von Herrn Reinhard Wilms - ICBM

Molekularbiologische Erfassung und 

Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaften 

im Rückseitenwatt der Insel Spiekeroog 

Von der Fakultät für Mathematik und Naturwissenschaften der Carl von 

Ossietzky Universität Oldenburg zur Erlangung des Grades und Titels eines 

Doktors der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat. - 

angenommene Dissertation 

von Herrn Reinhard Wilms 

geboren am 24. März 1972 in Wilhelmshaven 

Oldenburg 2006

Die vorliegende Doktorarbeit wurde in der Zeit von September 2001 bis 

September 2006 am Institut für Chemie und Biologie des Meeres in der 

Arbeitsgruppe Paläomikrobiologie angefertigt. 

Gutachter: 

Zweitgutachter: 

Prof. Dr. Heribert Cypionka 

Prof. Dr. Ralf Rabus 

Tag der Disputation: 15. November 2006

“...to boldly go where no one has gone before” (Gene Roddenberry)

Für Jonas

ERKLÄRUNG 

Erklärung 

Teilergebnisse dieser Arbeit sind bereits bei den genannten Fachzeitschriften veröffentlicht 

bzw. eingereicht. Mein Beitrag an der Erstellung der verschiedenen Manuskripte wird im 

Folgenden erläutert: 

Wilms, R., Köpke, B., Sass, H., Chang, T. S., Cypionka, H., and Engelen, B. (2006) Deep 

biosphere-related bacteria within the subsurface of tidal flat sediments. Environ. Microbiol. 8: 

709-719. 

Konzeptentwicklung und Durchführung der molekularbiologischen Arbeiten durch R. Wilms. 

Die Zellzahlen wurden von B. Köpke erhoben. Die sedimentologischen Arbeiten wurden von 

T.S. Chang und J. Köster durchgeführt. Erstellung der ersten Fassung des Manuskriptes durch 

R. Wilms, Überarbeitung durch B. Engelen, H. Sass und H. Cypionka. 

Wilms, R., Sass, H., Köpke, B., Köster, J., Cypionka, H., and Engelen, B. (2006) Specific 

bacterial, archaeal and eukaryotic communities in tidal-flat sediments along a vertical profile 

of several meters. Appl. Environ. Microbiol. 72: 2756-2764. 

Konzeptentwicklung und Durchführung der molekularbiologischen Arbeiten durch R. Wilms. 

Die sedimentologischen Arbeiten wurden von J. Köster und T. S. Chang durchgeführt. Das 

TOC- und DOC-Profil wurde von E. Freese erhoben. Das Ammoniumprofil wurde von 

W. Martens-Habbena aufgenommen. Die Sulfat- und Chlorid-Profile (2002 - 2004) wurden 

von B. Köpke und H. Sass aufgenommen. Das Sulfat- und Methanprofil (2005) wurde von 

R. Wilms erhoben. Erstellung der ersten Fassung des Manuskriptes durch R. Wilms, 

Überarbeitung durch B. Engelen, H. Sass, J. Köster und H. Cypionka. 

Wilms, R., Sass, H., Köpke, B., Cypionka, H., and Engelen, B. (2006) Methane and sulfate 

profiles within the subsurface of tidal flat are reflected by the distribution of sulfate-reducing 

bacteria and methanogenic archaea. FEMS Microbiol. Ecol. (in press). 

Konzeptentwicklung und Durchführung der praktischen Arbeiten durch R. Wilms mit 

Ausnahme der Sulfatmessungen von 2002 – 2004 und der Zellzahlbestimmungen, welche von 

B. Köpke und H. Sass durchgeführt wurden. Erstellung der ersten Fassung des Manuskriptes 

durch R. Wilms, Überarbeitung durch B. Engelen, H. Sass und H. Cypionka. 

I

WEITERE VERÖFFENTLICHUNGEN 

Weitere Veröffentlichungen 

Köpke, B., Wilms, R., Engelen, B., Cypionka, H., and Sass, H. (2005). Reflecting microbial 

diversity in coastal subsurface sediments - A cultivation approach using various electron 

acceptors and substrate gradients. Appl. Environ. Microbiol. 71: 7819-7830. 

Wilms, R., Köpke B., Engelen B., Sass H., and Cypionka H. (2003). Microbial community 

composition of the "shallow biosphere" in Wadden Sea sediments. Ber. Forschungszentrum 

Terramare 12: 126-127. 

Köpke, B., Wilms, R., Engelen, B., Cypionka, H., Rullkötter, J., and Sass, H. (2003). 

Cultivation of bacteria from a six meter long core from an intertidal sediment. Ber. 

Forschungszentrum Terramare 12: 75-76. 

Engelen, B., Köpke B., Wilms R., Sass H., and Cypionka H. (2003). Exploring the "shallow 

biosphere" of Wadden Sea sediments by analyzing the microbial community composition. 

Terra Nostra, Schriften der Alfred-Wegener-Stiftung 03/3, p. 96 

II

INHALTSVERZEICHNIS 

Inhaltsverzeichnis 

Zusammenfassung 1 

Summary 2 

Abkürzungen 3 

1. Einleitung 4 

1.1 Ablagerungsprozesse im Wattenmeer 5 

1.2 Vergleich der Wattsedimente mit Sedimenten des offenen Ozeans 7 

1.3 Remineralisierungsprozesse in Sedimenten des Wattenmeeres 8 

1.4 Gezielte Detektion von sulfatreduzierenden Prokaryoten und 

methanogenen Archaeen 9 

1.5 Anaerobe Oxidation von Methan 10 

1.6 Diversität von Mikroorganismen 12 

1.7 Zielsetzung der Arbeit 14 

1.8 Literatur 15 

2. Publikationen 21 

2.1 Deep biosphere-related bacteria within the subsurface of tidal flat sediments 22 

2.2 Specific bacterial, archaeal and eukaryotic communities in tidal-flat sediments 

along a vertical profile of several meters 34 

2.3 Methane and sulfate profiles within the subsurface of a tidal flat are reflected 

by the distribution of sulfate-reducing bacteria and methanogenic archaea 46 

3. Diskussion 69 

3.1 Detektion von „deep biosphere“ Bakterien im Wattenmeer 70 

3.2 Vertikale Abfolge von Sulfatreduzierern und Methanogenen 71 

3.3 Detektion eines neuen Clusters innerhalb der Euryarchaeota 72 

3.4 Ausblick 74 

3.5 Literatur 75 

III

ZUSAMMENFASSUNG 

Zusammenfassung 

In der vorliegenden Arbeit wurden Sedimente des Rückseitenwatts der Insel Spiekeroog bis 

zu einer Tiefe von 5,5 Metern molekularbiologisch untersucht. Dabei wurden die mikrobiellen 

Gemeinschaften der Bakterien, Archaeen und Eukaryoten mit Domänen-spezifischen PCR- 

Primern analysiert. Die erhaltenen Amplifikate konnten mittels der DGGE aufgetrennt und 

anschließend sequenziert werden. Die Sequenzen lieferten einen umfangreichen Einblick über 

die Zusammensetzungen der mikrobiellen Gemeinschaften innerhalb der Sedimentsäulen 

verschiedener Standorte des Wattenmeeres. So zeigte sich, dass die Oberflächen der 

Sedimente von Proteobakterien dominiert werden, wohingegen in tieferen und älteren 

Sedimentschichten vornehmlich Vertreter der Chloroflexi detektiert wurden. Mit 

zunehmender Sedimenttiefe kommt es somit zu einer Verschiebung der dominierenden 

Bakterien zu Organismen, die bisher hauptsächlich in Habitaten der „Tiefen Biosphäre“ (deep 

biosphere) gefunden wurden. Methanogene Archaeen konnten über die gesamte 

Sedimentsäule detektiert werden, wobei Vertreter der Klasse Methanosarcina in sämtlichen 

Sedimentschichten detektierbar waren und somit eine Coexistenz mit sulfatreduzierenden 

Bakterien aufzeigen. Dies wurde auch durch das aufgenommene Methanprofil bestätigt, da in 

sämtlichen Sedimentschichten Methan zu detektieren war. Sequenzen von Eukaryoten wurden 

ebenfalls über die gesamte Länge der untersuchten Kerne gefunden. Überraschenderweise 

wurde bei dieser Analyse ab 160 cm Tiefe ein neues Cluster innerhalb der Euryarchaeota 

entdeckt (TF1-Cluster), obwohl ein Eukaryoten-spezifischer PCR-Primer verwendet wurde. 

Zusätzlich zu den Sequenzierungen wurden die zu verschiedenen Jahreszeiten 

gewonnenen Sedimentkerne mittels real-time PCR untersucht. Dabei wurden die Bakterien 

und Archaeen anhand ihrer 16S rRNA Gene quantifiziert. Die sulfatreduzierenden und 

methanogenen Prokaryoten wurden über die Schlüsselenzyme der Sulfatreduktion und 

Methanogenese, die dissimilatorische Sulfit Reduktase (dsr) bzw. die Methyl-Coenzyme M 

Reduktase (mcr), quantifiziert. In den lokalisierten Sulfat-Methan-Übergangszonen, wo 

möglicherweise eine anaerobe Oxidation von Methan (AOM) stattfinden könnte, wurden 

dabei nicht nur erhöhte Zellzahlen für die Domänen der Bakterien und Archaeen detektiert, 

sondern auch erhöhte Kopieanzahlen für dsr und mcr. Bei den Sequenzierungen von 

entsprechenden DGGE-Banden wurden die für AOM postulierten Organismen (ANME) zwar 

nicht detektiert, aber die erhöhten Kopie- und Zellzahlen lassen dennoch auf diesen Prozess in 

den Sulfat-Methan-Übergangszonen schließen. Eine genaue Bestimmung der beteiligten 

Organismen war jedoch nicht möglich. 

1

SUMMARY 

Summary 

In the present work sediments of the backbarrier tidal flat of the island of Spiekeroog were 

investigated by molecular techniques down to a depth of 5.5 meters. The microbial 

communities of the bacteria, archaea and eukarya were analyzed using domain-specific PCRprimers. 

The obtained amplicons were separated by DGGE and sequenced afterwards. The 

sequences gave an extensive insight into the composition of microbial communities within the 

sediment columns of different sites of the tidal flat. It was shown, that the sediment surfaces 

were dominated by Proteobacteria, whereas in deeper and older layers Chloroflexi were 

detected primarily. Thus a shift was observed from the dominating bacteria to organisms that 

up to now have mainly been found within deep subsurface or deep biosphere habitats. 

Methanogenic archaea were found within the whole sediment column, while members of the 

Methanosarcina were detectable in all layers indicating a coexistence with sulfate-reducing 

bacteria. This has been confirmed by the methane profile as methane was also detected in all 

layers. Sequences of eukarya were also found over the complete length of the investigated 

cores. Unexpectedly, a new cluster within the Euryarchaeota (TF1-cluster) was discovered 

during this analysis from a depth of 160 cm downwards, although eukarya-specific PCRprimers 

have been used. 

The sediment cores which were recovered at different seasons were examined additionally 

to the sequence analysis by real-time PCR. Bacterial and archaeal cell numbers were 

calculated by quantifying their 16S rRNA-genes. The sulfate-reducing and methanogenic 

prokaryotes were quantified by means of key-enzymes for sulfate reduction (dissimilatory 

sulfite reductase; dsr) and methanogenesis (methyl coenzyme M reductase; mcr), 

respectively. Increasing cell numbers of bacteria and archaea, and also elevated copy numbers 

of dsr and mcr genes were detected at the sulfate-methane transition zones, where an anaerobe 

oxidation of methane (AOM) might take place. During sequencing of the corresponding 

DGGE-bands, the organisms postulated for AOM (ANME) were not detected. Nevertheless, 

the occurance of this process within the sulfate-methane transition zones can be concluded 

from the increased numbers of cells and gene copies. However, an exact determination of the 

corresponding organisms was not possible. 

2

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 

Abkürzungsverzeichnis 

AAG 

Altertümliche Archaeen Gruppe (ancient archaeal group) 

ANME 

Anaerober Methan-Oxidierer 

AOM 

Anaerobe Oxidation von Methan 

ARC 

Archaeen (archaea) 

bp 

Basenpaare 

bzw. 

beziehungsweise 

C 

Kohlenstoff 

ca. 

circa 

CH 4 

Methan 

DFG 

Deutsche Forschungsgemeinschaft 

DGGE 

Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese 

DHVE 

Hydrothermal Vent Euryarchaeota (deep-sea hydrothermal vent 

Euryarchaeota) 

DNA 

Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid) 

dsr 

Gen der Dissimilatorischen Sulfit-Reduktase 

et al. 

und andere 

FISH 

Fluoreszenz in-situ Hybridisierung 

GNSB 

Grüne nicht Schwefelbakterien 

mcr 

Methyl-Coenzyme M Reduktase 

NCBI 

National Center for Biotechnology Information 

PCR 

Polymerase Ketten Reaktion (polymerase chain reaction) 

RNA 

Ribonukleinsäure (ribonuclein acid) 

rRNA 

Ribosomale Ribonukleinsäure (ribosomale ribonuclein acid) 

S 

Svedberg 

SRP 

Sulfat-reduzierende Prokaryoten 

TF1-Cluster Tidal flat cluster 1 

z. B. zum Beispiel 

3

EINLEITUNG 

1. Einleitung 

4

EINLEITUNG 

1. Einleitung 

1.1 Ablagerungsprozesse im Wattenmeer 

Das Wattenmeer der südlichen Nordsee ist mit einer Fläche von circa 8.000 km 2 das größte 

zusammenhängende Wattenmeer der Erde und reicht von Den Helder (Niederlande) bis 

Esbjerg (Dänemark). Es entstand durch den Meerwasseranstieg nach der Weichsel-Eiszeit mit 

der Bildung der ersten Inseln vor circa 7.500 Jahren (Flemming, 1992). Dabei wurden Salz- 

Marschgebiete, die nach der Eiszeit entstanden sind, überflutet und bildeten so die basalen 

Schichten der Wattsedimente. Durch die Gezeiten kommt es zu einer regelmäßigen 

Entwässerung und Überschwemmung der Wattgebiete über die Seegats. Die 

unterschiedlichen Strömungsgeschwindigkeiten des auf- und ablaufenden Meerwassers 

innerhalb der Rückseitenwatten haben zur Folge, dass unterschiedliche Sedimentationsraten 

auf den verschiedenen Platen vorherrschen. Somit spiegeln die Sedimente in ihren 

horizontalen Verteilungsmustern und in ihren Eigenschaften vor allem die hydrodynamischen 

Bedingungen zum Zeitpunkt ihrer Ablagerung wieder (Dijkema et al., 1980). Aufgrund 

dessen finden sich im allgemeinen gröbere Sedimente als Ablagerungen in einem 

energiereicheren Milieu, während feinere Sedimente unter energetisch geringeren 

Bedingungen abgelagert werden (Abb. 1). 

