtung der Flächen
um die Kavitäten ermöglicht (Maske M8). Die Einformtiefe der Kavitäten beträgt
150 µm: Zellen befinden sich ausschließlich in den Kavitäten
Abbildung 4-35 zeigt, dass auf einer reinen PLA-Fläche HepG2-Zellen sowohl in als auch
zwischen den Kavitäten adhärierten. Wurde VAHyal auf PLA immobilisiert, so konnte auf
einem flachen, ungeformten pclVAHyal auf PLA-Substrat keinerlei Zelladhäsion beobachtet
werden. Nur wenn dieses Substrat vor der Inkubation mit Zellen thermogeformt wurde und
durch das Verstrecken des Polymers die pclVAHyal/PLL-Schicht in den Kavitäten aufreißt
107

Ergebnisse und Diskussion
wurde die Zelladhäsion ermöglicht (siehe Abbildung 4-36). Dies wurde sogar unabhängig
von der Anwendung einer Maske während des Photovernetzens von VAHyal beobachtet und
stellte dadurch eine einfache Möglichkeit zur Steuerung der Zelladhäsion in Mikrokavitäten
dar. Wurde der VAHyal-Lösung PLL beigemischt und im UV-Belichtungsprozess durch eine
entsprechend ausgerichtete Maske bestrahlt, die ausschließlich die Photovernetzung
ausserhalb der Kavitäten ermöglichte, so adhärierten HepG2-Zellen ebenfalls ausschließlich
in den Kavitäten (siehe Abbildung 4-37). Dies wurde ebenso für flache, ungeformte Substrate
beobachtet.
Durch die Verwendung von VAHyal und PLL sowie geeigneter UV-Masken konnten
zusätzlich pclVAHyal/PLL-Muster auf PLA erzeugt werden, die kleiner als die geformten
Mikrokavitäten sind. Dadurch konnte die Zelladhäsion innerhalb der Kavitäten gesteuert
werden. Die Abbildungen 4-38 zeigen die Adhäsion von HepG2-Zellen (a) und von L929-
Zellen (b) auf entsprechenden PLA Substraten, die nach VAHyal/PLL Beschichtung mit UV
durch Maske M9 bestrahlt wurden.
(a)
Abbildungen 4-38: HepG2-Zellen (a) und L929 (b) nach 3 DIV auf VAHyal/PLL auf PLA
angefärbt mit Kristallviolett. Die Bestrahlung mit UV erfolgte durch eine
Linienmaske, die Einformtiefen der Kavitäten betragen 110 µm (a) bzw. 150 µm
(b): Zellen adhärieren zwischen den pclVAHyal/PLL Linien
Es ist schwierig, die Zellen anhand der Färbung als solche zu erkennen, dies wird jedoch auf
die dreidimensionale Anordnung der Zellen in der Kavität zurückgeführt, bei der sich der
Farbstoff auf engerem Raum anlagert, als bei zweidimensionalen Zellkulturen. Deutlich
erkennbar ist, dass die Zellen zunächst zwischen den pclVAHyal/PLL Linien adhärierten
bevor sie über eine derartige Linie hinweg wuchsen (Abbildungen 4-38 a links unten) und
schließlich die gesamte Kavität ausfüllten (Abbildung nicht gezeigt). Im Gegensatz zu
anderen Techniken der Steuerung der Zelladhäsion auf dreidimensionalen Substraten [133-
135] erlaubte die gezeigte Methode basierend auf der SMART-Technologie eine räumliche
Kontrolle der Zelladhäsion innerhalb der gebildeten Mikrokavitäten.
(b)
108

Ergebnisse und Diskussion
4.6.4 Peptide ermöglichen die Zelladhäsion auf pclHyal-Filmen und die Erzeugung
kleinster Muster zur Steuerung des Zellwachstums
Zur Untersuchung der Zelladhäsion auf pclPeptid-funktionalisierten pclHyaluronsäurefilmen
wurden verschiedene Substrate und Peptide, unterschiedliche Peptidkonzentrationen und
verschiedene Belichtungsmasken evaluiert. Generell wurde, wie in Kapitel 3.1.2 schematisch
dargestellt, erst eine Hyal-Schicht durch ganzflächiges UV-Belichten erzeugt, auf der dann in
einem zweiten Schritt durch Maskenbelichtung das Peptid immobilisiert wurde. Es zeigte
sich, dass abhängig vom verwendeten Peptid Zelladhäsion beobachtet werden kann. Zudem
konnte über die geeignet Wahl der Peptidkonzentration und der Maske zur UV-Bestrahlung
ein Muster erzeugt werden, dass die Kultivierung einzelner Zellen auf einem pclHyal-
Substrat ermöglicht. Abbildung 4-39 zeigt zunächst das erzielte Zelladhäsionsmuster nach
der Immobilisierung des linearen Peptids AZB-GGGRGDSP. Hierbei folgt die Zelladhäsion
hauptsächlich der Maskenbestrahlung, d.h. überall dort, wo mittels UV das Peptid
angebunden wurde, konnte Zelladhäsion beobachtet werde. Für das lineare Peptid ist das
Muster erst bei direkter Bildüberlagerung mit der zur Bestrahlung verwendeten Maske
erkennbar.
Abbildung 4-39: Bildüberlagerung: Maske M1 überlagert L929 Zellen, angefärbt mit
Kristallviolett auf pclAAHyal und pclAZB-GGGRGDSP (0,5 mg/mL) nach 3 DIV
Deutlich besser erkennbar ist die Peptid-gesteuerte Zelladhäsion auf pclHyal, sobald
zyklische Peptide immobilisiert wurden. Dies zeigen die Abbildungen 4-40.
109

Ergebnisse und Diskussion
(a)
(b)
Abbildungen 4-40: L929 Zellen auf pclAAHyal und pclAZB-zyklo[DfKRG] (0,5 mg/mL, Maske
M1) und auf pclVAHyal und pclAZB-zyklo[DfKRG] (0,5 mg/mL, Maske M2)
jeweils nach3 DIV (a und b: angefärbt mit Kristallviolett)
Bis auf VIB-GGRGDSP war für alle anderen Peptide die Kultivierung von L929 auf den
pclHyal-Derivaten möglich. Bei der Verwendung von VIB-GGRGDSP wird möglicherweise
durch die Verwendung der Photoinitiatoren Ic und Vp das Peptid derart ungünstig auf der
pclHyal-Oberfläche photochemisch verknüpft, dass keine Integrin-attraktiven Sequenzen für
die Zellen erreichbar bleiben.
Den Nachweis der Peptid-gesteuerten Zelladhäsion lieferte die Immobilisierung von AZB-
GGGRDGSP. Bei diesem Peptid ist die zellbindende Sequenz RGD zu RDG vertauscht und
für die Integrin-Rezeptor-Wechselwirkung damit ungeeignet. Tatsächlich konnte auf einer
derartigen Oberfläche keine Zelladhäsion beobachtet werden. Dazu wurden die Peptide
großflächig mit Hilfe eines PDMS Stempels (siehe Kapitel 3.1.2) auf pclHyal-Oberflächen
aufgebracht, photoimmobilisiert und die Substrate mit L929 Zellen inkubiert. Die folgenden
Abbildungen 4-41 zeigen, dass nur bei der Verwendung der Integrin-bindenden Sequenz
RGD, anstelle von RDG, Zelladhäsion beobachtet werden konnte.
(a)
(b)
Abbildungen 4-41: L929 Zellen auf pclAAHyal und pclAZB-GGGRGDSP (0,5 mg/mL) und auf
pclAAHyal und pclAZB-GGGRDGSP (0,5 mg/mL) jeweils nach 3 DIV (a und b:
angefärbt mit Kristallviolett)
Um die Grenzen der Peptid-gesteuerten Zelladhäsion auf pclHyal-Derivaten zu untersuchen,
wurden unterschiedlich konzentrierte Peptid-Lösungen verwendet. Es konnte gezeigt
werden, dass auch bei Konzentrationen von 0,25 mg/mL der Peptidlösung, die zum
Aufschleudern verwendet wurde, die zyklischen Peptide in ausreichender Anzahl als
110

Ergebnisse und Diskussion
Integrin-Bindungspartner zur Verfügung stehen (Abbildungen 4-42, 4-43 und 4-44), während
die linearen Peptide vermutlich nicht mehr in genügender Anzahl zur Bindung von Zellen
vorliegen (ohne Abbildung, da keine Zelladhäsion sichtbar).
(a)
(b)
Abbildungen 4-42: L929 Zellen auf pclAAHyal und pclAZB-zyklo[DfKRG] (0,25 mg/mL,
Maske M2) jeweils nach 5 DIV (a: angefärbt mit Kristallviolett)
(a)
(b)
Abbildungen 4-43: L929 Zellen auf pclAAHyal und pclVIB-zyklo[DfKRG] (0,25 mg/mL, Maske
M2) jeweils nach 5 DIV (a: angefärbt mit Kristallviolett)
(a)
(b)
Abbildungen 4-44: L929 Zellen auf pclVAHyal und pclAZB-zyklo[DfKRG] (0,25 mg/mL,
Maske M2) und auf pclVAHyal und pclVIB-zyklo[DfKRG] (0,5 mg/mL, Maske
M1) jeweils nach 5 DIV (a und b: angefärbt mit Kristallviolett)
Insgesamt lag die Grenze zur Steuerung der Zelladhäsion auf pclHyal-Derivaten bei
0,1 mg/mL Peptidlösung, die zum Aufschleudern verwendet wurde. Bei niedriger
konzentrierten Lösungen konnte keine Zelladhäsion mehr beobachtet werden, die Integrin-
111