Abb. 1: Die Sedimentverteilung im Watt zeigt eine küstenparallele Zonierung auf, wobei die 

Korngrößen zum Festland hin immer feiner werden und somit den landwärts abnehmenden 

Energiegradienten widerspiegeln (Flemming et al., 2002). 

5

EINLEITUNG 

In den Wattgebieten sind die Ablagerungsprozesse durch einen in Richtung auf das Festland 

abnehmenden Energieeintrag charakterisiert (Flemming & Nyandwi, 1994; Mai & 

Bartholomä, 2000). Dies führt tendenziell zu einer küstenparallelen Anordnung zunehmender 

schluff- und tonreicherer Sedimente, während sandige Sedimente in der Mitte des 

Rückseitenwatts und an den Rändern der Priele zu finden sind. Zusätzlich zu dem 

horizontalen Verteilungsmuster der Wattsedimente kommt es auch zu größeren Unterschieden 

in den vertikalen Schichtungen (Chang et al., 2003). Diese Variabilitäten der 

Sedimentverteilung sind Ausdruck der sich ständig ändernden Dynamik von Strömung und 

Seegang innerhalb der Rückseitenwatten, welche immer wieder zu Erosion und Sedimentation 

und damit zu kurzfristigen Sedimentablagerungen auf den Wattflächen führt. Diese vertikale 

Oszillation der Sedimente der Platen kann bis zu einem halben Meter pro Jahr betragen 

(Tilch, 2003). So wachsen einige Platen im Sommer auf, wohingegen sie im Winter durch 

eine im Durchschnitt erhöhte Strömungsgeschwindigkeit wieder erodiert werden (Flemming 

& Ziegler, 1995; Krögel, 1997). Zusätzlich erfolgen bei Starkwindereignissen immer wieder 

größere Umlagerungsprozesse innerhalb der Wattgebiete (Tilch, 2003). Pendelbewegungen 

der Priele führen zu starken lokalen Erosionen auf den Platen (Reineck, 1958) und ältere 

Sedimente können dabei auf jüngeren Sedimenten in anderen Bereichen des Watts zum 

Liegen kommen. Ein weiterer Einfluss auf die Sedimentationsbildung ist die 

Benthosbesiedlung. Die Röhrenbauten und Besiedlungen von Organismen beeinflussen die 

bodennahen Strömungseigenschaften auf den Platen und damit die 

Sedimentationsbedingungen (Eckman et al., 1981; Carey, 1983). Der Nettoanstieg im Jahr 

beläuft sich häufig auf nur wenige Zentimeter, wobei andere Bereiche im Watt sogar gänzlich 

erodieren. Im Zuge des globalen Meerwasseranstiegs beträgt der durchschnittliche Anstieg 

etwa ein bis zwei Millimeter pro Jahr (Oost & De Boer, 1994). 

Diese hohe Dynamik und Variabilität bei der Sedimentation und die Einlagerungen 

terrigener Pflanzenreste (z. B. Torf; [Wöstmann et al., 2003]) machen eine Altersbestimmung 

der Sedimente sehr schwierig. Durch eingelagerte Muscheln in den Sedimenten lässt sich 

zwar der Zeitpunkt der letzten Ablagerung bestimmen (Ziehe, 2005), aber Schichten, die 

wenige oder keine Muscheln enthalten, können nicht oder nur ungenügend datiert werden. 

Erste Altersbestimmungen eingelagerter Muscheln zeigten, dass Sedimentschichten in zwei 

Metern Tiefe seit über 800 Jahren vergraben sind (Ziehe, 2005), wobei bei dieser Art der 

Altersbestimmung nur ein genereller Trend über einen gesamten Sedimentkern möglich ist. 

Das kohlenstoffhaltige Material in solchen Tiefen muss nach dieser Zeitspanne dennoch sehr 

6

EINLEITUNG 

refraktär sein und stellt für die mikrobiellen Gemeinschaften einen schwer zugänglichen 

Elektronendonator dar. 

1.2 Vergleich der Wattsedimente mit Sedimenten des offenen Ozeans 

Während die Sedimentation in den Wattenmeeren nicht kontinuierlich erfolgt und immer 

wieder starken Veränderungen unterliegt, ist der Meeresboden der offenen Ozeane einer 

kontinuierlichen Sedimentation unterworfen. Das Fehlen von erosiven Prozessen im offenen 

Ozean führt zu einem stetigen Aufwuchs der Sedimente von 0,1 – 1,0 Zentimeter pro 

1.000 Jahre (Backman et al., 2006). Altersbestimmungen dieser Sedimente sind demnach sehr 

viel einfacher durchzuführen als für Wattenmeersedimente. Zusätzlich findet man im offenen 

Ozean feingeschichtete Sedimente, deren geologische Ablagerungsprozesse genau datiert 

werden können. Rückschlüsse auf das Klima und die Sedimentationsbedingungen zum 

Zeitpunkt der Ablagerung sind demnach möglich. Zusätzlich sind Umweltbedingungen wie 

Temperatur, Druck, Salinität ect. der Sedimente des offenen Ozeans nur geringen 

Schwankungen unterworfen. 

Die Temperatur der Ozeansedimente nimmt z. B. nur im Laufe von Jahrtausenden 

kontinuierlich zu und bleibt an der Wassergrenze mit 1-3 °C konstant (Stephens et al., 2002). 

Dies erfolgt durch konstante Wassertemperaturen der Tiefsee und der zunehmenden 

Temperatur von Sedimenten mit der Tiefe (Erdwärme). Im Gegensatz zu den Sedimenten des 

offenen Ozeans können die Oberflächensedimente des Wattenmeeres im Sommer an einem 

Tag bis zu 20 °C Temperaturunterschied aufzeigen (Harrison & Rhizacklea, 1987). 

Jahreszeitliche Schwankungen von 8 °C treten sogar noch in fünf Metern Tiefe auf (4 °C im 

Winter und 12 °C im Sommer). 

Der Nährstoffeintrag im offenen Ozean ist im Vergleich zu den küstennahen Wattgebieten 

sehr viel geringer, da jeglicher Sedimentationseintrag (Marine Snow) größere Strecken zurück 

legt und dabei schon diversen mikrobiellen Remineralisierungsprozessen unterworfen ist 

(Simon et al., 2002). Die Wattsedimente der Nordsee werden dagegen von hohen 

Nährstoffeinträgen aus den umliegenden Landmassen über Siele und Flüsse versorgt. Der 

geringe Nährstoffeintrag für die Sedimente des offenen Ozeans führt zu chemischen 

Gradienten, die sich über bis zu hunderten von Metern ausbilden können (D'Hondt et al., 

2004; Parkes et al., 2005). Die Sedimente des Wattenmeeres zeigen ähnliche chemische 

Profile, allerdings über eine geringere Tiefenskala und sind somit sehr viel steiler (Böttcher 

7

EINLEITUNG 

et al., 2000; Llobet-Brossa et al., 2002). Das wird auch durch Aktivitätsmessungen deutlich, 

die im Watt viel höher sind als im offenen Ozean (Thomsen et al., 2001; D'Hondt et al., 2004; 

Köpke et al., 2005; Parkes et al., 2005). Dennoch sind die Bedingungen in mehreren Metern 

Tiefe des Watts auch über mehrere Jahrhunderte konstant, so dass die mikrobiellen 

Gemeinschaften Strategien entwickeln müssen, um längere Zeiten mit geringsten 

metabolischen Aktivitäten überleben zu können. So zeigen sich in beiden Habitaten hohe 

Zellzahlen von über 10 7 Zellen pro gram Sediment (Köpke et al., 2005; Parkes et al., 2005), 

was vermuten lässt, dass in der „deep biosphere“ der Ozeane und in der „subsurface“ des 

Watts metabolisch aktive Mikroorganismen vorhanden sind. Man geht sogar davon aus, dass 

ein Großteil der Mikroorganismen der Welt im tiefen Untergrund zu finden sind (Whitman 

et al., 1998). Trotz ihrer eher geringen Aktivität haben sie aber durch ihre enorme Anzahl 

einen entscheidenden Einfluss auf den Gesamthaushalt an den Remineralisierungsprozessen 

der Welt. 

1.3 Remineralisierungsprozesse in Sedimenten des Wattenmeeres 

Die Wattenmeergebiete gehören zu den produktivsten Flächen der Erde. Dabei wird 

Sauerstoff als Elektronenakzeptor für die Remineralisierung organischen Materials schon in 

den ersten Millimetern durch aerobe Atmungsprozesse verbraucht (Böttcher et al., 2000). 

Eisen und Nitrat werden ebenfalls in den obersten Zentimetern des Sedimentes reduziert, 

wodurch Sulfat zum wichtigsten Elektronenakzeptor für die anaeroben Atmungsprozesse bis 

in mehreren Metern Tiefe wird. Unterhalb der sulfathaltigen Sedimente kommt es zur Bildung 

von nicht unbedeutenden Mengen an Methan durch die Methanogenese. Da das Sediment in 

mehreren Metern Tiefe schon vor einigen hundert Jahren abgelagert worden ist (Flemming & 

Nyandwi, 1994), stehen unter anderem Elektronendonatoren wie Einfachzucker, Acetat, 

Wasserstoff und Kohlendioxid für sulfatreduzierende Prokaryoten und methanogene 

Archaeen nicht in ausreichender Menge zur Verfügung (Volkman et al., 2000). Die 

verfügbaren Elektronendonatoren, die in diesen Tiefen vorkommen, sind meist sehr refraktär 

und schwer abbaubar (Freese & Rullkötter, 2003). Sie dienen fermentativen Bakterien, die mit 

ihren Gärprodukten Sulfatreduzierern und auch methanogenen Archaeen die 

Elektronendonatoren zur Sulfatreduktion und Methanogenese zur Verfügung stellen, als 

Substratgrundlage (Madigan et al., 2003). Diese mikrobiellen Aktivitäten laufen unter den 

beschriebenen Bedingungen aber dennoch so schnell ab, dass sich konstante chemische 

8

EINLEITUNG 

Profile über mehrere Jahrzehnte und über mehreren Metern Tiefe aufbauen können (Böttcher 

et al., 2000). 

Da die sulfatreduzierenden Prokaryoten und die methanogenen Archaeen zum Großteil 

dieselben Elektronendonatoren nutzen (Schimel, 2004), haben Sulfatreduzierer einen 

energetischen Vorteil gegenüber den Methanogenen und können diese auskonkurrieren. 

Dadurch kommt es zu einer Schichtung der Sulfatreduzierer oberhalb der methanogenen 

Archaeen. Diverse Arbeiten konnten aber zeigen, dass beide Prozesse auch simultan auftreten 

können (Oremland & Taylor, 1977; Oremland & Polcin, 1982). Diese Koexistenz beider 

physiologischer Gruppen ist aber eher untergeordnet zu sehen, wenn es um eine Bilanzierung 

der Stoffwechselaktivitäten geht. So sind z. B. größere Mengen an Methan nur dort zu 

detektieren, wo Sulfat verbraucht worden ist und somit zum limitierenden Faktor für die 

Sulfatreduzierer wird. Erste nähere Untersuchungen dieser physiologischen Gruppen ergaben, 

dass Sulfatreduzierer in den ersten 20 cm des Wattenmeersedimentes nur einen Anteil von 

20 Prozent an der Gesamtanzahl der Bakterien haben (Llobet-Brossa et al., 2002). Somit ist 

der weitaus größere Teil der Bakteriengemeinschaft von fermentativ lebenden Bakterien 

geprägt, deren Vielfalt noch nicht weiter untersucht wurde (Schink, 2002). Thomsen et al. 

konnten in einem nahegelegenen marinen Küstenhabitat der Aarhus Bay mit 

molekularbiologischen Methoden zeigen, dass Sulfatreduzierer und auch methanogene 

Archaeen noch in mehreren Metern Tiefe vorkommen (Thomsen et al., 2001). Dabei sind 

Methanogene molekularbiologisch sehr viel einfacher nachzuweisen als sulfatreduzierende 

Bakterien, da die physiologische Diversität der Archaeen gegenüber der der Bakterien 

deutlich geringer ist (Madigan et al., 2003). Dennoch sind sämtliche Untersuchungen der 

„subsurface“ des Wattenmeeres noch auf molekularbiologische Untersuchungen angewiesen, 

da zwar erste Kultivierungsansätze erfolgreich waren (Köpke et al., 2005), sich aber z. B. 

bisher keine Archaeen kultivieren ließen. 

1.4 Gezielte Detektion von sulfatreduzierenden Prokaryoten und 

methanogenen Archaeen 

Für eine molekularbiologische Quantifizierung sulfatreduzierender Prokaryoten und 

methanogener Archaeen versucht man, Gene von Schlüsselenzymen der jeweiligen 

physiologischen Prozesse zu detektieren. Für die Sulfatreduktion ist das die dissimilatorische 

Sulfit Reduktase (dsr) und für die Methanogenese die Methyl Coenzym M Reduktase (mcr). 

9

EINLEITUNG 

Beide Enzyme katalysieren jeweils die letzten Schritte in der Sulfatreduktion 

beziehungsweise in der Methanogenese (Hallam et al., 2003; Zverlov et al., 2005). Für die 

Untersuchung wird dabei nicht das gesamte Operon beider Prozesse betrachtet, sondern 

lediglich die Untereinheit A des jeweiligen Operons. Diese wird verwendet, weil sie bei allen 

bislang untersuchten Vertretern beider physiologischer Gruppen vorhanden ist, wohingegen 

andere Untereinheiten bei einigen Organismen fehlen und deshalb nicht unbedingt essentiell 

zu sein scheinen (Zverlov et al., 2005). Zudem ist mittels der Denaturierenden Gradienten Gel 

Elektrophorese (DGGE) auch eine Aussage über die Diversität der physiologischen Gruppen 

möglich. Zusätzlich erlaubt die Sequenzierung der Amplifikate und der Vergleich mit 

abgelegten Sequenzen in Datenbanken wie der des National Center for Biotechnology 

Information (NCBI; http://ncbi.nih.gov) eine Identifizierung der Mikroorganismen. 

Rückschlüsse über die Diversität der vorhanden Mikroorganismen sind dadurch zulässig. Mit 

Hilfe der quantitativen real-time PCR ist es zusätzlich möglich, die genaue Menge an 

Sulfatreduzierern und Methanogenen zu bestimmen. Mit dieser Methode lassen sich 

theoretisch geringste Kopieanzahlen im Versuchsansatz quantifizieren. Dies ist wichtig, da 

die Anzahl an sulfatreduzierenden Prokaryoten und methanogenen Archaeen in marinen 

Sedimenten mit durchschnittlich zehn und ein Prozent der Gesamtzellzahl (Ishii et al., 2004; 

Mußmann et al., 2005) nur geringe Abundanzen aufweisen und somit sehr sensitiv 

nachgewiesen werden müssen. Mittels dieser Quantifizierung kann eine Veränderung der 

Zellzahlen über die Tiefe ermittelt werden, was im Einklang mit den chemischen Profilen zu 

wichtigen Aussagen führen kann. Auch können Übergangszonen zwischen Sulfat und Methan 

näher untersucht werden, um hier eventuell genauere Aussagen über eine anaerobe Oxidation 

von Methan (AOM) zu treffen. 

1.5 Anaerobe Oxidation von Methan 

Methan gehört zu der Gruppe der Kohlenwasserstoffe und gilt bei der globalen 

Klimabetrachtung als Treibhausgas. Da das Wattenmeer als ein potentieller Produzent von 

Methan anzusehen ist (Grunwald, persönliche Kommunikation), sind die biologischen 

Stoffkreisläufe zur Methanbildung und auch dessen Abbau in den wissenschaftlichen Fokus 

geraten. In den Sedimenten des Wattenmeeres, wie auch in anderen anaeroben marinen 

Habitaten, wird Methan unterhalb der sulfathaltigen Schichten in größeren Mengen durch den 

anaeroben mikrobiellen Abbau organischer Substanzen von methanogenen Archaeen gebildet 

10

EINLEITUNG 

(Valentine, 2002). Aerob kann es dabei durch methanothrophe Bakterien abgebaut werden 

(Hanson & Hanson, 1996). Erste Untersuchungen zeigten auf, dass ein Abbau des Methans 

auch anaerob gekoppelt mit einer Sulfatreduktion erfolgen müsste (Iversen & Jorgensen, 

1985; Höhler et al., 1994). Dies wurde anhand gegenläufiger Profile des Sulfats und des 

Methans postuliert. Man nimmt heute an, dass bis zu 90 Prozent des gebildeten Methans in 

marinen Habitaten anaerob wieder abgebaut wird (Barnes & Goldberg, 1976; Hinrichs & 

Boetius, 2002). Boetius et al. konnten im Jahr 2000 mittels Fluoreszenz in-situ 

Hybridisierung (FISH) Konsortien von Sulfatreduzierern und Methanogenen (ANME) 

detektieren, die bis heute für den anaeroben Abbau des Methans verantwortlich gemacht 

werden (Boetius et al., 2000). Solche Konsortien sind in der Folgezeit in vielen marinen 

Habitaten detektiert worden (Orphan et al., 2001; Ishii et al., 2004). Dennoch konnte bis jetzt 

kein eindeutiger Beweis erbracht werden, dass es zu einem Austausch von 

Elektronendonatoren zwischen den einzelnen Vertretern der Konsortien gekommen ist. Der 

einzige Beweis zur Feststellung einer Beteiligung von methanogenen Archaeen an der 

anaeroben Oxidation von Methan wurde indirekt geführt. So geht die biologische Oxidation 

von Methan mit einer Isotopenfraktionierung einher. Dabei wird das leichtere Isotop 12 CH 4 

gegenüber dem schwereren 13 CH 4 bevorzugt oxidiert. Die von den methanoxidierenden 

Prokaryoten gebildete Biomasse weist demzufolge niedrigere 13 C- zu 12 C-Verhältnisse auf als 

das im umgebenden Medium gelöste Methan (Burns, 1998). Solche erniedrigten delta 13 C- 

Werte ließen sich nun auch in für Archaeen charakteristischen Lipid-Biomarkern 

(Archaeolen) an den entsprechenden Standorten nachweisen (Elvert et al., 2000; Pancost et 

al., 2000). Die gleichzeitig auftretende starke Dominanz spezieller Archaeen (ANME 1-3) in 

den aktiven Sediment-Horizonten machte diese zu wahrscheinlichen Kandidaten für den 

methanoxidierenden Part in einer syntrophen Gemeinschaft (Hinrichs et al., 1999; Michaelis 

et al., 2002; Teske et al., 2002). Ähnliche niedrige delta 13 C-Werte in charakteristischen Lipid- 

Biomarkern der assoziierten sulfatreduzierenden Bakterien sprechen für das Vorhandensein 

eines in der reversen Methanogenese entstehenden Intermediates. Dies dient wahrscheinlich 

in der Folge den syntrophen Sulfatreduzierern als Elektronendonator. Aktuelle Modelle 

favorisieren in diesem Zusammenhang eine Reaktion, bei der die Übertragung des Methan- 

Kohlenstoffes auf Acetat bei gleichzeitiger Bildung von molekularem Wasserstoff erfolgt 

(Boetius et al., 2000; DeLong, 2000). Durch Laborversuche mit Konsortien in Sedimenten 

von Hydrate Ridge konnte 2001 gezeigt werden, dass diese unter anoxischen Bedingungen bei 

Oxidation definierter Mengen von Methan äquimolare Mengen an Sulfid produzieren 

(Nauhaus et al., 2002). Trotz all dieser Erkenntnisse ist der Sachverhalt, dass die anaerobe 

11

EINLEITUNG 

Oxidation von Methan auf die Konsortien beschränkt ist, umstritten. Erste Untersuchungen 

zeigen auf, dass die beteiligten Archaeen nicht nur auf Vertreter der ANME 1 bis 3 

beschränkt sind (Parkes et al., 2005). Zudem könnte man sich vorstellen, dass nicht nur in den 

Konsortien Methan anaerob oxidiert wird, sondern methanogene Vertreter durchaus in der 

Lage sind, die anaerobe Oxidation von Methan mit Sulfat auch ohne sulfatreduzierenden 

Partner durchzuführen. So liegen im sulfatreduzierenden Archaeon Archaeoglobus fulgidus 

fast alle Gene zur Methanogenese vor (Klenk et al., 1997). Weiter wird diese Hypothese 

dadurch unterstützt, dass ein Intermediat welches für ein Konsortium wichtig wäre, immer 

noch nicht eindeutig bestimmt werden konnte (Valentine & Reeburgh, 2000; Sørensen et al., 

2001; Nauhaus et al., 2002). 

1.6 Diversität von Mikroorganismen 

Mit der Einführung des Stammbaumes des Lebens 1987 von Carl Woese (Woese, 1987), der 

nicht physiologische oder morphologische Merkmale als Grundlage hatte, sondern die 

ribosomale RNA speziell das 16S rRNA Gen, wurde eine neue Sichtweise der Arten 

eingeführt (Abb. 2). 

Abb. 2: Der grundlegende phylogenetische Baum des Lebens abgeleitet aus einer 

vergleichenden Analyse von 16S rRNA Gen Sequenzen. Der Baum verdeutlicht die 

Unterschiede zwischen Bakterien, Archaeen und Eukaryoten (Woese, 2000). 

12

EINLEITUNG 

Dieser neuen Sichtweise ist es auch zu verdanken, dass die Prokaryoten sich in die zwei 

Domänen der Bakterien und Archaeen unterteilen ließen. Zudem grenzten sich die 

Prokaryoten von den einzelligen Eukaryoten wie Pilze und Algen ab. Dieser neue Baum 

beruhte für die Domäne der Bakterien zunächst auf 12 Klassen, die als Grundlage jeweils 

mindestens einen kultivierten Vertreter besaßen. Dieser Stammbaum wurde bis ins Jahr 2005 

durch die molekularbiologischen Methoden auf 55 Klassen erweitert, wobei ein großer Teil 

der Klassen keinen kultivierten Vertreter mehr besaß (Backhed et al., 2005). Zudem belief 

sich im Jahre 2004 der Umfang an Sequenzen in der NCBI Datenbank auf über 32 Millionen, 

wobei davon lediglich 205.000 von benannten Organismen stammten (Benson et al., 2006). 

Die Spanne zwischen bekannten eindeutig benannten Sequenzen zu den nur 

molekularbiologisch gefunden Sequenzen wird somit täglich größer und ein Ende ist nicht 

abzusehen. Hierbei spielen die weiter entwickelten molekularbiologischen Methoden eine 

wichtige Rolle, da in wesentlich kürzerer Zeit immer mehr Sequenzen durch ein breites 

screening der Habitate detektiert werden. Somit nimmt die Anzahl an Sequenzen, zu denen 

keine kultivierten Vertreter existieren, immer weiter zu, während die Isolierung von Arten 

dieser Klassen häufig keine Erfolge aufweist (D'Hondt et al., 2004). 

Bei dieser Vielfalt an 16S rRNA Gen Sequenzen stellt sich schnell die Frage, ab wie viel 

Prozent Unterschied es sich eventuell um zwei verschiedene oder um ein und dieselbe Art 

handelt. Hagström et al. legten diese Grenze im Jahr 2000 auf 97 % Sequenzhomologie fest 

(Hagström et al., 2000). So sollten zwei Organismen, die mehr als drei Prozent Unterschied in 

ihren 16S rRNA Genen aufwiesen, als zwei Arten geführt werden. Stackebrandt und Goebel 

hatten aber schon 1994 in einer Studie über DNA-DNA Hybridisierung gezeigt, dass erst 

Organismen die bei dieser Hybridisierung weniger als 70 % erreichen, zu zwei 

unterschiedlichen Arten zu zählen sind. Das musste aber nicht unbedingt bedeuten, dass ihre 

16S rRNA Gene auch mehr als drei Prozent Abweichungen zeigten (Stackebrandt & Goebel, 

1994). Somit sollte das 16S rRNA Gen heute als Hinweis für zwei verschiedene Arten gelten, 

aber nicht zur Definition zweier Arten herangezogen werden. 

Analysen des ribosomalen Gens liefern zudem keine Aussagen über die physiologischen 

Eigenschaften der detektierten Mikroorganismen. Vergleiche mit den nächsten Verwandten in 

den Datenbanken können lediglich Hinweise liefern. Eine Aussage, welche physiologischen 

Eigenschaften ein Organismus hat und welche nicht, können eventuell Vollsequenzierungen 

des Genoms (Seshadri et al., 2005), aber auch Isolate liefern. Diese Isolate sind aber häufig 

nicht vorhanden, besonders wenn neue Habitate untersucht werden. Somit liefert die Analyse 

des ribosomalen Gens zumindest erste Hinweise auf die Zusammensetzung der mikrobiellen 

13

EINLEITUNG 

Gemeinschaften und auch dessen physiologischen Potentials, was durch die Messung von 

chemischen Parametern unterstützt werden kann. 

1.7 Zielsetzung der Arbeit 

Ziel dieser Arbeit war es, die mikrobiellen Gemeinschaften in anoxischen Wattsedimenten bis 

hin zur sulfatfreien Zone mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden zu charakterisieren. 

Veränderungen in der Zusammensetzung über die Tiefe sollten Rückschlüsse auf den 

Zusammenhang von Mikroorganismen und geochemischen Parametern ermöglichen. 

I. In diesem Teilprojekt der Arbeit stand die Diversität der Bakterien in drei 

verschiedenen Standorten des Spiekerooger Rückseitenwattes im Mittelpunkt. Bisherige 

Untersuchungen hatten sich nur mit den ersten 50 cm des Wattsedimentes befasst (Llobet- 

Brossa et al., 1998; Mußmann et al., 2003) und reichten dabei nicht in die sulfatfreien Zonen 

hinein. Ziel war es, Veränderungen in der Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaften 

in anoxischen Wattsedimenten aufzuklären und Rückschlüsse auf Abhängigkeiten der 

Bakterien zur Sedimentabfolge oder dem wichtigen chemischen Parameter Sulfat 

aufzudecken. Dafür wurden Sedimentkerne von Sand- und Mischwattgebieten bis hin zur 

sulfatfreien Zone molekularbiologisch untersucht und in Beziehung mit aufgenommenen 

Sulfatprofilen und den einzelnen Sedimentschichten gestellt. 