Ergebnisse und Diskussion
Bindungsstellen liegen möglicherweise zu weit voneinander entfernt. Detailliert konnten dies
Calvacanti et al. zeigen. Durch Anordnung RGD-funktionalisierter Gold-Cluster in speziellen
Abständen konnte nachgewiesen werden, dass bei einem Abstand von 108 nm zwischen
den einzelnen Integrinbindungspartnern kein konfluentes Zellwachstum mehr erzielt werden
kann. [157] Wurde die Peptidlösung höher konzentriert, so adhärierten schnell viele Zellen
auf engem Raum, so dass sich Zellhaufen bildeten, die sich vom Substrat lösten und im
Kulturmedium schwammen.
Zur Untersuchung der Strukturierungsminima wurden aufgrund der beschriebenen Resultate
Peptidlösungen der Konzentration 1 mg/mL sowie N 2 -Plasma behandeltes PS als
Trägersubstrat verwendet. Zunächst konnte bei der Verwendung einer Maske, die UVdurchlässige
Bereiche im Bereich von 2500 µm 2 aufweist (M7), eine deutliche Steuerung der
Zelladhäsion beobachtet werden (Abbildungen 4-45).
(a)
(b)
Abbildungen 4-45: L929 Zellen angefärbt mit Kristallviolett nach 4 DIV auf pclAAHyal und
pclAZB-zyklo[DfKRG] (1 mg/mL) (a) und auf pclAAHyal und pclVIBzyklo[DfKRG]
(1 mg/mL) (b) (Maske M7)
Die Verwendung einer Maske, deren UV-durchlässige Bereiche lediglich 400 µm 2 betragen
(M6), erlaubte ebenso die Adhäsion einzelner Zellen auf pclHyal-Oberflächen. Wie in den
Abbildungen 4-46 gezeigt, konnte für das pclAZB-zyklo[DfKRG] eine gezielte Strukturierung
erzielt werden.
(a)
(b)
Abbildungen 4-46: L929 Zellen angefärbt mit Kristallviolett nach 3 DIV auf pclAAHyal und
pclAZB-zyklo[DfKRG] (1 mg/mL) (a) und auf pclVAHyal und pclAZBzyklo[DfKRG]
(1 mg/mL) (b) (Maske M6)
112

Ergebnisse und Diskussion
Für das analoge Peptid pclVIB-zyklo[DfKRG] konnte keine sinnvolle Strukturierung in diesem
Maßstab erzeugt werden. Hierbei spielt sicherlich die Verwendung der Photoinitiatoren Ic
und Vp die entscheidende Rolle: eine möglicherweise ungünstige photochemische
Anbindung der Peptidmenge (wie bereits bei dem linearen Peptid VIB-GGGRGDSP
diskutiert) in diesem eng begrenzten Bereich bedingt die eingeschränkte Verfügbarkeit zur
Rezeptor-Wechselwirkung. Insgesamt konnten für pclPeptid-Strukturen, die kleiner als
400 µm 2 sind, keine Zelladhäsion auf den pclHyal-Substraten beobachtet werden.
Nach der Fixierung der Zellen wurde das Zytoskelett mittels Phalloidin-Anbindung
dargestellt. Der grün fluoreszierende Alexa 488 Farbstoff konjugiert an Phalloidin färbt die
Aktinfilamente und zeigt die Anpassung der Zellform an die zellfreundliche (pclPeptid) bzw.
zellabweisende (pclHyal) Umgebung. Die folgenden Abbildungen 4-47 und 4-48 zeigen L929
Zellen auf pclPeptid-pclHyal-Substraten nach der Aktin-Färbung.
(a)
(b)
Abbildungen 4-47: Aktin-Färbung von einzeln adhärierten L929 Zellen nach 3 DIV auf
pclAAHyal und pclAZB-zyklo[DfKRG] (1 mg/mL) (a) und auf pclVAHyal und
pclAZB-zyklo[DfKRG] (1 mg/mL) (b) (Maske M6)
(a)
(b)
Abbildungen 4-48: Aktin-Färbung von einzeln adhärierten L929 Zellen nach 3 DIV auf
pclAAHyal und pclVIB-zyklo[DfKRG] (1 mg/mL) (a) und auf pclVAHyal und
pclVIB-zyklo[DfKRG] (1 mg/mL) (b) (Maske M6)
113

Ergebnisse und Diskussion
In Abbildungen 4-48 a lagen die Zellen sehr dicht beeinander und adhärierten nicht dem
pclPeptid-Muster entsprechend (vgl. Maske M6). Dennoch konnte grundsätzlich die
Anbindung einzelner L929 Zellen beobachtet werden, vergleichbar zu den anderen
Substraten der Abbildungen 4-47 und Abbildungen 4-48 b. Dennoch wiesen sie eine runde
Form auf und meiden das Ausbreiten des Zytoskeletts. Der Fehler könnte bei der
Präparationsmethode liegen, möglicherweise wurde durch Lichtstreuung auch auf
unerwünschten Bereichen das Peptid photovernetzt.
Besonders deutlich wurde die eingeschränkte Zellmotilität auf der reinen pclHyal-Oberfläche
durch die Ausbildung sehr dünner, langgestreckter Aktinfilamente, die sich in
Bewegungsrichtung ausbreiten und die Zellumgebung „erfühlen“. So wird einerseits die neue
Bewegungsrichtung der Zelle eingeleitet, andererseits auch der Kontakt zu anderen Zellen
hergestellt. In Abbildung 4-49 ist die Ausbildung eines Zell-Zell-Kontaktes zu erkennen.
Abbildung 4-49: Aktin-Färbung von L929 Zellen nach 3 DIV auf pclVAHyal und pclVIBzyklo[DfKRG]
(1 mg/mL, Maske M6)
Die Theorie zur Steuerung der Zelladhäsion auf Hyaluronsäure-Filmen durch
Immobilisierung zellattraktiver RGD-Peptide kann mit den vorgestellten Ergebnissen
bestätigt werden. Bereits Kaufmann et al. konnten zellabweisende Proteingele durch
chemische Anbindung von RGD-Einheiten in für Osteoblasten adhäsionsvermittelnde Gele
umwandeln. [158] Ebenso gelang die Herstellung bioaktiver RGD-PEGDA-Makromere, die
zum Hydrogel vernetzt die Adhäsion von Fibroblasten und Endothelzellen verbessern. [117,
159] In dieser Arbeit konnte mittels UV-Bestrahlung durch eine Maske die Hyaluronsäure-
Oberfläche selektiv mit RGD-Peptiden belegt werden. Damit gelang es, definierte
Zelladhäsionsbereiche auf dem Hydrogel zu erzeugen.
114

Ergebnisse und Diskussion
4.6.5 Die quantitative Analyse negativ geladener Kolloide auf Hyaluronsäurefilmen
liefert Erklärungsansätze zum Einfluss der Oberflächenladung bei
Zelladhäsionsprozessen
In den Kapiteln 4.6.2 und 4.6.3 zur Untersuchung der Zelladhäsion auf Hyal- bzw. pclHyal-
Substraten wurde gezeigt, dass nur dann auf Hyal-Derivaten die Adhäsion von Zellen
beobachtet werden kann, wenn diese Bereiche nicht UV-vernetzt sind (ausreichend für
GMHyal) oder wenn zusätzliche Adhäsionsfaktoren (FN, PLL oder FKS) beigemischt wurden
(AAHyal und VAHyal). Zudem konnte in Kapitel 4.2.5 durch Messung der Zetapotenziale auf
verschiedenen Oberflächen gezeigt werden, dass abhängig von der UV-Belichtung während
der Filmprozessierung unterschiedliche Potenziale gemessen werden. Für unbelichtete
Filmadsorbate (VAHyal/PLL) liegen die Zetapotenziale zumindest für gering konzentrierte
Salzlösungen im Bereich –50 mV, bei UV-belichteten Bereichen werden -70 mV gemessen.
Dieser signifikante Unterschied der Oberflächenladung kann möglicherweise entscheiden für
die Zelladhäsion sein. Nach der Inkubation UV-behandelter Hyal-Filme auf den Substraten
mit negativ geladenen, fluoreszierenden Kolloiden konnte über die Messung der
Fluoreszenz-Intensität die Kolloid-Adhäsion quantifiziert werden. (Ohne UV-Behandlung
würde nur die Ablösung der Hyal-Schicht beobachtet werden.)
Beispielhaft sind in den Abbildungen 4-50 die Fluoreszenzaufnahmen für carboxylierte
Polystyrol-Kolloide auf VAHyal+PLL und pclVAHyal+PLL (immobilisiert auf silanisiertem
Glas) dargestellt.
(a)
(b)
Abbildungen 4-50: Kolloidadhäsion auf VAHyal/PLL (a) und pclVAHyal/PLL (b), detektiert
durch Laseranregung bei λ = 561 nm
Für unterschiedliche Substrate ergeben sich die in Tabelle 4-16 aufgelisteten
Fluoreszenzintensitäten (ausgewertet mit Hilfe der Software ImageJ).
115

Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 4-16: Fluoreszenz-Intensiäten nach Kolloidadhäsion auf verschiedenen Substraten
gemittelt aus mindestens sechs Messungen je Substrat
Trägersubstrat Beschichtung mittlere Fluoreszenzintensität
pclAAHyal 3,59
AAHyal 20,18
pclVAHyal 6,25
silanisiertes Glas
VAHyal 29,60
pclAAHyal + PLL 12,38
AAHyal + PLL 8,67
pclVAHyal + PLL 8,97
VAHyal + PLL 32,36
pclVAHyal 4,45
N 2 -PLA
VAHyal 16,29
pclVAHyal + PLL 4,68
VAHyal + PLL 17,05
Zunächst wurden die Beschichtungen auf silanisiertem Glas ohne Zugabe von PLL
analysiert. Vergleicht man hierbei die Fluoreszenzintensitäten für belichtete und unbelichtete
Substrate, so zeigt sich eindeutig, dass auf den pcl-Beschichtungen eine signifikant
geringere Intensität gemessen wurde, als auf den unbestrahlten Beschichtungen. Dieser
Befund kann mit den Beobachtungen bei den Messungen der Zetapotenziale (siehe Kapitel
4.2.5) erklärt werden: bei physiologsichem pH (zur Inkubation der Substrate wurden Partikel
in Nährmedium eingesetzt) liegt die pclHyal Oberfläche negativ geladen vor. Daher konnten
die negativ geladenen Partikel nur schlecht auf der pclHyal Oberfläche adhärieren, geringe
Fluoreszenzintensität wurde detektiert. Wurde nicht UV bestrahlt und es verbleibt damit nach
Beschichtung und Waschen des Substrates nur eine äußerst dünne, möglicherweise
inhomogene Rest-Schicht aus Hyal auf der Oberfläche, so können die Partikel einfach auf
der Oberfläche adhärieren, deutlich intensivere Fluoreszenz wurde detektiert.
Vergleicht man nun die Hyal-Beschichtungen miteinander, die zusätzlich noch PLL enthalten,
so ergibt sich wiederum ein deutlicher Unterschied für die Fluoreszenzintensitäten. Für
VAHyal/PLL auf silanisiertem Glas wurden Fluoreszenzintensitäten von 32,36 gemessen. Im
Vergleich dazu auf der pclVAHyal/PLL Beschichtungen nur eine Intensitäte von 8,97.
Umgekehrt verhält es sich für die Messung der Fluoreszenzintensitäten von AAHyal/PLL
(8,67) und pclAAHyal/PLL (12,38) auf silanisiertem Glas. Offenbar adsorbierten hierbei mehr
Partikel auf der UV-vernetzten Beschichtung, der Unterschied zwischen der
Fluoreszenzintensität ist jedoch signifikant geringer als für alle anderen Beschichtungen. Die
höchste Fluoreszenzintensität und damit die stärkste Kolloid-Adhäsion wurde auf
VAHyal/PLL gemessen. Dieses Ergebnis stimmt mit der beobachteten Zelladhäsion auf
ebensolchen Substraten überein.
Die Analyse der Beschichtungen auf N 2 -behandeltem PLA ergiebt wiederum einen
signifikanten Unterschied für die Kolloidadhäsion auf pclVAHyal bzw. VAHyal sowie
pclVAHyal/ PLL und VAHyal/PLL. Auch hier konnte wieder die höchste Fluoreszenzintensität
auf VAHyal/PLL beobachtet werden. Allerdings birgt die Verwendung von PLA auch das
Riskio der Lichtbrechung und Streuung, da das Folienmaterial keine vergleichbare
Transparenz wie Glas aufweist.
116

Ergebnisse und Diskussion
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass deutlich mehr negativ geladene Kolloide auf
einer Hyal-Oberfläche adhärierten, die nicht UV-bestrahlt wurde und aus polyanionischer
Hyaluronsäure und dem Polykation PLL aufgebaut war. Die Zugabe von PLL kann daher in
der Zellkultur ebenfalls durch die Erhöhung der positiven Oberflächenladung als
Adhäsionsvermittler dienen.
4.7 Hyaluronsäuregele und deren Einfluss auf verschiedene Zelllinien
Zur Untersuchung von Zellen in einem 3D-Hyal-Gel bieten sich vor allem Zelllinien an, die
ihrerseits selbst zur Vaskularisierung unter Zugabe verschiedener Wachstumsfaktoren
neigen. Dies sind beispielsweise Endothelzellen: verwendet werden EOMA-Zellen
(Hämangioendothelioma Zellen aus Maustumoren) und Hela-Zellen (menschliche
Epithelzellen eines Zervixkarzinoms). EOMA-Zellen können prinzipiell noch zu
Endothelzellen ausdifferenzieren, deren Funktion beispielsweise in der Auskleidung von
Blutgefäßen besteht. Hela-Zellen hingegen sind epitheloide Zellen, die nicht weiter
ausdifferenzieren können, sich jedoch epithelartige zusammen anordnen können.
Bei der Verwendung von Zellen in pclHydrogelen waren neben der geeigneten Zellzahl je
Kavität die Einflüsse aller Gelbildungsparameter, wie UV-Licht und die Verwendung von
Photoinitiatoren auf die Zellen auch in Abwesenheit der Hydrogele zu untersuchen, um
mögliche Beeinflussungen der Zellen dadurch einschätzen zu können.
4.7.1 Einfluss der Zelldichte und der Polymerisationsbedingungen auf die Vitalität
von EOMA-Zellen und Hela-Zellen
Die Inkubationsversuche für Zellen in pclHydrogelen wurden in speziellen Mikrokammern der
Firma ibidi (siehe Kapitel 3.1.2) durchgeführt, die ein Volumen von 10 µL für das Zell-Gel und
50 µL für einen Überstand an Nährmedium bereit halten. Zur Ermittlung einer geeigneten
Zellzahl je 10 µL Gesamtvolumen in den Kavitäten wurden 20000, 40000 und 60000 Zellen
in oder auf Collagen-Gelen inkubiert. Eine Vitalfärbung nach drei Tagen und die Auswertung
am Fluoreszenz-Mikroskop ergaben keinen signifikanten Unterschied für die gewählten
Zellzahlen. Weitere Versuchen wurden daher mit 20000 Zellen und 40000 Zellen je Kavität
durchgeführt.
Zusätzlich wurden EOMA-Zellen auf die Verträglichkeit gegenüber UV-Strahlung sowie die
Photoinitiatoren Ic und Vp getestet. Eine Vitalfärbung wurde mit CalceinAM und
Propidiumiodid (PI) durchgeführt. CalceinAM liegt als Acetoxymethylester (AM) vor und wird
nach der Aufnahme über die Zellmembran von zytoplasmischen Esterasen hydrolysiert.
Dadurch wird es in grün fluoreszierendes Calcein umgewandelt, das in der Lage ist,
zelluläres Ca 2+ zu binden. Der Chelatkomplex bleibt in der Zelle, da er die Membran in dieser
Form nicht mehr passieren kann. PI hingegen durchdringt die poröse Membran toter Zellen,
jedoch nicht die intakte Membran lebender Zellen. In der toten Zelle interkaliert es in die DNA
und fluoresziert rot.
117

Ergebnisse und Diskussion
Nach 2 DIV konnten keine signifikanten Unterschiede gegenüber Zellen, die nur in
Nährmedium kultiviert wurden, festgestellt werden, wie in den Abbildungen 4-51 zu erkennen
ist. Dargestellt sind die Maximumprojektionen der Laser-induzierten Fluoreszenz konfokaler
Mikroskopaufnahmen.
(a)
(b)
Abbildungen 4-51: EOMA-Zellen gefärbt mit CalceinAM (grün, lebend) und PI (rot, tot) nach
2 DIV in Nährmedium ohne nach Bestrahlung mit UV (a) und nach Inkubation
mit 0,1 % Ic/Vp sowie UV-Bestrahlung (b)
Zwar sind nicht nur ausschließlich lebende Zellen (grün fluoreszierend) zu sehen, auch rot
gefärbte Zellkerne (tote Zellen) befinden sich in den Mikrokammern; insgesamt überwiegt
allerdings der Anteil der lebenden Zellen.
Beim Test der Polymerisationsbedingungen auf die Vitalität von Hela-TurboGreen-Actin
Zellen konnte beobachtet werden, dass sich bei Zugabe von Ic/Vp ins Nährmedium die Form
der Zelle änderte (Abbildungen 4-52). Diese Zellen sind kommerziell erhältlich und besitzen
durch das Einbringen von Fremd-DNA gün fluoreszierendes (TurboGreen) humanes ß-Aktin,
sodass das Zytoskelett ohne Färbung bei Anregung fluoresziert. So ließ sich besonders gut
die Ausbildung des Zytoskeletts in einem Hydrogel beobachten.
(a)
(b)
Abbildungen 4-52: Transfizierte Hela-Zellen nach 2 DIV in Nährmedium nach UV-
Bestrahlung (a) und nach Inkubation mit 0,1 % Ic/Vp sowie UV-Bestrahlung (b)
118

Ergebnisse und Diskussion
Deutlich sind die Unterschiede in der Ausbildung des Zellgerüsts zu erkennen. Während die
ausschließlich UV bestrahlten Zellen sich auf dem Boden des Kulturgefäßes (ibidi-
Mikrokammer) ausbreiteten und dabei ihre Aktinfilamente in verschiedene Richtungen
streckten, scheinen die Photoinitiatoren Ic und Vp im Medium die Zelladhäsion negativ zu
beeinflussen. Das Zytoplasma hatte eine runde Kugel gebildet, die Zellkerne waren nicht
mehr deutlich zu erkennen, die Zellen adhärierten nicht und konnten weggespült werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kultivierung von EOMA-Zellen und Hela-Zellen
unter den genannten Bedingungen äußerst schwierig ist. Die Mikrokammern weisen ein sehr
kleines Volumen für die Überschichtung mit Nährmedium auf. Verdampft Wasser aus dem
geringen Mediumvolumen, so ändert sich rasch die Osmolarität, zusätzliche Stressfaktoren
wie Temperaturschwankungen in dem kleinen Kulturbehältnis sind ebenfalls zu
berücksichtigen. Der Einfluss von UV-Strahlung ist für die Zellen am besten zu tolerieren.
Allerdings ist die Verwendung von Irgacure und Vinylpyrrolidon trotz in der Literatur
angegebener Zytokompatibiltät problembehaftet und nicht für jede Zelllinie möglich.
4.7.2 Kultivierung von Zellen in Hyaluronan-Gelen
Die Einbettung von Zellen in ein Hydrogel erforderte ein geeignetes Pipettierschema, um
gleichmäßig in allen Mikroskopkammern Hydrogel und Zellen vermischt zu polymerisieren.
Dazu wurde eine Zellstammlösung und eine Hydrogelstammlösung hergestellt, beide
Lösungen werden in entsprechenden Volumen miteinander gemischt und aus der
resultierenden Zell-Hydrogel-Mischung wurden die Mikroskopkammern befüllt. Nach der
Bestrahlung mit UV wurde mit Nährmedium überschichtet und inkubiert.
Wurden EOMA-Zellen in Hydrogele einpolymerisiert so ließ sich nach 2 DIV keine Zellvitalität
in den pclHydrogelen mehr feststellen. In den Abbildungen 4-53 sind die
Maximumprojektionen der Laser-induzierten Fluoreszenz konfokaler Mikroskopaufnahmen
nach der Vitalfärbung mit CalceinAM und Propidiumiodid gezeigt. Deutlich lässt sich die
dreidimensionale Verteilung der Zellen in den pclHydrogelen (Abbildungen 4-53 a und b)
erkennen, da sich viele Zellen im Fokus bzw. davor oder dahinter befinden.
(a)
(b)
119