II. Von den untersuchten anoxischen Wattsedimenten zeigte der Standort 

Neuharlingersieler Nacken ein zusätzliches Sulfatmaximum in 250 cm Tiefe. Da in dieser 

Tiefe die molekularbiologisch detektierten 16S rRNA Gen Sequenzen nicht eindeutig 

kultivierten Bakterien zugeordnet werden konnten, waren auch nur ungenügende Aussagen 

über deren Stoffwechselaktivitäten möglich. Deshalb sollten zusätzlich zu der Domäne der 

Bakterien die mikrobiellen Gemeinschaften der Archaeen und Eukaryoten 

molekularbiologisch untersucht werden. Da Archaeen durch molekularbiologische Methoden 

besser physiologisch zugeordnet werden können, lassen sich an den Übergangszonen 

zwischen Sulfat und Methan Interaktionen zwischen sulfatreduzierenden Prokaryoten, die nur 

etwa 20 Prozent der bakteriellen Gemeinschaften ausmachen (Llobet-Brossa et al., 2002), und 

methanogenen Archaeen ableiten. Ferner sollte untersucht werden, bis in welche Tiefe 

Eukaryoten zu finden sind und um welche Organismen es sich dabei handelt. Hinweise auf 

14

EINLEITUNG 

anaerob lebende Eukaryoten wurden bereits für Oberflächensedimente mariner 

Küstenhabitate beschrieben (Hamels et al., 1998; Moreira & Lopez-Garcia, 2002). 

III. Um quantitative Abschätzungen von sulfatreduzierenden Prokaryoten und 

methanogenen Archaeen zu treffen war ein weiteres Ziel der Arbeit, Untereinheiten der 

funktionellen Gene der Dissimilatorischen Sulfit-Reduktase, Alpha-Untereinheit (dsrA) und 

der Methyl-Coenzyme M Reduktase, Alpha-Untereinheit (mcrA), mittels quantitativer PCR 

zu bestimmen. Hierbei sollten Übergangszonen zwischen Sulfat und Methan mit größerer 

Tiefenauflösung näher untersucht werden, um Rückschlüsse auf eine anaerobe Oxidation von 

Methan zu treffen, welche schon in nahen Küstensedimenten sowie benachbarten Watten 

beschrieben wurden (Thomsen et al., 2001; Ishii et al., 2004). 

1.8 Literatur 

Backhed, F., Ley, R.E., Sonnenburg, J.L., Peterson, D.A., and Gordon, J.I. (2005) Hostbacterial 

mutualism in the human intestine. Science 307: 1915-1920. 

Backman, J., Moran, K., McInRoy, D.B., Mayer, L.A., and t.E. Scientists (2006) Proceedings 

of the integrated Ocean Drilling Program. 302. 

Barnes, R.O., and Goldberg, E.D. (1976) Methane consumption in anoxic marine sediments. 

Geology 2: 297-300. 

Benson, D.A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D.J., Ostell, J., and Wheeler, D.L. (2006) 

GenBank. Nuc. Acids Res. 34: D16-D20. 

Boetius, A., Ravenschlag, K., Schubert, C.J., Rickert, D., Widdel, F., Gieseke, A. et al. (2000) 

A marine microbial consortium apparently mediating anaerobic oxidation of methane. 

Nature 407: 623-626. 

Böttcher, M.E., Hespenheide, B., Llobet-Brossa, E., Beardsley, C., Larsen, O., Schramm, A. 

et al. (2000) The biogeochemistry, stable isotope geochemistry, and microbial 

community structure of a temperate intertidal mudflat: An integrated study. Cont. 

Shelf Res. 20: 1749-1769. 

Burns, S.J. (1998) Carbon isotopic evidence for coupled sulfate reduction - methane oxidation 

in Amazon Fan sediments. Geochim. Cosmochim. Acta 62: 797-804. 

Carey, D.A. (1983) Particle resuspension in the benthic boundary layer induced by flow 

around polychaete tubes. Can. J. Fish Aquant. Sci. 40: 301-308. 

15

EINLEITUNG 

Chang, T.S., Bartholomae, A., Tilch, E., and Flemming, B.W. (2003) Recent development of 

the backbarrier tidal basin behind the island of Spiekeroog in the East Frisian Wadden 

Sea. Ber. Forschungszentrum Terramare 12: 43-44. 

D'Hondt, S., Jorgensen, B.B., Miller, D.J., Batzke, A., Blake, R., Cragg, B.A. et al. (2004) 

Distributions of microbial activities in deep subseafloor sediments. Science 306: 2216- 

2221. 

DeLong, E.F. (2000) Resolving a methane mystery. Nature 407: 577-579. 

Dijkema, K.S., Reineck, H.-E., and Wolff, W.J. (1980) Geomorphology of the Wadden Sea 

area. Wadden Sea Working Group Rep. 1: 1-135. 

Eckman, J.E., Nowell, A.R.M., and Jumars, P.A. (1981) Sediment destabilization of animal 

tubes. J. Mar. Res. 39: 361-374. 

Elvert, M., Suess, E., Greinert, J., and Whiticar, M.J. (2000) Archaea mediating anaerobic 

methane oxidation in deep-sea sediments at cold seeps of the eastern Aleutian 

subduction zone. Org. Geochem. 31: 1175-1187. 

Flemming, B.W. (1992) Zur holozänen Entwicklung, Morphologie und faziellen Gliederung 

der ostfriesischen Insel Spiekeroog (südliche Nordsee). Ber. Senckenberg am Meer 91: 

51. 

Flemming, B.W., and Nyandwi, N. (1994) Land reclamation as a cause of fine-grained 

sediment depletion in backbarrier tidal flats (southern North sea). Neth. J. Aqua. Ecol. 

28: 299-307. 

Flemming, B.W., and Ziegler, K. (1995) High-resolution grain size patterns and textural 

trends in the backbarrier environment of Spiekeroog Island (southern North Sea). 

Senckenbergiana maritima 26: 1-24. 

Flemming, B.W., Bartholomä, A., Irion, G., Kröncke, I., and Wehrmann, A. (2002) 

Naturraum Wattenmeer. Akad. Geowiss. Hannover, Veröffentl. 20: 150-159. 

Freese, E., and Rullkötter, J. (2003) Characterisation of organic matter in sediments from the 

Wadden Sea of the German Bight. Ber. Forschungszentrum Terramare 12: 57-58. 

Hagström, Å., Pinhassi, J., and Zweifel, U.L. (2000) Biogeographical diversity among marine 

bacterioplankton. Aqua. Microbial Ecol. 21: 231-244. 

Hallam, S.J., Girguis, P.R., Preston, C.M., Richardson, P.M., and DeLong, E.F. (2003) 

Identification of methyl coenzyme M reductase a (mcrA) genes associated with 

methane-oxidizing Archaea. Appl. Environ. Microbiol. 69: 5483-5491. 

16

EINLEITUNG 

Hamels, I., Sabbe, K., Muylaert, K., Barranguet, C., Lucas, C., Herman, P., and Vyverman, 

W. (1998) Organisation of microbenthic communities in intertidal estuarine flats, a 

case study from the Molenplaat (Westerschelde Estuary, The Netherlands). Europ. J. 

Protistol. 34: 308-320. 

Hanson, R.S., and Hanson, T.E. (1996) Methanotrophic bacteria. Microbiol. Rev. 60: 439- 

471. 

Harrison, S.J., and Rhizacklea, A.P. (1987) Vertical temperature-gradients in muddy intertidal 

sediments in the Forth Estuary, Scotland. Limnol. Oceanogr. 32: 954-963. 

Hinrichs, K.U., and Boetius, A. (2002) The anaerobic oxidation of methane: New insights in 

microbial ecology and biogeochemistry. In Ocean Margin Systems. Wefer, G.; Billet, 

D.; Hebbeln, D.; Jorgensen, B.B.; Schlüter, M.; van Weering, T. (eds.) Heidelberg. 

Springer-Verlag. 

Hinrichs, K.U., Hayes, J.M., Sylva, S.P., Brewer, P.G., and DeLong, E.F. (1999) Methaneconsuming 

archaebacteria in marine sediments. Nature 398: 802-805. 

Höhler, T.M., Alperin, M.J., Albert, D.B., and Martens, C.S. (1994) Field and laboratory 

studies of methane oxidation in an anoxic marine sediment: Evidence for a 

methanogen - sulfate reducer consortium. Glob. Biogeochem. Cycl. 8: 451-463. 

Ishii, K., Mußmann, M., MacGregor, B.J., and Amann, R. (2004) An improved fluorescence 

in situ hybridization protocol for the identification of bacteria and archaea in marine 

sediments. FEMS Microbiol. Ecol. 50: 203-212. 

Iversen, N., and Jorgensen, B.B. (1985) Anaerobic methane oxidation rates at the sulfatemethane 

transition in marine sediments from Kattegat and Skagerrak (Denmark). 

Limnol. Oceanogr. 30: 944-955. 

Klenk, H.-P., Clayton, R.A., Tomb, J.-F., White, O., Nelson, K.A., Ketchum, K.A. et al. 

(1997) The complete genome sequence of the hyperthermophilic, sulphate-reducing 

Archaeon Archaeoglobus fulgidus. Nature 390: 364-370. 

Köpke, B., Wilms, R., Engelen, B., Cypionka, H., and Sass, H. (2005) Microbial diversity in 

coastal subsurface sediments: A cultivation approach using various electron acceptors 

and substrate gradients. Appl. Environ. Microbiol. 71: 7819-7830. 

Krögel, F. (1997) Einfluß von Viskosität und Dichte des Seewassers auf Transport und 

Ablagerung von Watsedimenten (Langerooger Rückseitenwatt, südliche Nordsee). 

Ber. FB Geowiss., Univ. Bremen 102: 1-168. 

17

EINLEITUNG 

Llobet-Brossa, E., Rossello-Mora, R., and Amann, R. (1998) Microbial community 

composition of Wadden Sea sediments as revealed by fluorescence in situ 

hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 64: 2691-2696. 

Llobet-Brossa, E., Rabus, R., Bottcher, M.E., Konneke, M., Finke, N., Schramm, A. et al. 

(2002) Community structure and activity of sulfate-reducing bacteria in an intertidal 

surface sediment: A multi-method approach. Aqua. Microbial. Ecol. 29: 211-226. 

Madigan, M.T., Martinko, J.M., and Parker, J. (2003) Brock. Biology of Microorganisms. 

Pearson Education, Inc. Upper Saddle River, NJ 07458 10th ed. 

Mai, S.M., and Bartholomä, A. (2000) The missing mud flats of the Wadden Sea: A 

reconstruction of sediments and accomodation space lost in the wake landreclamation. 

In: Flemming, B.W., Delafontaine, M.T. & Liebezeit, G. [Hrsg]: Muddy Coast 

Dynamics and Resource Management. Elsevier. Amsterdam: 257-272. 

Michaelis, W., Seifert, R., Nauhaus, K., Treude, T., Thiel, V., Blumenberg, M. et al. (2002) 

Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane. Science 

297: 1013-1015. 

Moreira, D., and Lopez-Garcia, P. (2002) The molecular ecology of microbial eukaryotes 

unveils a hidden world. Trends in Microbiol. 10: 31-38. 

Mußmann, M., Ishii, K., Rabus, R., and Amann, R. (2005) Diversity and vertical distribution 

of cultured and uncultured Deltaproteobacteria in an intertidal mud flat of the 

Wadden Sea. Environ. Microbiol. 7: 405-418. 

Mußmann, M., Schulz, H.N., Strotmann, B., Kjaer, T., Nielsen, L.P., Rossello-Mora, R.A. et 

al. (2003) Phylogeny and distribution of nitrate-storing Beggiatoa spp. in coastal 

marine sediments. Environ. Microbiol. 5: 523-533. 

Nauhaus, K., Boetius, A., Kruger, M., and Widdel, F. (2002) In vitro demonstration of 

anaerobic oxidation of methane coupled to sulphate reduction in sediment from a 

marine gas hydrate area. Environ. Microbiol. 4: 296-305. 

Oost, A.P., and De Boer, P.L. (1994) Sedimentology and development of barrier islands, ebbtidal 

deltas, inlets and backbarrier areas of the dutch Wadden Sea. Senckenbergiana 

maritima 24: 65-115. 

Oremland, R.S., and Taylor, B.F. (1977) Sulfate reduction and methanogenesis in marine 

sediments. Geochim. Cosmochim. Acta 42: 209-214. 

Oremland, R.S., and Polcin, S. (1982) Methanogenesis and sulfate reduction: Competitive and 

noncompetitive substrates in estuarine sediments. Appl. Environ. Microbiol. 44: 1270- 

1276. 

18

EINLEITUNG 

Orphan, V.J., Hinrichs, K.U., Ussler, W., 3rd, Paull, C.K., Taylor, L.T., Sylva, S.P. et al. 

(2001) Comparative analysis of methane-oxidizing archaea and sulfate-reducing 

bacteria in anoxic marine sediments. Appl. Environ. Microbiol. 67: 1922-1934. 

Pancost, R.D., Sinninghe Damste, J.S., de Lint, S., van der Maarel, M.J., and Gottschal, J.C. 