Ergebnisse und Diskussion
(c)
(d)
Abbildungen 4-53: EOMA-Zellen gefärbt mit CalceinAM und PI nach 2 DIV in pclVAHyal (a),
in pclGMHyal (b) sowie in Click-Hyal (c) und in Click-Hyal-Edukten ohne
Zugabe von Cu(I)Cl (d)
Obwohl für EOMA-Zellen im Vorversuch gezeigt werden konnte, dass Ic und Vp toleriert
werden, war die erfolgreiche Kultivierung in pclVAHyal oder pclGMHyal nicht möglich. Viele
Zellen wiesen rot fluoreszierende Zellkerne (tote Zellen) oder ein kugelförmig ausgebildetes
Zytoskelett auf, was darauf hindeutet, dass die Zelle keine Adhäsionspunkte im pclHydrogel
finden konnte. In Abbildungen 4-53 d konnten viele lebende Zellen nachgewiesen werden,
was bedeutet, dass die Hyal-Derivate ATHyal und PaHyal zur Bildung des Click-Hyal von
den Zellen toleriert werden. Allerdings wurde hierbei ohne die Zugabe des zelltoxischen
Cu(I)Cl Katalysator kein Gel gebildet, sodass hier die Zellen nur auf dem Boden des
Kulturgefäßes adhärierten und nicht dreidimensional verteilt, wie es die Maximumprojektion
der konfokalen Mikroskopaufnahme vermuten lässt.
Die Anwendung methacrylierter Hyaluronsäure zur Einbettung von Zellen wird bereits
erfolgreich von Khademhosseini et al., Gerecht et al. und Figalle et al. angewendet. [99, 78,
79] In der vorliegenden Arbeit konnten jedoch keine zufriedenstellenden Ergebnisse bei der
Verwendung von pclGMHyal als pclHydrogel erzielt werden. Teilweise war die
Hydrogelbildung nicht reproduzierbar, sodass die Zellen schlichtweg auf dem Boden der
Mikroskopkammer adhärierten. Oder die Zellen wurden dreidimensional eingebettet, zeigten
jedoch nach 2-3 DIV keine Vitalität mehr.
Bei der Verwendung von ATAHyal und PAHyal führt das zugesetzte CuCl zur Bildung von
Click-Hyal zum Absterben der Zellen. Hier wurde auf einen Vorversuch verzichtet, da bereits
geringste Mengen an Kupfer zelltoxisch wirken, was sich mit diesem Versuch bestätigt hatte.
Obwohl die Fluoreszenbilder für EOMA in pclAAHyal viele rot gefärbte Zellen zeigen, lässt
sich deutlich ein vitaler Zellhaufen erkennen. Abbildungen 4-54 a zeigt die
Maximumprojektion die Überlagerung der einzelnen Fluoreszenzkanäle konfokaler
Mikroskopaufnahmen in der Draufsicht, Abbildungen 4-54 b zeigt äquivalent die
Seitenansicht.
120

Ergebnisse und Diskussion
(a)
(b)
Abbildungen 4-54: EOMA-Zellen gefärbt mit CalceinAM und PI nach 2 DIV in pclAAHyal
Draufsicht (a) und Seitenansicht (b)
Hierbei sind sowohl in der Draufsicht als auch in der Seitenansicht des pclHydrogels die
vitalen EOMA-Zellen klar zu erkennen. Möglicherweise nutzten Zellen im Zellverband
sehrwohl das Hydrogel als Stützgerüst und konnten ihre Vitalität über den ermittelten
Zeitraum von 2 DIV erhalten. Einzelne Zellen sterben jedoch ab und konnten daher nur tot
detektiert werden.
Die Verwendung von pclAAHyal/Collagen- oder pclVAHyal/Collagen- Gemischen zur
Einbettung von EOMA-Zellen trug in keinem Fall zur Steigerung der Zellvitalität bei.
121

Zusammenfassung und Ausblick
5 Zusammenfassung und Ausblick
5.1 Zusammenfassung
Ziel dieser Arbeit war die Synthese, Charakterisierung und in vitro Anwendung von
Substraten auf Basis der Hyaluronsäure. Neben der Untersuchung der Prozessierbarkeit
verschiedener Hyal-Derivate auf unterschiedlichen Trägersubstraten stand die Entwicklung
von Hyal-Strukturen zur Steuerung der Zelladhäsion im Vordergrund.
Da Hyaluronsäure nur in wässrigen Lösungsmitteln löslich ist, verlief die Herstellung
verschiedener Hyal-Derivate vor allem mit dem in Wasser wirksamen Kopplungsreagenz
EDC erfolgreich. So konnte die Carboxylgruppe der Glucuronsäure-Untereinheit sowohl mit
photoreaktiven Anilin-Derivaten funktionalisiert werden, als auch mit weiteren
Aminogruppe(n)-tragenden Molekülen. Darüber hinaus gelang die Umsetzung von
Hyaluronsäure mit Acrylsäurederivaten über eine Esterifizierung der N-Acetyl-Glucosamin-
Untereinheit zu einem Produkt, das mittels Photoinitiatoren die Quervernetzung der Hyal-
Stränge ermöglichte. Die Modifizierungen der Hyaluronsäure konnten spektroskopisch ( 1 H-
NMR, UV/Vis, IR) nachgewiesen werden, wobei der Grad der Funktionalisierungen für die
verschiedenen Hyal-Derivate stark variierte. Alle in dieser Arbeit synthetisierten Hyal-
Derivate konnten durch einfache Filtriertechniken so rein gewonnen werden, dass ihr Einsatz
als lichtdurchlässige Beschichtung bzw. als Hydrogel zur Entwicklung mikroskopierbarer
Zellkultursubstrate möglich war.
Um Schichten aus Hyal auf unterschiedlichen Substraten mittels spin-coating deponieren zu
können, mussten die Substrate hydrophiliert werden, damit eine optimale Verteilung der
wässrigen Hyal-Lösungen auf den Substratoberflächen gewährleistet werden konnte. Die
Hydrophilie wurde mittels Kontaktwinkelmessungen überprüft. Als geeignet erwiesen sich
silanisierte Glasplättchen (ideal für Mikroskopaufnahmen), N 2 -Plasma behandelte PS-
Oberflächen (vergleichbar mit den standardmäßig verwendeten Petrischalen) und N 2 -
Plasma-behandelte PLA-Folien (ein weiteres biokompatibles, aber zusätzlich bioabbaubares
Polymer).
Durch spin-coating und anschließende Bestrahlung mit UV konnten dünne, wasserunlösliche
Schichten aus quervernetzem Hyal (= pclHyal) auf dem Substrat immobilisiert werden.
Wurde die Bestrahlung durch eine photolithographische Maske vorgenommen, konnte das
Hyal strukturiert vernetzt werden. Die Dicken der gebildeten pclHyal-Schichten wurden mit
Hilfe der Quarzmikrogravimetrie, der Laserscan-Mikroskopie und AFM Messungen bestimmt.
Dabei zeigte sich, dass die Quarzmikrogravimetrie für Schichten im Bereich kleiner 20 nm
ungeeignet ist, da der Fehler durch Entnehmen und Einbauen der Schwingquarze in die
Messapparatur vor und nach der Beschichtung für eine genaue Messung in dem Bereich zu
groß ist. Neben der Schichtdickenbestimmung erlaubten AF- und Laserscan-Mikroskopie
zusätzlich die Abbildung der photolitographisch erzeugten pclHyal-Muster.
Für die verschiedenen Hyal-Derivate auf Glas bzw. PS wurden Schichtdicken zwischen
143 nm (pclAAHyal auf silanisiertem Glas) und 79 nm (pclVAHyal auf N 2 -behandeltem PS)
erzeugt. Für PLA konnte kein Schichtdickennachweis mittels QCM durchgeführt werden, da
122

Zusammenfassung und Ausblick
die Polymerfolie nicht auf dem Schwingquarz befestigt werden kann. Zudem konnte für PLA
keine Schichtdicke/Strukturtiefe ermittelt werden, da die Substratrauigkeit dieselbe
Größenordnung wie die Strukturtiefen hatte. Strukturen aus pclGMHyal bildeten hingegen
stets eine derart dünne Schicht, dass sich diese selbst mit AFM nicht messen ließ.
Die Überprüfung der Filmprozessierung und Strukturentwicklung von pclHyal-Derivaten und -
Kompositen auf verschiedenen Substraten erfolgte mittels Röntgen-
Photoelektronenspektroskopie (XPS). Damit wurde nachgewiesen, dass bei der
Immobilisierung von VAHyal auf PS nicht die Photoinitiatoren den Bindungsprozess
vermitteln. Ebenso konnte gezeigt werden, dass auf Hyal-beschichteten Substraten die nicht
der UV-Bestrahlung ausgesetzt wurden, auch nach einem Waschschritt zur Entfernung
überschüssiger Hyal-Reste eine Hyal-Adsorbatschicht zurück bleibt, welche nachhaltig die
Oberflächeneigenschaften beeinflusst. Diese Hyal-Adsorbate sowie auch pclHyal-Derivate
erzeugen eine negative Oberflächenladung auf dem Substrat, die den isoelektrischen Punkt
stark erniedrigen und damit Proteinadhäsion (aus dem Zellkulturmedium) oder die direkte
Anbindung von Zellen nicht begünstigen. Erst die Verwendung zusammengesetzter
Schichten aus Hyal-Adsorbat und dem Polykation Poly-L-Lysin bildete eine weniger stark
geladene Oberfläche, die die Anlagerung von Ionen aus dem Nährmedium, sowie die
Protein- und Zelladhäsion ermöglicht.
Zur in vitro Validierung der Biokompatibilität und adhäsionsvermittelnden Eigenschaften
flacher, strukturierter pclHyal-Substrate wurden Fibroblasten (L929 Zellen) verwendet. Dabei
zeigte sich, dass pclAAHyal und pclVAHyal nicht zur Steuerung der Zelladhäsion genutzt
werden konnten. Die negativ geladenen Oberflächen (ermittelt durch Messungen des
Zetapotenzials) erschwerten sowohl auf als auch zwischen den pclHyal-Strukturen das
Anheften von Zellen; die pclHyal-Schichten verhalten sich sogar Protein-abweisend. Einzig
bei der Verwendung von GMHyal konnte in den pclGMHyal Zwischenräumen (also auf
GMHyal) Zelladhäsion beobachtet werden. Dies zeigte, dass GMHyal grundsätzlich als
Zellgerüstmaterial geeignet wäre, wie bereits von anderen Gruppen unter Verwendung von
pclGMHyal gezeigt werden konnte.[78, 79] Häufig jedoch war die Bildung aus pclGMHyal-
Mustern nicht reproduzierbar und beispielsweise auf PLA in keinem Fall eindeutig
nachweisbar.
Vielversprechend gestaltete sich der Aufbau biokompatibler Schichten aus dem Polyanion
Hyaluronsäure und einem kationischen Anteil, dem synthetischen Poly-L-Lysin. Ebenso
ermöglichte die Einbettung des natürlichen Adhäsionsproteins Fibronektin in Hyal-Filme eine
verbesserte Kontrolle in vitro. Mit Hilfe dieser Adhäsionsvermittler konnte die Anheftung von
Zellen zwischen Strukturen aus pclAAHyal und pclVAHyal erfolgreich gesteuert werden.
Um zelluläre Integrine direkt zur Bindung auf pclHyal-Substraten adressieren zu können,
wurden Peptide hergestellt, die neben der zellbindenden Aminosäuresequenz RGD
zusätzlich über eine photoreaktive Gruppe verfügen. Dabei wurde das Design der Peptide
(linear oder zyklisch) passend zur Verknüpfung zwischen Peptid und photoreaktiver Gruppe
gewählt. So wurde für die zyklischen Peptide die Aminosäure D-Lysin mit der speziellen
Aminosäureseitenkette-Schutzgruppe Dde gewählt, um diese später selektiv abspalten zu
können. Durch die Anknüpfung von Glycin-Einheiten an lineare Peptide bzw. von
Aminohexansäure-Einheiten an zyklische Peptide wurde gewährleistet, dass trotz Anbindung
123

Zusammenfassung und Ausblick
der Peptide auf einer Oberfläche die integrinbindenden Aminosäuresequenzen für Zellen
erreichbar waren. Neben der Peptidkonzentration wurde die lokale Anbindung der Peptide
photolitographisch variiert, sodass die Zelladhäsion auf pclHyal-pclPeptid-Substraten gezielt
gesteuert werden konnte.
Bei der Verwendung von Hyal-Derivaten zur Bildung von Hydrogelen als dreidimensionales
Zellkultur-Gerüst stand die Prozessierbarkeit verschiedener pclHyal-Beschichtungen und
pclHyal-Hydrogele in speziellen Mikrokammern im Vordergrund.
Nach der Einbettung von Endothelzellen (EOMA oder Hela) in pclHyal-Hydrogelen zeigten
lebend-tot-Fluoreszenzfärbungen zwar eine dreidimensionale Zellverteilung im Gel,
allerdings nur eine geringe Zellvitalität. Obwohl in der Literatur die Verwendung acrylierter
Hyal-Derivate zur Einbettung von Zellen beschrieben wird, konnten im Rahmen dieser Arbeit
mit pclGMHyal keine zufriedenstellenden Ergebnisse erzielt werden. Hydrogele aus
pclAAHyal und pclVAHyal lieferten dagegen zwar in REM-Aufnahmen ideal erscheinende
Einbettungsgerüste; allerdings konnten auch hier keine Protokolle zur reproduzierbaren
Einbettung vitaler Zellen erarbeitet werden.
Die Nutzung Hyal-beschichteter Substrate als Zellkulturbehältnis wurde durch Anwendung im
so genannten Mikrothermoform-Prozess (SMART) ermöglicht. Hierbei gelang die
Weiterentwicklung des SMART-Prozesses durch Nutzung pclHyal-beschichteter PLA-Folie
als thermoformbares Substrat. Durch die Verwendung entsprechend konstruierter Masken
und Formeinsätze für die Herstellung pclVAHyal-PLL beschichteter PLA-Substrate konnten
die verbindenden Stege zwischen den Kavitäten Zell-unattraktiv gestaltet werden, so dass
das Zellwachstum von humanen Hepatomzellen (HepG2 Zellen) auf die Mikrokavitäten
beschränkt blieb. Zudem gelang es, Strukturen aus pclVAHyal zu erzeugen, die auch
innerhalb der Kavitäten erhalten bleiben und dort lokal die Zelladhäsion regulieren.
5.2 Ausblick
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Derivate der Hyaluronsäure hergestellt, die zur
photochemischen Vernetzung oder zur Vernetzung mittels der Click-Reaktion geeignet sind.
Darüber hinaus gibt es weitere Möglichkeiten, Hyaluronsäure so zu funktionalisieren, dass
beispielsweise chemische Crosslinker die Molekülstränge miteinander vernetzen oder die
Änderungen des pH-Wertes die Bildung eines Hyal-Komposits aus Polyanion und einem
kationischen Partner ermöglicht. Um eine Synthesekontrolle und den Grad der Modifizierung
eindeutig bestimmen zu können, sind hochauflösende, NMR-spektroskopische Studien nötig,
da die Polymerstruktur des Moleküls die Signalauflösung erschwert.
Ist die Anwendung von Hyal-Derivaten zur Bildung ECM-ähnlicher Matrices durch
photolitographische Methoden geplant, so garantieren Masken während des
Belichtungsprozesses die reproduzierbare Erzeugung von Hyal-Strukturen im Bereich der
Mikrometerskala. Der Prozess der pclHyal-Strukturbildung auf einem Substrat ist jedoch
nicht vollständig verstanden. Bisher wird durch UV-Bestrahlung Hyal auf einem Substrat
photoimmobilisiert. Die Substratabschnitte, auf denen Hyal nicht der UV-Bestrahlung
124

Zusammenfassung und Ausblick
ausgesetzt wurde, weisen trotz Waschschritten adhärierte Hyal-Reste auf der Oberfläche
auf. Diese Bereiche verhalten sich für AAHyal immer zellabweisend bei in vitro
Anwendungen. Für VAHyal konnte nur bei gering konzentrierten Lösungen Zelladhäsion
zwischen dem ebenfalls schwach ausgeprägten pclVAHyal Muster beobachtet werden. Für
GMHyal sind weitere Untersuchungen zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit und der
genauen Oberflächenzusammensetzung nach Beschichtung mit dem Derivat durchzuführen.
Erst nach Zugabe des synthetischen PLL oder des natürlichen FN kann auf den Bereichen
zwischen pclAAHyal und pclVAHyal Zelladhäsion beobachtet werden. Die genaue
Zusammensetzung der Oberfläche in diesen Bereichen ist zu untersuchen.
Analog zu den in dieser Arbeit hergestellten Hydrogelen aus Click-Hyal mittels des
zelltoxischen Katalysators Cu(I)Cl wäre die Herstellung dieser Hydrogele mit Hilfe eines
nicht-toxischen Katalysators eine ideale Möglichkeit zur Erzeugung zelltragender Hyal-
Gerüste. Auch die Auswaschung des zelltoxischen Cu(I)Cl aus Click-Hyal könnte zu einem
biokompatibleren Hydrogel führen. Ebenso stellt die photochemische Anbindung von
Peptiden an native Hyaluronsäure und die Vernetzung dieser peptidhaltigen Hyal-Stränge
eine Möglichkeit dar, Hyal-Hydrogele zur Kultivierung von Zellen zu erzeugen. Die gezielte
Peptidanbindung mittels Click-Chemie an entsprechend funktionalisierte Hyal-Stränge
eröffnet ein weiteres Feld zur Anbindung von Zelladhäsionsvermittlern.
Die Steuerung der Proteinadhäsion auf Polymeren durch Hyal-Beschichtungen stellt im
Bereich der Biofilmbildung eine Möglichkeit zur Untersuchung der Adhäsionsprozesse auf
Oberflächen dar. Aufbauend auf die in dieser Arbeit untersuchte Verwendung von Hyal-
Derivaten zur Beschichtung biokompatibler Trägersubstrate ist vor allem die Beschichtung
von Polymeren interessant, die in den Bereichen der Mikro- und Nanostrukturtechnik
angewendet werden. Eine Möglichkeit stellt die Beschichtung von Nanopartikeln mit Hyal-
Derivaten dar, die zur Bildung nanostrukturierter Hydrogele genutzt werden können. Damit
könnte eine neuartige injezierbare Zellmatrix gebildet werden, die beispielsweise Proteinen
oder Wirkstoffe enthält, welche gezielt aus dem Gerüstverband freigesetzt werden
können.[160]
125

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136

Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
AA
AAHyal
AFM
Ahx
AN
APS
AS
ATA
ATAHyal
AZB
BSA
C
CalceinAM
ccd
4-Azidoanilin Hydrochlorid
4-Azidoanilin an Hyaluronsäure gebunden
Rasterkraftmikroskopie
6-Aminohexansäure
Acetonitril
3-(Aminopropyl)-trimethoxysilan
Aminosäure
11-Azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amin
11-Azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amin an Hyaluronan gekoppelt
N-((4-Azidobenzoyl)oxy)
bovine serum albumin
Cystein
Calcein-Acetoxymethylester
charged coupled device
cleavage cocktail
Lösungsmittelgemisch zur Abspaltung eines Peptids vom Trägerharz
d
Durchmesser
D, Asp Asparaginsäure
Da
DCC
DCM
Dde
DIC
Dalton
Dicyclohexylcarbodiimid
Dichlormethan
N-[1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl]
Diisopropylcarbodiimid
137

Abkürzungsverzeichnis
DIEA
DIV
DMF
ECM
EDC
EDTA
Et
EtOH
EOMA-Zellen
ESEM
f
FKS
Fmoc
FN
FWHM
Diisopropylethylamin
days in vitro (= Kultivierungstage)
N,N-Diemthylformamid
extra cellular matrix
1-Ethyl-3-[3(dimethylamin)-propyl]carbodiimid Hydrochlorid
Ethylendiamintetraessigsäure
Ethyl-
Ethanol
Hämangioendothelioma Zellen aus Maustumoren
Rasterelektronenmikroskopie
D-Phenylalanin
Fötales Kälberserum
Fluorenylmethoxycarbonyl
Fibronektin
Halbwertsbreite
G, Gly Glycin
GAG
GMA
GMHyal
DTPH
HAS
HATU
HBTU
Glykosaminoglykane
Methacrylsäureglycidylester
Methacrylat an Hyaluronsäure gebunden
3,3’-Dithiobis(propansäure Dihydrazid)
Hyaluronansynthase
(2-(7-Aza-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate)
O-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’,-tetramethyluronium-hexafluorophosphat
138