(2000) Biomarker evidence for widespread anaerobic methane oxidation in 

Mediterranean sediments by a consortium of methanogenic archaea and bacteria. The 

Medinaut Shipboard Scientific Party. Appl. Environ. Microbiol. 66: 1126-1132. 

Parkes, R.J., Webster, G., Cragg, B.A., Weightman, A.J., Newberry, C.J., Ferdelman, T.G. et 

al. (2005) Deep sub-seafloor prokaryotes stimulated at interfaces over geological time. 

Nature 436: 390-394. 

Reineck, H.-E. (1958) Longitidunale Schrägschichtung im Watt. Geol. Rundschau 47: 73-82. 

Schimel, J. (2004) Playing scales in the methane cycle: From microbial ecology to the globe. 

Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 12400-12401. 

Schink, B. (2002) Synergistic interactions in the microbial world. Antonie van Leeuwenhoek 

81: 257-261. 

Seshadri, R., Adrian, L., Fouts, D.E., Eisen, J.A., Phillippy, A.M., Methe, B.A. et al. (2005) 

Genome sequence of the PCE-Dechlorinating bacterium Dehalococcoides 

ethenogenes. Science 307: 105-108. 

Simon, M., Grossart, H.P., Schweitzer, B., and Ploug, H. (2002) Microbial ecology of organic 

aggregates in aquatic ecosystems. Aqua. Microbial Ecol.28: 175-211. 

Sørensen, K.B., Finster, K., and Ramsing, N.B. (2001) Thermodynamic and kinetic 

requirements in anaerobic methane oxidizing consortia exclude hydrogen, acetate, and 

methanol as possible electron shuttles. Microbial Ecol. 42: 1-10. 

Stackebrandt, E., and Goebel, B.M. (1994) Taxonomic note: A place for DNA-DNA 

reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in 

bacteriology. Int. J. Syst. BActeriol. 44: 846-849. 

Stephens, C., Antonov, J.I., Boyer, M.E., Conkright, M.E., Locarni, R.A., O´Brian, T.D., and 

Garcia, H.E. (2002) world Ocean Atlas 2001, Volume 1: Temperature. S. Levitus, Ed., 

NOAA Atlas Nesdis 49. U.S. Government Printing Office, Wash., D.C.: 1-167. 

Teske, A., Hinrichs, K.U., Edgcomb, V., Gomez, A.D., Kysela, D., Sylva, S.P. et al. (2002) 

Microbial diversity of hydrothermal sediments in the Guaymas Basin: Evidence for 

anaerobic methanotrophic communities. Appl. Environ. Microbiol. 68: 1994-2007. 

19

EINLEITUNG 

Thomsen, T.R., Finster, K., and Ramsing, N.B. (2001) Biogeochemical and molecular 

signatures of anaerobic methane oxidation in a marine sediment. Appl. Environ. 

Microbiol. 67: 1646-1656. 

Tilch, E. (2003) Oszillation von Wattflächen und deren fossiles Erhaltungspotential 

(Spiekerooger Rückseitenwatt, südliche Nordsee). Ber. FB Geowiss., Univ. Bremen 

222: 1-137. 

Valentine, D.L. (2002) Biogeochemistry and microbial ecology of methane oxidation in 

anoxic environments: A review. Antonie van Leeuwenhoek 81: 271-282. 

Valentine, D.L., and Reeburgh, W.S. (2000) New perspectives on anaerobic methane 

oxidation. Environ. Microbiol. 2: 477-484. 

Volkman, J.K., Rohjans, D., Rullkötter, J., Scholz-Böttcher, B.M., and Liebezeit, G. (2000) 

Sources and diagenesis of organic matter in tidal flat sediments from the German 

Wadden Sea. Cont. Shelf Res. 20: 1139-1158. 

Whitman, W.B., Coleman, D.C., and Wiebe, W.J. (1998) Prokaryotes: The unseen majority. 

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6578-6583. 

Woese, C.R. (1987) Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51: 221-271. 

Woese, C.R. (2000) Interpreting the universal phylogenetic tree. Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 

8392-8396. 

Wöstmann, R., Köller, C., and Rullkötter, J. (2003) Biomarkers of peat-forming plants and 

their signal in tidal-flat sediments of the German Bight. Ber. Forschungszentrum 

Terramare 12. 

Ziehe, D. (2005) Datierung von biogenen Carbonaten mit Aminosäurenantiomerenverhältnissen. 

Diplomarbeit an der Carl von Ossietzky Universität Oldenburg, 

Fakultät V. 

Zverlov, V., Klein, M., Lucker, S., Friedrich, M.W., Kellermann, J., Stahl, D.A. et al. (2005) 

Lateral gene transfer of dissimilatory (Bi)sulfite reductase revisited. J. Bac. 187: 2203- 

2208. 

20

PUPLIKATIONEN 

2. Publikationen 

21

Publikation 1: Deep-biosphere bacteria in tidal flats 

2.1 Publikation 1 

Deep biosphere-related bacteria within the subsurface of tidal flat 

sediments 

Reinhard Wilms, Beate Köpke, Henrik Sass, Tae Soo Chang, 

Heribert Cypionka and Bert Engelen 

Environ. Microbiol. (2006) 8: 709-719 

22


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30


31


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33

Publikation 2: Microbial communities in tidal-flat sediments 


Specific bacterial, archaeal and eukaryotic communities in tidal-flat 

sediments along a vertical profile of several meters 

Reinhard Wilms, Henrik Sass, Beate Köpke, Jürgen Köster, 

Heribert Cypionka and Bert Engelen 

Appl. Environ. Microbiol. (2006) 72: 2756-2764 

34


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40


41


42


43


Supplemental material: 

44


45

Publikation 3: Succession of sulfate-reducing Bacteria and methanogenic Archaea 


Methane and sulfate profiles within the subsurface of a tidal flat are 

reflected by the distribution of sulfate-reducing bacteria and 

methanogenic archaea 

Reinhard Wilms, Henrik Sass 1 , Beate Köpke, 

Heribert Cypionka and Bert Engelen * 

Running title 

Succession of sulfate-reducing bacteria and methanogenic archaea 

Eingereicht bei FEMS Microbiology Ecology 

Institut für Chemie und Biologie des Meeres, Carl-von-Ossietzky Universität Oldenburg, 

Carl-von-Ossietzky Straße 9-11, D-26129 Oldenburg, Germany 

1 

Present address: School of Earth, Ocean and Planetary Sciences, Cardiff University, Main 

Building, Park Place, Cardiff, CF10 3YE, Wales, UK 

*Corresponding author. Mailing address: Institut für Chemie und Biologie des Meeres, AG 

Paläomikrobiologie, Universität Oldenburg, Postfach 2503, D-26111 Oldenburg, Germany. 

Phone: +49-441-798-5376, FAX: +49-441-798-3583, email: engelen@icbm.de 

46


Abstract 

The anoxic layers of marine sediments are dominated by sulfate reduction and 

methanogenesis as the main terminal oxidation processes. The aim of the study was to analyse 

the vertical succession of microbial populations involved in these processes along the first 

4.5 m of a tidal-flat sediment. Therefore, a quantitative PCR approach was applied using 

primers targeting the domains of Bacteria, Archaea, and key functional genes for sulfate 

reduction (dsrA) and methanogenesis (mcrA). The sampling site was characterized by an 

unusual sulfate peak at 250 cm depth resulting in separate sulfate-methane transition zones. 

Methane and sulfate profiles were diametrically opposed with a methane maximum in the 

sulfate-depleted zone showing high numbers of archaea and methanogens. The methanesulfate 

interfaces were harboring elevated numbers of sulfate reducers and revealed a slight 

increase in mcrA and archaeal 16S rRNA genes suggesting sulfate-dependent anaerobic 

oxidation of methane. A diversity analysis of both functional genes by PCR-DGGE revealed a 

vertical succession of subpopulations that were governed by geochemical and 

sedimentological settings. Along the upper 200 cm sulfate-reducing populations appeared 

quite uniform and were dominated by Deltaproteobacteria. In the layers beneath an apparent 

increase in diversity and a shift to Firmicutes as the predominant group was observed. 

Keywords 

DGGE; Functional genes; Marine subsurface; Real-time PCR; Tidal flats 

47


1. Introduction 

Coastal marine environments like estuaries and tidal areas are an important link between 

land and the open sea. They receive nutrient input from both and as a result are characterized 

by intense primary production and heterotrophic activity [1-3]. As a consequence, pronounced 

microbial activities in the upper sediment layers are generating steep chemical gradients. 

Oxygen is depleted within the uppermost few millimeters and anoxic conditions prevail 

beneath this layer [4]. Sulfate reduction is considered to be the most important process of 

organic matter remineralisation [5, 6]. The dissimilatory reduction of sulfate can be linked to 

the oxidation of substrates difficult to degrade under anoxic conditions like alkanes and 

aromatic compounds [7] or even to the anaerobic oxidation of methane at sulfate-methane 

transition zones [8-10]. Generally, methanogenesis becomes the dominant terminal oxidation 

process when sulfate is depleted. In most sediments, the sulfate-depleted zone is located tens 

of centimeters to several meters in depth. These subsurface sediment layers came into focus of 

microbiological investigations only recently [10]. The community composition of subsurface 

tidal-flat sediments was studied by a cultivation-based approach [11] and by a phylogenetic 

survey using domain-specific primers [12, 13]. 

A more directed strategy to study the distribution of physiological groups in the 

environment is the analysis of functional genes such as those that encode for the dissimilatory 

sulfate reductase (dsr) and the methyl-coenzyme M reductase (mcr) [14-19]. 

In the present work, we provide a detailed analysis of the sulfate-reducing and 

methanogenic communities from the surface to five meters depth in a tidal-flat sediment. Two 

complementary approaches were applied. Quantitative PCR (qPCR) [20] was used to estimate 

the abundance of Bacteria and Archaea, as well as of dsrA and mcrA genes. The resulting 

depth profiles were correlated with those of porewater sulfate and methane. The quantitative 

approach was complemented by a qualitative diversity assessment of both metabolic groups 

using functional primers for PCR-DGGE. 

48


2. Materials and methods 

2.1. Sample collection 

The sampling site Neuharlingersieler Nacken (53°43´270 N and 07°43´718 E) is located 

in the back barrier tidal area of the island of Spiekeroog, which is part of the German Wadden 

Sea. The biogeochemical settings of this site have been described recently [11, 12]. Up to 5 

meter long sediment cores were collected by vibro-coring using aluminum tubes (Ø 8 cm) in 

June 2002 (core A), October 2003 (core B), February 2004 (core C) and September 2005 

(core D). The liners of core A to C were cut longitudinally, whereas core D was cut directly 

across to avoid degassing of methane during sampling. Subcores for further analyses were 

taken using cut-off 5-ml syringes from the innermost part of the cores every 20 cm, beginning 

at a depth of 40 cm. Additionally, shorter sediment cores were taken by hand at the same 

position to obtain undisturbed subsamples from the sediment surface and 20 cm depth. After 

sampling, all subcores taken for molecular analysis were stored at - 20 °C until further 

processing. 

2.2. Sulfate and methane measurements 

Porewater was gained from sediment samples by centrifugation and filtration through 0.2- 

µm membrane filters. Porewater sulfate concentrations were measured by ion 

chromatography with conductivity detection (Sykam, Gilching, Germany) as described 

previously [21]. 

For measuring methane concentrations, 2 cm³ of sediment were added immediately after 

subsampling to 20 ml sodium hydroxide solution (2.5 %) in gastight tubes. Headspace 

samples (20 µl) were analyzed on a Varian CX 3400 gas chromatograph (Varian, Darmstadt, 

Germany) equipped with a Plot Fused Silica column (No. 7517; 25 m by 0,53 mm, Al 2 O 3 /KCl 

coated; Chromopack, Middleburg, The Netherlands) and a flame ionization detector. 

2.3. Total cell counts 

Sediment samples were fixed by the addition of glutaric dialdehyde (0.2 m filtered, 2 % 

final concentration) and stored at 4 °C in the dark. Prior to analysis, Tween 80 (0.2 m 

filtered, 0.01 % final concentration) was added to the fixed sediment slurries and the samples 

were ultrasonicated (3 x 10 s). An aliquot (5 – 10 l) was diluted 1000-fold in particle-free 

PBS buffer (0.9 g NaCl, sodium phosphate buffer 15 mM, pH 7.4, 0.2 m filtered), 

thoroughly shaken, and filtered through a white polycarbonate membrane (0.2 m pore size, 

49


25 mm diameter, Anodisc 25, Whatman, Maidstone, UK). Cell staining with DAPI (4,6- 

Diamidino-2-phenylindol) and counting was performed according to Süß et al. (2004) [22]. 

2.4. DNA extraction and quantification 

Total genomic DNA was extracted from 0.5 g sediment of each subcore using the 

FastDNA SpinKit (Q-BIOgene, Carlsbad, Canada). DNA concentrations were quantified 

fluorometrically in a microtiterplate reader (FLUOstar Optima, BMG Labtechnologies, 

Offenburg, Germany) using a 1:200 diluted PicoGreen reagent according to a modified 

manufacturers protocol (Molecular Probes, Eugene, USA). In contrast to the original 

instructions, only the tenth part of each volume and 1 µl of the extracted DNA and Lambda- 

DNA in different concentrations from 100 ng·µl -1 to 1 ng·µl -1 were used. 