Abkürzungsverzeichnis
Hela-Zellen
HepG2-Zellen
HFIP
HLR
HOAT
HOBt
HPLC
Hyal
Hyal-S
Ic
IEP
K
LC-MS
MA
MAHyal
mAu
MeOH
MES
mp
MP
MW
NHS
NMP
P
menschliche Epithelzellen eines Zervixkarzinoms
humane Hepatomzellen
1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol
Hepes-Krebs-Ronger Lösung
1-Hydroxy-7-Azabenzotriazol
N-Hydroxybenzotriazol
(high pressure) liquid chromatography
Hyaluronsäure
sulfatisierte Hyaluronsäure
Irgacure
Isoelektrischer Punkt
Lysin
Flüssigkeitschromatographie an Massenspektrometer gekoppelt
Methacrylsäureanhydrid
Methacrylsäure an Hyaluronsäure gebunden
milli Absorption unit
Methanol
2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure
Schmelzpunkt
Maleimidpropionat
Molekulargewicht
N-Hydroxysuccinimid
N-Methylpyrrolidin
Prolin
139

Abkürzungsverzeichnis
PA
PAHyal
Pbf
PG
PBS
pcl
PDMS
PEG
PEGDA
PLL
PLA
PLGA
PMMA
PS
PVA
QCM
Propargylamin
Propargylamin an Hyaluronan gekoppelt
2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl
Proteoglykan
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
photocrosslinked
Polydimethoxysilan
Polyethylenglykol
diacyrliertes Polyethylenglykol
Poly-L-Lysin
Polylactid
Polymilch-Polyglykol-säure
Polymethylmethacrylat
Polystyrol
Polyvinylalkohol
Quarzmikrogravimetrie
R, Arg Arginin
REM
RP
rpm
S
SMART
sNHS
SPPS
Rasterelektronenmikroskop
reversed phase
revolutions per minute
Serin
Substrate Modification And Replication by Thermoforming
N-Hydroxysulfosuccinimid
solid phase peptide synthesis
140

Abkürzungsverzeichnis
tBu
TCP
TFA
TFFH
THF
TIS
VA
VAHyal
VIB
Vp
XPS
Y
zykloRGD
tert-Butyl-
2-Chlortritylchlorid Polystyrol
Trifluoressigsäure
Tetramethylfluoroformamidinium Hexafluorophosphate
Tetrahydrofuran
Triisopropylsilan
4-Vinylanilin
4-Vinylanilin an Hyaluronsäure gebunden
N-((4-Vinylbenzoyl)oxy)
N-Vinylpyrrolidon
Röntgen-Photoelektronenspektroskopie
Tyrosin
zyklisches Peptid mit den Untereinheiten Arg-Gly-Asp
Trägermaterial (Polymer) der Festphasensynthese
141

Anhang A – Apparatives, Chemikalien, Lösungsmittel, Zellkulturmedien
Apparatives, Chemikalien, Lösungsmittel und
Zellkulturmedien
Analytik
1 H-NMR Spektrometer: Bruker Avance 300 MHz, Varian VNMRS-600 MHz
UV/Vis-Spektrometer:
IR-Spektrometer:
pH-Meter:
Kontaktwinkelmessgerät:
Perkin Elmer Lambda 20; Jasco MD 2031 plus
Bruker IFS 66/s mit DTGS - Detektor
Calimatic 766 mit Knick SE 100 pH/Pt 1000 Electrode
dataphysics Contact Angle System OCA10
QCM-D: Q-Sense D300 System mit Durchflusszelle QWIC 310
XPS:
Zetapotenzial-Messgerät:
RP-HPLC:
LC-MS:
ESCA5 Multimethodenspektrometer (Vacuum Generators Ltd.),
ausgestattet mit einem 180° hemisphärischen Alpha-110
Elektronenenergieanalysator (ThermoFisher Scientific).
Anregung: MgKα-Röntgenstrahlung mit einer Leistung von
200 W, Anregungsfläche etwa 15 mm 2 . Emissionswinkel: 60°,
Passenergie: 20 eV, Energieauflösung: 1,0 eV FWHM der
Ag3d 5/2 Linie, Datenerfassung: Thermo Avantage Software.
Anton Paar SurPASS
Jasco-System mit Pumpe PU-2087 plus und Detektor MD-2010
plus, Software: Jasco Chrompass Chromatography
Agilent 1100 Capillary LC-System gekoppelt an Bruker
Daltonics ESI-µ TOF
Die chemische Verschiebung δ ist in ppm relativ zum Standard angegeben:
1 H δ(D 2 O) = 4.78.
Die Multiplizität eines Signals wird folgendermaßen beschrieben:
s = Singulett, d = Duplett, t = Triplett, m = Multiplett, br = breites Signal.
142

Anhang A – Apparatives, Chemikalien, Lösungsmittel, Zellkulturmedien
Chromatographie / Aufreinigung
Säulen:
Grace Vydac Protein & Peptide C18 (CAT.#218TP1022), (CAT.#218TP54)
Kieselgel: Merck 60 (0.04-0.063)
Dialyseschlauch: Sigma, cut off M w 12.000
Als Laufmittel für die LC-MS Messung werden standardmäßig ein Gemisch aus
Lösungsmittel A (94,9 % H 2 O, 5 % AN, 0,1 % TFA) und Lösungsmittel B (95 % AN, 4,9 %
H 2 O, 0,1 % TFA) verwendet. Als Laufmittel für die HPLC Analysen werden Gemische aus
10 % Acetonitril (HPLC grade) und 90 % H 2 O (Millipore) und 0,5 % 1 N HCl sowie 90 %
Acetonitril (HPLC grade) und 10 % H 2 O (Millipore) und 0,5 % 1 N HCl verwendet.
Mikroskopie
Durchlichtmikroskop:
3D-Laserscan Mikroskop:
Rasterelektronenmikroskop:
Rasterkraftmikroskop:
Fluoreszenz-Mikroskop:
Fluoreszenz-Mikroskop konfokal:
Stereo-Mikroskop:
Inverses Labormikroskop Olympus IMT-2
Violet Laser Color 3D, Keyence VK-9710
Jeol JSM-840 mit Wolfram-Kathode, 15 kV
XE-100 PSIA Inc., Cantilever: Park Systems Silizium
910M-NCHR, non-contact mode
Zeiss ApoTome Axio Vert 200M
Leica LSM TCS SP5
Zeiss Discovery.V8
Beschichtungen und Bestrahlungen
Spin-Coater: LOT-Oriel Gruppe Europa SCI 10
UV-Lampe:
Plasma-Anlage:
Leitz Fluovert FU Gehäuse, Leica mit Osram HBO 50W/AC
Hochdruck-Quecksilberdampflampe
Oxford Plasma Technologies
143

Anhang A – Apparatives, Chemikalien, Lösungsmittel, Zellkulturmedien
Peptidsynthese
Synthesizer:
Perkin Elmer Applied Biosystems 433 A, Synthassist Software
Mikrothermoformen
Thermoformanlage:
Heißprägemaschine WUM3 Jenoptik
Chemikalien, Lösungsmittel, Zellkulturmedien
ABCR:
Aldrich:
4-Azidobenzoesäure
3-(Aminopropyl)-trimethoxysilan
2,3,5-Collidin
Dimethylsulfoxid
N-Hydroxybenzotriazole
Kupfer(I)chlorid
Propargylamin
Tetrahydrofuran
Triisopropylsilan
Trifluoressigsäure
ATCC: DMEM Nährmedium Nr. 30-2002
MEM Nährmedium Nr. 30-2003
fötales Pferdeserum Nr. 30-2040
Biosolve:
Chemos:
Dichlormethan Peptide Synthesis Grade
Sodium Hyaluronate (MW = 50 bzw. 350 bzw. 1100 kDa)
Ciba: Irgacure 2959
Delo:
Dow Corning:
DELO-CA Cyanoacrylate Sekunden-Klebstoff
Sylgard 184 Elastomer Kit
144

Anhang A – Apparatives, Chemikalien, Lösungsmittel, Zellkulturmedien
Fluka:
4-Azidoanilin
11-Azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amin
N,N’-Dicyclohexylcarbodiimid
Glutardialdehyd
N-Hydroxysulfosuccinimid
Methacrylsäureanhydrid
Methacrylsäuregylcidylester
Propidiumiodid
Tetrabutylammoniumbromid
Fisher Scientific:
Acetonotril (HPLC grade)
Methanol (HPLC grade)
Gibco:
Glutamax
Nährmedium Nr. 51200-046
PBS-/-
Trypsin
Ibidi:
Invitrogen:
Ibidi 1µ-Slide Angiogenesis
CalceinAM
Alexa Fluor 488 Phalloidin
Syto16
Iris Biotech:
2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-tetrafluoroborat
2-Chlortritylchlorid Polystyrol (100-200 mesh)
Diisopropylethylamin
Fmoc-Asp(tBu)-OH
Fmoc-Gly-OH
Fmoc-D-Phe-OH
145

Anhang A – Apparatives, Chemikalien, Lösungsmittel, Zellkulturmedien
Tetramethylfluorformamidinium Hexafluorphosphat
Lifecore:
Marienfeld:
Merck:
Sodium Hyaluronate (MW = 1.2–2.6 x 10 3 kDa)
Deckgläser
Aceton
Ammoniaklösung 32 %
2-(7-Aza-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
hexafluorophosphate
N,N’-Dimethylformamid
Essigsäure
1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol
Hydrazin-Hydrat
Kaliumchlorid
May-Grünwalds Eosin-Methylenblaulösung
N-Methylpyrrolidin
Natriumazid
Natriumchlorid
Natriumcitrat Dihydrat
Natronlauge
Paraformaldehyd
2-Propanol
Triethylamin
4-Vinylbenzoesäure
1-Vinyl-2-pyrrolidon
Wasserstoffperoxid 30 %
Molecula:
Novabiochem:
1-Hydroxy-7-Azabenzotriazole
Fmoc-ε-Ahx-OH
146

Anhang A – Apparatives, Chemikalien, Lösungsmittel, Zellkulturmedien
Fmoc-Arg(Pbf)-OH
Fmoc-Pro-OH
Fmoc-Ser(Mtr)-OH
PAA:
BSA Fraktion V
fötales Kälberserum Nr. A15-151
Natriumpyruvat
non-essential amino acid solution (NEAA)
Penicillin/Streptomycin
Fmoc-Lys(Dde)-OH
Polymer SS:
Polystyrol (MW = 9,6 x 10 3 Da)
Postnova Analytics: Polystyrol Partikel Z-PS-POS-RFC-0,025
Roche:
Roth:
Collagen rat tail
Essigsäureethylester
Ethanol
Pentan
Piperidin
Serva:
Kristallviolett
Sidaplax EarthFirst® PLA-Folien 25 µm
Sigma:
Calciumchlorid
Ethylendiamintetraessigsäure
1-Ethyl-3-[3(dimethylamin)-propyl]carbodiimid Hydrochlorid
Fibronectin F-4759
Glucose
Hyaluronidase from bovine testes Type I-S 439 U/mg
N-Hydroxysuccinimid
147

Anhang A – Apparatives, Chemikalien, Lösungsmittel, Zellkulturmedien
Magnesiumchlorid Hexahxdrat
2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure
Phenolrot
Poly-L-Lysin 0,1 % w/v in Wasser
Trifluoressigsäure
VWR:
Diethylether
Diisopropylether
148

Anhang B - Protokolle
Protokolle zur Peptidherstellung und Zellkultivierung
Die Herstellung funktionalisierter Peptide mittels Festphasensynthese (SPPS)
Mittels Festphasensynthese an einem unlöslichen polymeren Trägerharz gelingt der
sequentielle Aufbau gewünschter Aminosäuresequenzen in heterogener Phase. Von Vorteil
gegenüber der Synthese in Lösung ist dabei die leichte Abtrennbarkeit des Produktes von
der Reaktionslösung durch einfache Filtration. Die Verwendung orthogonaler Schutzgruppen
ermöglicht die Synthese von Peptiden, deren Schutzgruppen selektiv abgespalten werden
können, sodass funktionelle Gruppen in Seitenketten zugänglich werden bzw. geschützt
bleiben. Lineare Peptide werden mittels Fmoc-Strategie hergestellt. Die Ringknüpfung
linearer Verbindungen zu zyklischen Peptide erfolgt in stark verdünnter Lösung.
Harz-Beladung
Die Fmoc-geschützte Aminosäure (1.2 eq relativ zum Harz) und DIEA (4 eq relativ zur AS)
werden in trockenem DCM (max. 10 mL pro 1 g Harz) gelöst, gegebenenfalls wird DMF oder
NMP zur besseren Lösung der AS zugegeben. Die Lösung wird zum Harz gegeben und für
mind. 2h geschüttelt. Nach der Beladung wird mit DCM:MeOH:DMF im Verhältnis 17:2:1
gewaschen, mit MeOH nachgewaschen und das Harz im Exsikkator unter Vakuum
getrocknet.
Die Beladung des Harzes mit Fmoc-geschützter Aminosäure wird durch Fmoc-Entschützung
überprüft. Dazu wird ca. 1 mg beladenes Harz in eine Quarzglasküvette genau eingewogen.
Nach Zugabe von 3 mL 22% Piperidin in DMF wird 20 min gewartet und anschließend die
Absorption der Testlösung bei 290 nm gegen reines Lösungsmittel (22% Piperidin in DMF)
bestimmt. Die Beladung des Harzes wird nach folgender Formel berechnet:
−1
[ mmol g ]
Fmoc Beladung =
Absorption
mg Harz
Fmoc-Entschützung
Das zuvor 15 min in DMF gequollene Harz wird mit 22 % Piperidin in DMF gespült. Bei 1 g
Harz wird nach folgendem Schema gewaschen:
3 mL 5 min 3 mL 15 min 3 mL 15 min
Anschließend wird mit mindestens viermal 2,5 mL NMP nachgewaschen und schließlich mit
einmal 2,5 mL DMF gespült.
149

Anhang B - Protokolle
Peptidsynthese
Der sequentielle Aufbau eines Peptids aus Aminosäuren erfolgt am Peptid-Synthesizer oder
manuell. Bei der manuellen Synthese werden zunächst die Kopplungsreagenzien in wenig
DMF gelöst und dann zur ebenfalls in entsprechendem Lösungsmittel (DMF oder NMP)
gelösten Aminosäure zugegeben. Nach Zugabe von DIEA wird die Reaktionslösung zum
Harz gegeben und es wird für mindestens 2 h gekoppelt. Dabei wird ständig Argon durch die
Harz-Reaktionslösung geblubbert. Verläuft die Kopplung über Nacht, so wird auf den
Argonstrom durch die Lösung verzichtet. Nach jedem Kopplungsschritt wird das Harz nach
folgendem Schema (für 0,5 g Harz) gewaschen:
zweimal 3 mL DMF dreimal 3 mL NMP zweimal 3 mL DMF
Harz-Abspaltung und Peptid-Aufarbeitung
TFA-cleavage cocktail:
HFIP-cleavage cocktail:
93,5 % TFA + 4 % TIS + 2,5 % H 2 O
30 % HFIP + 70 % DCM
Jeweils 1 mL des cleavage cocktails werden zu 100 mg Produkt gegeben. Für ein
qualitatives Abspalten wird 30 min geschüttelt, quantitatives Abspalten erfolgt über 4 h.
Anschließend wird die Reaktionslösung durch Watte filtriert, das Harz mit TFA bzw. DCM
nachgewaschen, das Lösungsmittel durch Einleiten von Argon eingeengt und schließlich der
Rückstand (= das Peptid) in kaltem Diethylether gefällt. Nach dem Abzentrifugieren wird der
Überstand verworfen und das Peptid in AN:H 2 0 = 1:1 erneut gelöst und anschließend
lyophilisiert. Wenige mg Peptid werden dann in wenigstens 350 µL MeOH (HPLC
Reinheitsgrad) gelöst und mittels HPLC-MS analysiert. Die Absorptionsintensität (mAu) der
synthetisierten Produkte wird bei λ = 220 nm detektiert.
Zellkulturen zur Anwendung auf Hyaluronsäuresubstraten
Sämtliche Arbeitsschritte mit Zellkulturen werden unter sterilen Bedingungen (Sterilbank,
Sterilisation der Arbeitsmaterialien und verwendeten Lösungen) durchgeführt.
Die Kultivierung von L929 Zellen (Firma ATCC) erfolgt in MEM Medium mit 10 % Pferde-
Serum und 1 % Penicillin-Streptomycin.
Die Kultivierung von HepG2-Zellen (Firma ATCC) erfolgt in Gibco Medium mit 10 % Kälber-
Serum, 1 % NEAA, 1 % Natriumpyruvat, 1 % Glutamax, 1 % Penicillin/Streptomycin und
0,1 % Phenolrot
Die Kultivierung von EOMA-Zellen (Firma: ATCC) erfolgt in DMEM Medium mit 10 % Kälber-
Serum (Hitze-inaktiviert) und 1 %Penicillin/Streptomycin.
150

Anhang B - Protokolle
Die Kultivierung von Hela-Zellen (Firma: DSMZ) bzw. Hela-TurboGreen-Actin Zellen (Firma
Marinpharm) erfolgt in DMEM Medium mit 10 % Kälber-Serum (Hitze-inaktiviert) sowie 1:100
GlutaMax und 1 %Penicillin/Streptomycin.
Hitze-Inaktivierung von FKS: 30 Minuten bei 56°C.
Herstellung verschiedener Lösungen zum Fixieren und Anfärben von Zellen
Fixierlösung 4 % Paraformaldehyd wird in PBS-/- gekocht bis die Lösung klar ist.
Nach dem Abkühlen werden 4 µL Glutardialdehyd pro 1 mL gekochter Lösung zugesetzt.
Hepes-Krebs-Ringer-Lösung (HKR) 5,00 mM Hepes, 137,00 mM NaCl, 2,68 mM KCl,
2,05 mM MgCl 2 ·6 H 2 O, 1,80 mM CaCl 2 ·2 H 2 O, 5,55 mM Glucose, Einstellen der Lösung auf
pH = 7,4.
Cytoskelfix Cell Fixative
kommerziell erhältlich
Propidiumiodid 1,5 mM in 0,1 % NaN 3
CalceinAM
Syto16
Alexa Fluor 488 phalloidin
Kristallviolett
1 mM in DMSO
1 mM in DMSO
1:40 verdünnen in 0,3 % BSA in PBS-/-
0,5 % Kristallviolett in 20 %igem MeOH
May-Grünwalds Eosin Methylenblau kommerziell
erhältlich in MeOH gelöst
Anfärben der Zellen
Kristallviolett kann direkt nach Entfernen des Nährmedium-Überstandes auf das zu
färbende Zell-Substrat gegeben werden. Nach einer Einwirkzeit von 30 min wird der
Farbstoff vorsichtig mit H 2 O dest abgewaschen und das Präparat kann nach dem Trocken im
Mikroskop betrachtet werden.
Bei der Färbung mit May-Grünwalds Eosin Methylenblau muss das Zell-Substrat nach
Entfernen des Nährmedium-Überstandes zunächst mit PBS-/- gewaschen werden. Dann
wird das Substrat für 20 min in Fixierlösung inkubiert, danach mit PBS-/- gewaschen und
schließlich 30 min gefärbt. Nach dem vorsichtigen Abwaschen der Substrate kann die
Zellfärbung im Mikroskop betrachtet werden.
151