2.5. Quantitative PCR 

Primer sets specific for different phylogenetic domains and functional genes were used 

for the quantitative (real-time) PCR assay (Table 1) [14, 23-27]. Before quantification, serial 

dilutions of standard DNA had to be prepared. The standard organism for the bacterial 

16S rRNA gene and dsrA-gene approach was Desulfovibrio vulgaris T (DSM 644). A culture 

of Methanosarcina barkeri T (DSM 800) was used as a standard for archaeal 16S rRNA gene 

and mcrA-gene quantifications. Genomic DNA was extracted from liquid cultures using the 

FastDNA SpinKit (Q-BIOgene, Carlsbad, Canada). These DNA extracts were amplified by 

the use of the bacterial primer pair 8f and 1492r or the archaeal primer pair S-D-Arch-0025-a- 

S-17 and S-*-Univ-1517-a-A-21 (Table 1), respectively. Conditions for the eubacteriaspecific 

PCR were described by Süß et al. [22], and before those for the archaea-specific 

approach by Vertriani et al. [26]. The PCR amplicons were purified and adjusted to a volume 

of 50 µl using the PCR purification Kit in accordance with the manufacturer's instructions 

(Qiagen, Hilden, Germany) and served as a target for the qPCR standard curves. For this, they 

were diluted from 1:10 3 to 1:10 10 . As a standard for the functional genes, the total extracted 

genomic DNA of Desulfovibrio vulgaris T and Methanosarcina barkeri T were used in dilutions 

of 1:10 1 to 1:10 7 . 

Quantitative PCR-amplification was performed in 25 µl volume containing: 12.5 µl of the 

DyNAmo TM HS SYBR Green qPCR Kit (Finnzymes Oy, Espoo, Finland), 0.2 mM of each 

primer, 0.6 ng/µl BSA (only 0.2 ng/µl BSA were used for the bacterial approach) and 10 µl of 

the 1:10 diluted DNA templates. Thermal cycling was performed using a Rotor-Gene, RG- 

3000 four channel multiplexing system (Corbett Research, Sydney, Australia) with the 

50


following parameters: 95 °C initial hold for 15 minutes to activate the Taq polymerase, 

followed by 50 cycles of amplification, with each cycle consisting of denaturation at 94 °C for 

10 s, followed by 20 s annealing at primer specific temperatures (Table 1) and the extension 

step for 30 s at 72 °C. Fluorescence was measured at the end of each amplification cycle for 

20 s at 82 °C and 80 °C for the quantification of Archaea, respectively. 

To verify the results, every quantification was repeated three times at the same 

concentrations for all chemicals and templates. To convert the detected gene targets into cell 

numbers, an average of 3.8 and 2 copies of the 16S rRNA gene were estimated for Bacteria 

and Archaea, respectively [28]. 

2.6. PCR-DGGE analysis 

Amplification of dsrA-gene fragments was performed via nested PCR. For this, a part of 

the dsrAB operon (app. 1.9 kb in size) was amplified by a first step using the modified 

primers dsr1F and dsr4R (Table 1). For the second PCR, primer GC-dsr500r and the dsr1F 

were used to amplify dsrA-gene fragments of suitable lengths for DGGE analysis (app. 

500 bp). The GC-clamp containing primer GC-dsr500r was originally published as the 

forward primer 1F1 by Dhillon et al. [14]. In our approach it was used as a reverse primer and 

therefore synthesised reverse complementary. The partial mcrA-gene (app. 500 bp) was 

amplified directly by the use of primer mcrA1f and the GC-clamp containing primer GCmcrA500r 

[29]. PCR mixtures (50 µl volume) were composed of 0.2 mM dNTPs, 1.5 mM 

MgCl 2 , 0.2 mM of each primer, 1 Red Taq Buffer (Sigma, Munich, Germany), 0.6 ng·µl -1 

BSA, 1 U Red Taq DNA polymerase (Sigma, Munich, Germany) and 1 µl of target DNA. 

Templates for the second step of the nested-PCR were 1 µl of 1 to 500 dilutions of amplicons 

obtained by the first PCR. For both amplification steps of the dsrA-gene PCR was set to 30 

cycles, while for the mcrA-gene 40 cycles were applied. PCR reactions were carried out in a 

thermal cycler (Mastercycler, Eppendorf, Hamburg, Germany) under the following 

conditions: a denaturation temperature of 96 °C for 30 s, the respective primer-specific 

annealing temperature (Table 1) for 45 s and an elongation temperature of 72 °C for 1 min, 

followed by a final elongation step at 72 °C for 10 min. PCR products were checked by 

agarose electrophoresis, purified and adjusted to a volume of 10 µl using the MinElute PCR 

purification Kit (Qiagen, Hilden, Germany). The amplicons were separated by denaturing 

gradient gel electrophoresis (DGGE) on an INGENYphorU-2 system (Ingeny, Goes, The 

Netherlands) using a denaturing gradient from 40 to 70 % (where 100 % denaturant contains 

51


7 M urea and 40 % formamide). Electrophoresis and DGGE pattern analysis was performed 

as described previously [12]. 

TABLE 1. Oligonucleotide sequences used in the DGGE and qPCR approach. 

Target Primer DNA sequence Product size Annealing- / fluorescence Approach 

[Reference] [bp] measured temperature 

dsrA gene dsr-1F [27] 5´-ACSCACTGGAAGCACG-3´ ca. 1,900 58 °C DGGE 

dsr-4R [27] 

5´-GTGTAGCAGTTACCGCA-3´ 

dsrA gene dsr-1F [27] 5´-ACSCACTGGAAGCACG-3´ ca. 500 60 °C DGGE 

GC- dsr-500r [14] a 5´-GC-clamp- CGGTGMAGYTCRTCCTG-3´ 

mcrA gene mcrA1f [29] 5´-GGTGGTGTMGGATTCACA ca. 500 58 °C DGGE 

CARTAYGCWACAGC-3´ 

GC-mcrA500r [29] 5´-GC-clamp-TTCATTGCRTAG 

TTWGGRTAGTT-5´ 

Bacteria 8f [24] 5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´ ca. 1,500 54 °C qPCR 

1492r [24] 5´-GGTTACCTTGTTACGACTT-3´ Standard 

Archaea S-D-Arch-0025-a-S-17 [26] 5´-CTGGTTGATCCTGCCAG-3´ ca. 1,500 48 °C qPCR 

S-*-Univ-1517-a-A-21 [26] 5´-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3´ 

Standard 

Bacteria 519f [24] 5´-GCCAGCAGCCGCGGTAAT-3´ ca. 390 50 °C / 82 °C qPCR 

907r [25] 

5´-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3´ 

Archaea S-D-Arch-0025-a-S-17 [26] 5´-CTGGTTGATCCTGCCAG-3´ ca. 320 48 °C / 80 °C qPCR 

S-D-Arch-0344-a-S-20 [26] 5´-ACGGGGCGCAGCAGGCGCGA-3´ 

dsrA gene dsr-1F [27] 5´-ACSCACTGGAAGCACG-3´ ca. 450 58 °C / 82 °C qPCR 

dsr-500r [14] a 

5´-CGGTGMAGYTCRTCCTG-3´ 

mcrA gene ME1f [23] 5´-GCMATGCARATHGGWATGTC-3´ ca. 300 54 °C / 82 °C qPCR 

ME3r [23] 

5´-TGTGTGAASCCKACDCCACC-3´ 

a reverse and complementary 

2.7. Sequencing and phylogenetic analysis 

DGGE bands obtained by the dsrA-gene approach were excised, treated and sequenced as 

described previously [30]. The PCR protocol was modified for reamplification: 96 °C for 

30 s, 60 °C for 45 s and 72 °C for 1 min (25 cycles) and a final elongation at 72 °C for 

10 min. The phylogenetic calculations were conducted by applying the phylogenetic analysis 

software ARB [31] using reference sequences. All partial dsrA-gene sequences obtained in 

this study have been deposited in the EMBL database under accession numbers AM234729 to 

AM234743. 

52


3. Results 

3.1. Sulfate and methane profiles 

Previous investigations of the sampling site (cores A to C) had revealed relatively 

uniform lithological profiles, with sand-dominated upper layers, mud at the bottom of the 

cores and an intermediate shell layer (approximately 170 to 240 cm depth) [13]. This shell 

layer corresponded to a subsurface sulfate maximum, indicating a possible influx of sulfaterich 

water from a nearby tidal creek. The porewater sulfate profiles taken at four sampling 

campaigns were also highly similar, with minor variations at the sediment surface and in the 

magnitude of the deep sulfate peak. Therefore, the methane profile that was measured in 

September 2005 (core D) can be assumed to reflect also the situation in the cores A to C. 

Sulfate concentrations at the surface were around 28 mM and rapidly decreased to values 

below 1 mM beneath 50 cm depth (Fig. 1A). Methane concentrations at the sediment surface 

did not exceed 0.5 µM, while in the sulfate minimum zone concentrations of up to 125 µM 

were measured. In the subsurface the sulfate peak between 200 and 380 cm depth methane 

concentrations declined again to values around 5 µM. Beneath 400 cm depth, sulfate was 

depleted to concentrations below 0.2 mM, whereas methane increased again to values of 

100 µM. These unusual profiles resulted in the presence of three sulfate-methane transition 

zones at around 100, 220 and 370 cm depth. Standard deviations between the investigated 

cores were in the range of about 0.04 mM for low sulfate concentrations and up to 4.26 mM 

for high values. 

3.2. Quantification of Prokarya and functional genes 

Similar to the relatively minor variations in geochemical gradients, epifluorescence 

microscopy revealed that total cell counts in the different cores differed only slightly as well. 

In surface sediment generally, 3 to 5 10 8 cells per cm 3 were found. Numbers declined to 

10 8 - 10 7 cells per cm 3 at 300 cm depth (data not shown). 

The ratio of archaeal to bacterial 16S rRNA gene copies as determined by qPCR generally 

increased from 1:100 at the surface to 1:3 at 450 cm depth. The calculated standard deviations 

for replicate quantifications of one core were mainly between 10 and 50 percent. Differences 

between corresponding layers of all cores were slightly higher. Estimated bacterial numbers 

were highest at the sediment surface, whereas Archaea peaked at a depth of 140 cm (Fig. 1B). 

Beneath 200 cm depth the estimated cumulative prokaryotic cell numbers decreased to 10 6 

cells per gram sediment. In the sulfate-depleted zone (140 to 180 cm) and the shell layer 

bacterial numbers were steadily low, but strongly decreased within the mud layers beneath. 

53


The highest numbers of archaeal targets were detected in the sulfate-depleted layers and 

constantly declined within the shell and mud layers. 

Fig. 1. Depth profiles of site Neuharlingersieler Nacken. Higher values of microorganisms and functional genes 

were determined at the sulfate-methane transition zones (100 and 200 cm). Values of core A are given in 

squares, core B in triangles, core C in circles, and core D in diamonds. The curves display average values. a) 

Sulfate (black symbols) and methane (grey symbol) profiles along the sediment core. b) Calculated numbers of 

Bacteria (black symbols) and Archaea (grey symbols) per gram sediment. c) Calculated numbers of dsrA genes 

(black symbols) and mcrA genes (grey symbols) per gram sediment. 

The depth profiles of the functional genes representative for sulfate-reducing prokaryotes 

and methanogenic archaea generally correlated well with those of the bacterial and archaeal 

16S rRNA genes (Fig. 1C). High values for the dsrA and the mcrA gene were obtained from 

near-surface sediments. The depth decrease in numbers of dsrA genes followed the general 

bacterial trend. The peak of archaeal 16S rRNA gene copies around 140 cm depth was well 

reflected by the profile obtained for the mcrA gene. At the upper two sulfate-methane 

transition zones elevated numbers of dsrA gene copies were detected, suggesting anaerobic 

methane oxidation coupled to sulfate reduction in these layers. These local maxima at 

approximately 100 and 200 cm depth coincided with a faint local maximum of mcrA as well 

as of bacterial and archaeal 16S rRNA gene copies. In the deep mud layers detected numbers 

were generally at least one order of magnitude lower that in the shell and sand layers, so that 

no clear maxima could be recognized. 

54


The ratio of dsrA genes to bacterial 16S rRNA gene numbers ranged from 1:50 to 1:20 

throughout the entire sediment column. Surprisingly, the ratio of mcrA genes to archaeal 

16S rRNA targets decreased from 1:3 to 1:7 in the sandy sediment layers to less than 1:100 at 

300 cm depth. 

3.3. DGGE analysis of mcrA and dsrA genes 

The diversity analysis of mcrA and dsrA genes by DGGE resulted in distinct clusters 

reflecting different compartments of the sediment column (Figs. 2 and 3). Those are 

characterized by geochemical settings. Samples obtained from corresponding depths of the 

different cores (A to C) revealed highly similar patterns, and generally showed less overlap to 

samples from other depths. 

Fig. 2. Cluster analysis of DGGE band patterns with specific primers for the mcrA gene. The zone from 220 to 

280 cm revealed a different community composition. The other depths were characterized by low sulfate 

concentrations, which reflects the competition between sulfate reducers and methanogens. The dendrogram was 

calculated by Pearson correlation and UPGMA. Spatial variations in community composition (marked by an 

asterisk) were reflected by the affiliation of single sediment layers of a given core to different layers of other 

cores. 

55


Fig. 3. Cluster analysis of DGGE band patterns with specific primers for the dsrA gene and position of bands 

sequenced. The depths of 280 and 320 cm showed a different sulfate-reducing community composition than 

other layers reflecting decreasing sulfate and low methane concentrations. Bands revealing sequences that are 

closely related to the same dsrA gene are marked by the same letter. Phylogenetic affiliation, sequence 

similarities and depth distribution are given in Table 2. 