Anhang B - Protokolle
Zur Kontrolle der Zellvitalität in einem Hydrogel oder auf einem Polymerfilm bietet sich die
Verwendung von Vitalfarbstoffen, wie CalceinAM oder Syto16 und Propidiumiodid an.
Erscheint der Zellkern grün, so lebt die Zelle, sieht man eine rot gefärbte Zelle im
Fluroreszenz-Mikroskop, so ist die Zelle tot. Bei der Vitalfärbung wird zunächst der
Nährmedium Überstand entfernt, dann wird das Zell-Gel mit HKR-Lösung gewaschen und
danach der Farbstoff zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von etwa 10 Minuten im
Brutschrank, haben die Zellen den Farbstoff aufgenommen und können im Fluroreszenz-
Mikroskop beobachtet werden.
Für die Untersuchung der Form des Zytoskeletts bietet sich die Färbung mit dem
Fluoreszenzfarbstoff Alexa Fluor 488 Phalloidin an. Dieser Farbstoff bindet an
Aktinfilamente der Zelle und lässt diese grün fluoreszieren. Zur Färbung wird zunächst der
Nährmedium Überstand entfernt, dann das Zell-Substrat mit PBS-/- gewaschen und
anschließend für 4 min bei –20°C mit Cytoskelfix inkubiert. Nach erneutem Waschen mit
PBS-/- für 10 min werden mit 0,3 BSA in PBS-/- (5 min) unspezifische Bindungsstellen
abgeblockt. Anschließend wird mit PBS-/- gewaschen, für 45 min mit Alexa Fluor 488
phalloidin gefärbt und nach einem letzten Waschschritt mit PBS-/- (15 min) können die
Proben im Fluroreszenz-Mikroskop betrachtet werden.
Farbstoff Anregungswellenlänge [nm] Emissionswellenlänge [nm]
CalceinAM 494 515
Syto16 588 518
Propidiumiodid 535 617
Alexa Fluor 488 Phalloidin 495 517
152

Anhang C - Veröffentlichungen
Veröffentlichungen
Zeitschriftenbeitrag
• Spatially controlled cell adhesion on three-dimensional substrates
Vorträge
C. Richter, M. Reinhardt, S. Giselbrecht, D. Leisen, R. Truckenmüller, A. Blau,
Ch. Ziegler, A. Welle
Journal of Biomedical Microdevices
• Biofunctionalisation of Hyaluronic Acid
C. Richter, A. Welle, A. Blau
(Beitrag ist eingereicht)
Advanced Macromolecular Systems Across the Length Scales II (AMSALS II),
Enschede, 2007
Poster
• Modification of Hyaluronic Acid to control cell adhesion
C. Richter, A. Welle, A. Blau
Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Advanced Lecture Course,
Patras, 2007
• Combining Peptides and Hyaluronan
C. Richter, A. Welle, A. Blau, Ch. Ziegler
Molekulare Interaktionen an Grenzflächen (MIG III), Karlsruhe, 2008
• Hyaluronan – Discovering a Molecule
C. Richter, A. Welle, A. Blau, Ch. Ziegler
KIT PhD Symposium, Karlsruhe, 2009
153

Anhang D - Lebenslauf
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
geboren am:
Familienstand:
Christine Friedericke Sabine Richter
24.03.1978 in Schwetzingen
ledig, keine Kinder
Schulbildung
09/1984-06/1988 Grundschule Ketsch
09/1988-06/1997 Hebel-Gmynasium Schwetzingen
Berufsausbildung
09/1997-06/1999 Berufsbildende Schule für Naturwissenschaften Ludwigshafen,
Abschluss als staatl. gepr. biologisch-technische Assistentin
Hochschulbildung
10/1999-10/2002 Grundstudium Chemie an der TU Kaiserslautern
Oktober 2002
Vordiplom Chemie
10/2002-05/2005 Hauptstudium Chemie an der TU Kaiserslautern
11/2003-02/2004 wissenschaftlicher Gastaufenthalt Cardiff University, Wales, England
03/2004-06/2004 wissenschaftlicher Gastaufenthalt Università degli Studi di Catania,
Catania, Italien
06/2005-03/2006 Diplomarbeit in Organischer Chemie an der TU Kaiserslautern
März 2006
Akademische Tätigkeiten
Abschluss des Studiums als Diplom-Chemikerin
06/2006-11/2009 Wissenschaftliche Mitarbeiterin in der Arbeitsgruppe Biomaterialien am
Institut für Biologische Grenzflächen, Forschungszentrum Karlsruhe
09/2008-07/2009 Wissenschaftliche Hilfskraft im Fachbereich Physik der TU
Kaiserslautern (Übungsgruppenleitung Experimentalphysik I und II)
12/2009-02/2010 Wissenschaftliche Hilfskraft im Fachbereich Physik der TU
Kaiserslautern (Funktionalisierung von Sensoroberflächen)
seit 03/2010
Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Institut für Organische Chemie des
KIT (Darstellung funktionalisierter Kohlenhydrate)
154

Danke
Danke
An dieser Stelle möchte ich allen danken, die mich während meiner Zeit als Doktorandin
unterstützt, begleitet, geformt und begeistert haben.
Mein persönlicher Dank gilt…
...Herrn Dr. Axel Blau (Istituto Italiano di Tecnologia, IIT), der mir die Möglichkeit gab, als
externe Doktorandin in seiner Gruppe tätig zu sein. Danke für Deine hervorragender
Betreuung aus der Ferne bei der Du mir stets neue Wege und Lösungsansätze für das
Projekt „externe Dissertation“ aufgezeigt hast. Danke für Deine Unterstützung bei allen
fachlichen und menschlichen Herausforderungen.
…Frau Professor Dr. Christiane Ziegler (Technische Universität Kaiserslautern, TU KL),
Chris, für die herzliche Einladung zu jedem Winterseminar und die finanzielle Unterstützung
in den letzten Monaten der Fertigstellung der Dissertation. Danke für Deine kritischen Fragen
zu jedem Seminarvortrag und Deine fachlichen Hilfestellungen bei der XPS-Analyse.
...Herrn Dr. Alexander Welle (IBG I, Karlsruher Institut für Technologie, KIT) für die
Bereitstellung des interessanten Themas und die stete Gewährung aller wissenschaftlichen
Freiheiten.
...den aktuellen und ehemaligen, internen und externen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe
Ziegler an der TU Kaiserslautern für die herzliche Aufnahme jedes Mal wenn ich zu Euch
nach KL kam oder wir uns beim Winterseminar getroffen haben. Danke an Christine Müller
für jeden gemeinsamen Morgenkaffee, an Felix Schmitt, Matthias Fingerle und Philipp
Kowalewski für ein tolles Tisch-Kicker-Team sowie an Benedikt Baumann für entspanntes
Gequatsche während dem Zusammenschreiben.
...den aktuellen und ehemaligen Mitarbeitern des Instituts für Biologische Grenzflächen I
(IBG I, KIT) für die Aufnahme in die Welt des interdisziplinären Arbeitens. Dr. Irene Wacker-
Schröder für jedes aufmunternde Wort und jede Mithilfe bei den Aufnahmen am Apotome,
Dr. Alexandra Rolletschek für jede gemeinsame Geburtstagsfeier, Dr. Eric Gottwald für die
großzügige finanzielle Unterstützung, Dr. Stefan Giselbrecht für die fachliche Unterstützung
beim Schreiben der wissenschaftlichen Veröffentlichung, Dr. Tim Scharnweber für die
Schokoriegel und jede Hilfe bei den Aufnahmen am LSM, Martina Reinhardt für die
155

Danke
Freundschaft auch außerhalb des KIT, Stefanie Schmitteckert und Conny Ziegler für die
gemeinsamen Mittagspausen, Carolin und Sebastian Bartels für die starke Unterstützung bei
den Zellkulturversuchen, Simone Weigel für die Mithilfe bei den QCM-Aufnahmen, Anke
Dech und David Thiele für die zuverlässige Bereitstellung der Zellkulturen, Maria Marin und
Marliese Tabery für jedes in den Arm nehmen an einem schlechten Tag sowie Herrn Josef
Schweinfurther als Sicherheitsbeauftragten und Bernhard Kneifel für den IT-Support.
...den aktuellen und ehemaligen Mitarbeitern des Instituts für Biologische Grenzflächen II
(IBG II, KIT) für die freundliche Aufnahme in Euer Labor. Besonders bedanken möchte ich
mich bei Prof. Dr. Anne Ulrich für die persönliche Unterstützung, bei Dr. Parvesh Whadwhani
für die ausgezeichnete fachliche Unterstützung, bei Christian Mink für das Zuhören und
immer Zeit für mich haben sowie bei Andrea Eisele und Kerstin Scheubeck für die Mithilfe
bei den Peptidsynthesen.
…den Mitarbeiten des Instituts für Mikrostrukturtechnik (IMT, KIT), Dr. Michael Bruns und
Vanessa Trouillet für die Aufnahme und Mithilfe bei der Analyse und Auswertung der XP-
Spektren, sowie die exzellente fachliche Betreuung.
...der Mitarbeiterin des Instituts für Angewandte Informatik (IAI, KIT), Thurid Gpsann für die
Mithilfe bei den AFM-Aufnahmen.
...dem Mitarbeiter des Instituts für Nukleare Entsorgung (INE, KIT), Dr. Johannes
Lützenkirchen für die Mithilfe bei der Aufnahme und Auswertung der Zetapotenzial-
Messungen sowie die ergebnisreiche gemeinsame Zusammenarbeit.
...der Mitarbeiterin des Instituts für Materialforschung I (IMF I, KIT), Beate Rabsch, für die
Mithilfe bei den REM-Aufnahmen.
...dem Mitarbeiter des Instituts für Funktionelle Grenzflächen (IFG, KIT), Stefan Heissler, für
die Mithilfe bei den IR-Aufnahmen.
...den Mitarbeitern des Instituts für Nanotechnologie (INT, KIT), Sven Stahl, für die Mithilfe
bei den NMR-Aufnahmen und Dr. Stefan Walheim für die Bereitstellung des Spincoaters.
...meinen Freundinnen Lisa, Petra, Dani und Kathrin, mit denen ich seit dem ersten
Semester in Kaiserslautern zusammen gelacht und geweint habe. Danke, dass wir uns
immer noch so viel erzählen können und uns immer mal wieder treffen.
...Mama, Claudi und vor allem Markus. Danke. Ohne Euch hätte ich es nicht gepackt.
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