One cluster of mcrA-gene patterns was detected at 220 and 280 cm depth, characterized 

by the deep sulfate peak and decreasing methane concentrations. The other patterns formed a 

second cluster. Due to outliers (marked by an asterisk in Fig. 2), subclusters of other 

compartments are not clearly visible. However, layers containing high and low methane 

concentrations seem to possess similar mcrA genes. While band patterns of dsrA amplicons 

yielded different clusters, they correlated with the sedimentological settings rather than with 

geochemical gradients (Fig. 3). The sand- and shell-dominated upper layers (down to 220 cm 

depth) revealed relatively uniform patterns with a single dominant and a few faint additional 

bands. A major shift was observed for the mud layers from 220 cm downwards. They were 

characterized by a higher variability and apparently increasing band numbers. 

56


TABLE 2. Overview of dsrA-gene phylotypes from sulfate-reducing prokaryotes detected by PCR-DGGE. The letters and numbers 

correspond to the appearance and position of different detected phylotypes given in Figure 3. The similarity of the phylotypes which was 

more than one time detected are given in percent. For each phylotype the most closely related sequence, the closest cultivated organism and 

its appearance with depth are given. Closely related sequences revealed the same closest relative were grouped and labeled with the same 

letter (A to C). The sequence variation (in percent) in this single groups is given in brackets. 

Appearance of Closest described relative Sim. Closest phylotype Sim. Distribution with 

depth [cm] 

dsrA sequences (%) (%) 0 160 - 180 220 - 

360 

A (99%) Unc. a sulfate-reducing bacterium mCR119 84 Desulforhopalus singaporensis T 75 + + 

B (98%) Unc. sulfate-reducing bacterium VHS057 82 Desulfonatronum lacustre T 73 + + 

C (91-100%) Unc. sulfate-reducing bacterium UI-DSR43 77 Desulfotomaculum thermosapovorans T 77 + + 

D Unc. sulfate-reducing bacterium KA064 85 Desulfobacca acetoxidans T 71 + 

E Unc. sulfate-reducing bacterium KS03 78 Desulfobacca acetoxidans T 67 + 

F Unc. sulfate-reducing bacterium xCR031 77 Desulfonema limicola T 73 + 

G Unc. sulfate-reducing bacterium Sed2-DSR11 86 Desulfobacca acetoxidans T 67 + 

a Unc., Uncultured. 

Sequencing the main dsrA amplicons along the upper 220 cm (band A, Fig. 3) revealed a 

similarity of 75 % to the dsrA gene from the Deltaproteobacterium Desulforhopalus 

singaporensis T (Table 2) and of 90 % to the Wadden Sea clone DSR_SpoogII_043_C07 

(Mussmann, personal communication). Most sequences originating from the layers beneath 

220 cm depth (band C) were closely related to the dsrA gene of the Firmicute 

Desulfotomaculum thermosapovorans T (77 % similarity). Three other sequences with low 

similarities among each other were affiliated to Desulfobacca acetoxidans T as closest 

described phylotype (67 - 71 % similarity). 

57


4. Discussion 

In the present study population sizes of bacteria, archaea, sulfate reducers and 

methanogens along the geochemical gradients of tidal-flat sediment were estimated by 

applying quantitative PCR. It turned out that population sizes of the different groups were 

well correlated with the respective geochemical gradients, and that anaerobic methane 

oxidation coupled to sulfate reduction might occur in these sediments. 

4.1. Prokaryotes quantification in sediments 

In our investigation, total cell counts in deeper layers showed higher values than 

calculated after quantitative PCR analysis. It is feasible that total cell counts by DAPI staining 

overestimate the actual in situ numbers by counting cell like particles. These false positive 

signals increase with decreasing cell numbers due to the need of concentrating sample 

material. A novel method with neglectable background signals using SYBR green as 

fluorescence dye was developed by Lunau et al. [32]. This technique yielded the same cell 

numbers for Wadden Sea surface sediments (Lunau and Hilker, personal communications) as 

our direct counts by DAPI, while for deeper layers a tenfold lower cell number was counted. 

These findings would correspond much better with the calculated numbers of Prokaryotes by 

quantitative PCR. However, there are other potential reasons for differences between direct 

counts and qPCR like varying DNA extraction efficiencies, co-extraction of PCR interfering 

humic-like substances, or deviating 16S rRNA gene copy numbers [28]. 

4.2. Abundance of methanogens within the subsurface 

Functional genes indicative for methanogens and sulfate reducers were detected along the 

entire sediment column from the surface down to 450 cm depth. This is surprising since both 

physiological groups generally compete for the same substrates and hence are thought to not 

co-occur. However, methylothrophic methanogens might escape direct competition with 

sulfate reducers by utilization of certain methylated substrates (e.g. methyl amines, dimethyl 

sulfide) not utilized by the latter [33]. On the other hand, the relatively high numbers of mcrA 

targets detected just beneath the oxidized surface sediments could also be a result of 

occasionally occurring high organic matter supply by sedimentation. This short-term substrate 

surplus may rid the methanogens of the direct competition and offer a short-term niche [34, 

35]. The high numbers of Archaea and mcrA-gene targets between 100 and 200 cm indicate 

that these organisms are responsible for the methane peak within the sulfate-depleted zone. 

58


At first sight it seems surprising that the high methane values at 450 cm depth were not 

accompanied by strongly increasing numbers of methanogens or mcrA genes. However, this 

can be partly explained by sedimentological parameters. Compared to the coarse sand and 

shell layers the fine-grained mud has a very low hydraulic conductivity diminishing diffusive 

fluxes and leading to relatively steep chemical gradients. On the other hand, cell counts 

obtained by epifluorescence microscopy were already more than one order of magnitude 

lower than those for the sand layers. This trend was supported by the results of the 

quantitative PCR that indicated an even stronger decrease. A potential bias may also be 

caused by insufficient coverage of the target phyla by the PCR primers used. In a previous 

study, we detected a new branch within the Euryarchaeota present in the deep mud layers by 

applying primers targeting eukaryotic rRNA genes [13]. These archaea were not detected in 

the assays using archaeal primers, suggesting a potential underestimation of the actual in situ 

numbers of some groups of archaea. 

4.3. Relative abundance of sulfate-reducing bacteria 

The ratio of dsr to bacterial 16S rRNA targets in deeper sediment layers of site 

Neuharlingersieler Nacken was similar to that at the sediment surface (app. 5 %). However, 

the described qPCR bias for the quantification of Prokaryotes and functional genes should be 

roughly the same. Therefore, the calculated percentage of sulfate reducers does not change 

significantly. Even though they only account for five to ten percent of the whole community, 

they contribute thoroughly to biochemical processes within subsurface sediments. However, 

the calculated number was two to five times lower than described for other marine sediments 

[36, 37]. The discrepancy might be explained by the different methodological approaches 

used in these studies. Applying fluorescence in situ hybridization combined with catalyzed 

reporter deposition (CARD–FISH), Mußmann et al. investigated the uppermost layers of an 

adjacent tidal flat [36]. Sulfate reducers were estimated to represent app. 10 % of the total cell 

count which is in the same order of magnitude as our results. The deviations might be due to 

the different sedimentological settings of the investigated sampling sites. Sahm et al. have 

used slot-blot hybridization to calculate a proportion of SRB on the total prokaryotic rRNA of 

18 to 25 % in sediments of Aarhus Bay, Denmark [37]. However, this calculation is based on 

the assumption that all microorganisms contain the same amount of ribosomal RNA. This 

favors the quantification of microorganisms with a higher amount of ribosomes. In general, 

the method of choice depends on the question to be answered. DNA-based quantitative PCR 

and CARD-FISH show comparable results when certain abundancies are determined. The big 

59


advantage in analyzing RNA in contrast to DNA is that conclusions can specifically be drawn 

on active members of the microbial communities. 

4.4. Diversity of the sulfate-reducing populations 

At first sight the findings by DGGE analysis suggest an increasing diversity of sulfate 

reducers with depth. A vertically structured community of sulfate-reducing bacteria was 

found that was governed by more than a single environmental factor. Cluster analysis 

reflected the sedimentological settings to a certain extent. The sand- and shell layers were 

grouped together and the mud layers formed a separate cluster. However, similar patterns 

were found for sulfate-rich surface layers and the sulfate-depleted zone (160-180 cm). In this 

respect, our results differ from previous reports, that described changing communities of 

sulfate-reducing bacteria in surface sediments along an estuarine-salinity gradients and 

concomitantly increasing sulfate concentrations [18, 38]. 

In general, the detected shift from sulfate-reducing bacteria affiliated to 

Deltaproteobacteria to those of Firmicutes is an agreement with previous analyses of the 

same sampling site. In a molecular approach, a shift from Proteobacteria to the Chloroflexi 

with depth indicated similar properties as deep biosphere habitats [12]. In a cultivation based 

approach, a shift to the Firmicutes with depth was found, indicating the presence of inactive 

spores [11]. Thus, the detection of dsrA genes that derived from Firmicutes might also be due 

to the accumulation of spores in deeper layers. The assessment of active microorganisms can 

only be achieved by RNA based methods. However, the analysis of sulfate-reducing 

communities via dsrA sequence analysis is prone to two more shortcomings. The limited 

sequence length (app. 350 bp) and - despite extensive recent work [27, 39] - still relatively 

low numbers of dsr sequences in the databases. This hinders the correct affiliation of a 

detected sequence to a certain phylogenetic group. On the other hand, the sequences detected 

by the DGGE approach can be expected to be present in significant numbers, since dsrA-gene 

sequences must represent one percent or more to be detected [40]. Therefore, the results 

presented here point in the same direction as those obtained by CARD-FISH [36]. Mußmann 

et al. found Desulfobulbaceae (including Desulforhopalus spp.) to represent up to 4 % of the 

bacterial community, while the most abundant SRB belonged to the Desulfosarcinales. The 

latter were present in the DGGE analysis as well, but delivered only a relatively faint band 

(Fig. 3, band F; related to Desulfonema limicola). 

60


4.5. Heterogeneity of the dsrA-gene sequences 

Although the total number of DGGE bands increased with depth, only two relatively 

homogeneous groups of sequences were found. The sequences of nine dsrA-gene fragments 

were affiliated to the dsrA gene of Desulfotomaculum thermosapovorans T but showed a 

different migration behavior in the DGGE gel. This genomic diversity was detected since the 

DGGE approach in principle can separate bands differing only in a single nucleotide [41]. 

Due to the wobble hypothesis [42] sequence mutations of functional genes occur more 

frequently than in the highly conserved 16S rRNA gene. Sequence variations of the 

Desulfotomaculum thermosapovorans T affiliated dsrA genes were in 75 % of all cases caused 

by a mutation on the third nucleotide of the triplet code and obviously have less detrimental 

impact. At present, we can only speculate about the functional meaning of the remaining 

micro-heterogeneity of the dsrA sequences. But it might reflect adaptation to environmental 

conditions and occupation of different ecological niches [43]. 

4.6. Anaerobic methane oxidation 

At several investigated sediments elevated numbers of sulfate reducers and methanogens 

within sulfate-methane transition zones suggest an anaerobic methane oxidation coupled to 

sulfate reduction [9, 10, 44, 45]. This process might also occur at site Neuharlingersieler 

Nacken. This is not only indicated by the elevated numbers of mcrA- and dsrA-gene copies at 

the sulfate-methane transition zones. The steep slope of the methane profile at the upper edge 

of the subsurface sulfate peak at 170 to 220 cm depth points towards a consumptive process. 

Highly specialized consortia of sulfate reducers (Desulfosarcina or Desulfococcus) and 

members of the archaeal ANME groups were supposed to conduct this reaction in sediments 

overlying methane hydrates [46, 47]. Their molecular signatures were also found in coastal 

sediments from Aarhus Bay [10]. Although the consortia were just recently detected by 

CARD-FISH in a nearby sand flat [8], at present we do not know if other phylogenetic groups 

might be involved in this process at site Neuharlingersieler Nacken. At the sulfate-methane 

interface of a deep sub-seafloor habitat, Parkes et al. did not find members of the ANME 

groups as well [45]. Here, the archaeal community was dominated by members of the 

Methanobacteriales and Methanosarcinales group, what was also found for the subsurface of 

site Neuharlingersieler Nacken [13]. 

61


4.7. Ecological relevance and outlook 

Our results indicate that the methane production within sulfate depleted layers of the 

subsurface of tidal-flat sediments is mediated by methanogenic archaea. Even though elevated 

methane concentrations were determined in the water column above these sediments 

(Grunwald, personal communication), the methane profile suggest a consumptive process 

within the sediment. One explanation is microbial methane oxidation that controls the 

methane emission. Without this process, the concentration of this climatically active gas 

might be even higher. A detailed investigation of the methane flux and the cultivation of 

organisms that are involved in the methane cycle is currently performed in a project 

embedded in the research unit “BioGeoChemistry of Tidal Flats”. 

62


Acknowledgements 

We thank the Senckenberg Institute, Department for Marine Research, and especially the 

crew of the RV Senckenberg for their help to recover the sediment cores. We also thank Katja 

Ziegelmüller, Melanie Beck, and Yvonne Hilker for assistance in sequencing DGGE bands, 

analyzing sulfate-, and methane concentrations. This work is part of the research unit 

“BioGeoChemistry of Tidal Flats” funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). 

63


References 

[1] Dittman, S. (1999) The Wadden Sea ecosystem: stability, properties and mechanism. 

Springer, New York. 

[2] Kim, B.-S., OH, H.-M., Kang, H., and Chun, J. (2005) Archaeal diversity in tidal flat 

sediment as revealed by 16S rDNA analysis. J. Microbiol. 43, 144-151. 

[3] Poremba, K., Tillmann, U., and Hesse K.J. (1999) Tidal impact on planktonic primary 

and bacterial production in the German Wadden Sea. Helgoland Marine Res. 53, 19- 

27. 

[4] Böttcher, M.E., Hespensheide, B., Llobet-Brossa, E., Bearsdley, C., Larsen, O., 

Schramm, A., Wieland, A., Böttcher, G., Berninger, U.G., and Amann, R. (2000) The 

biogeochemistry, stable isotope geochemistry, and microbial community structures of 

a temperture intertidal mudflat: An integrated study. Cont. Shelf Res., 20, 1749-1769. 

[5] Jorgensen, B.B. (1982) Mineralization of organic matter in the sea bed-the role of 

sulphate reduction. Nature 296, 643-645. 

[6] Llobet-Brossa, E., Rabus, R., Bottcher, M.E., Konneke, M., Finke, N., Schramm, A., 

Meyer, R.L., Grotzchel, S., Rossello-Mora, R., and Amann, R. (2002) Community 

structure and activity of sulfate-reducing bacteria in an intertidal surface sediment: a 

multi-method approach. Aqua. Microbial Ecol. 29, 211-226. 

[7] Hansen, T.A. (1994) Metabolism of sulfate-reducing prokaryotes. Antonie Van 

Leeuwenhoek 66, 165-185. 

[8] Ishii, K., Mußmann, M., MacGregor, B.J., and Amann, R. (2004) An improved 

fluorescence in situ hybridization protocol for the identification of bacteria and 

archaea in marine sediments. FEMS Microbiol. Ecol. 50, 203-212. 

[9] Iversen, N. and Jorgensen B.B. (1985) Anaerobic methane oxidation rates at the 

sulfate-methane transition in marine sediments from Kattegat and Skagerrak 

(Denmark). Limnol. Oceanogr. 30, 944-955. 

[10] Thomsen, T.R., Finster, K., and Ramsing, N.B. (2001) Biogeochemical and molecular 


Microbiol. 67, 1646-1656. 

[11] Köpke, B., Wilms, R., Engelen, B., Cypionka, H., and Sass, H. (2005) Microbial 

diversity in coastal subsurface sediments: a cultivation approach using various electron 

acceptors and substrate gradients. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7819-7830. 

64


[12] Wilms, R., Köpke, B., Sass, H., Chang, T.S., Cypionka, H., and Engelen, B. (2006) 

Deep-Biosphere related bacteria within the subsurface of tidal flat sediments. Environ. 

Microbiol. 8, 709-719. 

[13] Wilms, R., Sass, H., Köpke, B., Köster, J., Cypionka, H., and Engelen, B. (2006) 

Specific bacterial, archaeal and eukaryotic communities in tidal-flat sediments along a 

vertical profile of several meters. Appl. Environ. Microbiol. 72:2756-2764 

[14] Dhillon, A., Teske, A., Dillon, J., Stahl, D.A., and Sogin, M.L. (2003) Molecular 

characterization of sulfate-reducing bacteria in the Guaymas Basin. Appl. Environ. 

Microbiol. 69, 2765-2772. 

[15] Earl, J., Hall, G., Pickup, R.W., Ritchie, D.A., and Edwards, C. (2003) Analysis of 

methanogen diversity in a hypereutrophic lake using PCR-RFLP analysis of mcr 

sequences. Microbial Ecol. 46, 270-278. 

[16] Kondo, R., Nedwell, D.B., Purdy, K.J., and Silva, S.D. (2004) Detection and 

enumeration of sulphate-reducing bacteria in estuarine sediments by competitive PCR. 

Geomicrobiol. J. 21, 145-157. 

[17] Leloup, J., Quillet, L., Oger, C., Boust, D., and Petit, F. (2004) Molecular 

quantification of sulfate-reducing microorganisms (carrying dsrAB genes) by 

competitive PCR in estuarine sediments. FEMS Microbiol. Ecol. 47, 207-214. 

[18] Leloup, J., Quillet, L., Berthe, T., and Petit, F. (2006) Diversity of the dsrAB 

(dissimilatory sulfite reductase) gene sequences retrieved from two contrasting 

mudflats of the Seine estuary, France. FEMS Microbiol. Ecol. 55, 230-238. 

[19] Lueders, T., Chin, K.J., Conrad, R., and Friedrich, M. (2001) Molecular analyses of 

methyl-coenzyme M reductase alpha-subunit (mcrA) genes in rice field soil and 

enrichment cultures reveal the methanogenic phenotype of a novel archaeal lineage. 

Environ. Microbiol. 3, 194-204. 

[20] Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., and Watson, R. (1993) Kinetic PCR Analysis - 

Real time monioring of DNA amplification reactions. Biotechnology 11, 1026-1030. 

[21] Sass, A.M., Sass, H., Coolen, M.J.L., Cypionka, H., and Overmann, J. (2001) 

Microbial communities in the chemocline of a hypersaline deep- sea basin (Urania 

basin, Mediterranean Sea). Appl. Environ. Microbiol. 67, 5392-5402. 

[22] Süß, J., Engelen, B., Cypionka, H., and Sass, H. (2004) Quantitative analysis of 

bacterial communities from Mediterranean sapropels based on cultivation-dependent 

methods. FEMS Microbiol. Ecol. 51, 109-121. 

65


[23] Hales, B.A., Edwards, C., Ritchie, D.A., Hall, G., Pickup, R.W., and Saunders, J.R. 

(1996) Isolation and identification of methanogen-specific DNA from blanket bog peat 

by PCR amplification and sequence analysis. Appl. Environ. Microbiol. 62, 668-675. 

[24] Lane, D.J. (1991) 16S/23S sequencing. In: Stackebrandt, E., Goodfellow, M. (Eds.), 

Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Wiley, Chichester, England, 205-248. 

[25] Muyzer, G., Teske, A., Wirsen, C.O., and Jannasch, H.W. (1995) Phylogenetic 

relationships of Thiomicrospiraspecies and their identification in deep-sea 

hydrothermal vent samples by denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rDNA 

fragments. Arch. Microbiol. 164, 165-172. 

[26] Vetriani, C., Jannasch, H.W., MacGregor, B.J., Stahl, D.A., and Reysenbach, A.L. 

(1999) Population structure and phylogenetic characterization of marine benthic 

archaea in deep-sea sediments. Appl. Environ. Microbiol. 65, 4375-4384. 

[27] Wagner, M., Roger, A.J., Flax, J.L., Brusseau, G.A., and Stahl, D.A. (1998) 

Phylogeny of dissimilatory sulfite reductases supports an early origin of sulfate 

respiration. J. Bacteriol. 180, 2975-2982. 

[28] Fogel, G.B., Collins, C.R., Li, J., and Brunk, C.F. (1999) Prokaryotic Genome Size 

and SSU rDNA Copy Number: Estimation of Microbial Relative Abundance from a 

Mixed Population. Microbial Ecol. 38, 93-113. 

[29] Luton, P.E., Wayne, J.M., Sharp, R.J., and Riley, P.W. (2002) The mcrA gene as an 

alternative to 16S rRNA in the phylogenetic analysis of methanogen populations in 

landfill. Microbiology 148, 3521-3530. 

[30] Del Panno, M., Morelli, I.S., Engelen, B., and Berthe-Corti, L. (2005) Effect of 

petrochemical sludge concentrations on microbial communities during a soil 

bioremediation process. FEMS Microbiol. Ecol. 53, 305-316. 

[31] Ludwig, W., Strunk, O., Westram, R., Richter, L., Meier, H., Yadhukumar, Buchner, 

A., Lai, T., Steppi, S., Jobb, G., Forster, W., Brettske, I., Gerber, S., Ginhart, A.W., 

Gross, O., Grumann, S., Hermann, S., Jost, R., Konig, A., Liss, T., Lussmann, R., 

May, M., Nonhoff, B., Reichel, B., Strehlow, R., Stamatakis, A., Stuckmann, N., 

Vilbig, A., Lenke, M., Ludwig, T., Bode, A., and Schleifer, K.-H. (2004) ARB: a 

software environment for sequence data. Nucleic Acids Res. 32, 1363-1371. 

[32] Lunau, M., Lemke, A., Walther, K., Martens-Habbena, W., and Simon, M. (2005) An 

improved method for counting bacteria from sediments and turbid environments by 

epifluorescence microscopy. Environ. Microbiol. 7, 961-968. 

66


[33] Madigan, M.T., Martinko, J.M., and Parker J. (2003) Brock Biology of 

Microorganisms. Pearson Education, Inc. Upper Saddle River, NJ 07458, 10th ed. 

[34] Fitzsimons, M.F., Dawit, M., Revitt, D.M., and Rocha, C. (2005) Effects of early tidal 

inundation on the cycling of methylamines in inter-tidal sediments. Mar. Ecol. Prog. 

Ser. 294, 51-61. 

[35] Oremland, R.S. and Polcin, S. (1982) Methanogenesis and sulfate reduction: 

Competitive and noncompetitive substrates in estuarine sediments. Appl. Environ. 

Microbiol. 44, 1270-1276. 

[36] Mußmann, M., Ishii, K., Rabus, R., and Amann, R. (2005) Diversity and vertical 

distribution of cultured and uncultured Deltaproteobacteria in an intertidal mud flat of 

the Wadden Sea. Environ. Microbiol. 7, 405-418. 

[37] Sahm, K., MacGregor, B.J., Jørgensen, B.B., and Stahl, D.A. (1999) Sulphate 

reduction and vertical distribution of sulphate-reducing bacteria quantified by rRNA 

slot-blot hybridization in a coastal marine sediment. Environ. Microbiol. 1, 65-74. 

[38] Nedwell, D.B., Embley, T.M., and Purdy, K.J. (2004) Sulphate reduction, 

methanogenesis and phylogenetics of the sulphate reducing bacterial communities 

along an estuarine gradient. Aqua. Microbial Ecol. 37, 209-217. 

[39] Loy, A., Lehner, A., Lee, N., Adamczyk, J., Meier, H., Ernst, J., Schleifer, K.-H., and 

Wagner, M. (2002 ) Oligonucleotide microarray for 16S rRNA gene-based detection 

of all recognized lineages of sulfate-reducing prokaryotes in the environment. Appl. 

Environ. Microbiol. 68, 5064-5081. 

[40] Murray, A.E., Hollibaugh, J.T., and Orrego, C. (1996) Phylogenetic compositions of 

bacterioplankton from two California estuaries compared by denaturing gradient gel 

electrophoresis of 16S rDNA fragments. Appl. Environ. Microbiol. 62, 2676-2680. 

[41] Fischer, S.G. and Lerman, L.S. (1983) DNA fragments differing by single base-pair 

substitutions are separated in denaturing gradient gels: correspondence with melting 

theory. PNAS. 80, 1579-1583. 

[42] Crick, F.H. (1966) Codon-anticodon pairing: the wobble hypothesis. J. Mol. Biol. 19, 

548-55. 

[43] Jaspers, E. and Overmann, J. (2004) Ecological significance of microdiversity: 

Identical 16S rRNA gene sequences can be found in bacteria with highly divergent 

genomes and ecophysiologies. Appl. Environ. Microbiol. 70, 4831-4839. 

[44] D'Hondt, S., B. B. Jørgensen, D. J. Miller, A. Batzke, R. Blake, B. A. Cragg, H. 

Cypionka, G. R. Dickens, T. Ferdelman, K.-U. Hinrichs, N. G. Holm, R. Mitterer, A. 

67


Spivack, G. Wang, B. Bekins, B. Engelen, K. Ford, G. Gettemy, S. D. Rutherford, H. 

Sass, C. G. Skilbeck, I. W. Aiello, G. Guerin, C. H. House, F. Inagaki, P. Meister, T. 

Naehr, S. Niitsuma, R. J. Parkes, A. Schippers, D. C. Smith, A. Teske, J. Wiegel, C. 

N. Padilla, and J. L. S. Acosta. 2004. Distributions of microbial activities in deep 

subseafloor sediments. Science 306:2216-2221. 

[45] Parkes, R.J., Webster, G., Cragg, B.A., Weightman, A.J., Newberry, C.J., Ferdelman, 

T.G., Kallmeyer, J., Jorgensen, B.B., Aiello, I.W., and Fry, J.C. (2005) Deep subseafloor 

prokaryotes stimulated at interfaces over geological time. Nature 436, 390- 

394. 

[46] Boetius, A., Ravenschlag, K., Schubert, C.J., Rickert, D., Widdel, F., Gieseke, A., 

Amann, R., Jørgensen, B.B., Witte, U., and Pfannkuche, O. (2000) A marine microbial 

consortium apparently mediating anaerobic oxidation of methane. Nature 407, 623- 

626. 

[47] Orphan, V.J., House, C.H., Hinrichs, K.-U., McKeegan, K.D., and DeLong, E.F. 

(2002) Multiple archaeal groups mediate methane oxidation in anoxic cold seep 

sediments. PNAS. 99, 7663-7668. 

68

DISKUSSION 

3. Diskussion 

69

DISKUSSION 

3. Diskussion 

3.1 Detektion von „deep biosphere“ Bakterien im Wattenmeer 

Die molekularbiologischen Untersuchungen haben gezeigt, dass die Oberflächensedimente 

des Wattenmeeres von Proteobakterien dominiert werden. Ab 160 cm Tiefe werden diese 

Organismen von Vertretern der Chloroflexi als dominierende Bakterien abgelöst. 

Proteobakterien wurden schon in zahlreichen Arbeiten als die dominierenden Arten im 

marinen Milieu beschrieben (Gray & Herwig, 1996; Llobet-Brossa et al., 1998; Kim et al., 

2004; Köpke et al., 2005; Stevens et al., 2005), wobei der Elektronendonator in diesen 

Habitaten nicht limitiert ist. Die molekularbiologisch untersuchten Wattsedimente ab 160 cm 

Tiefe sind seit mehreren hundert Jahren vergraben (Ziehe, 2005) und das organische Material 

ist sehr refraktär (Freese & Rullkötter, 2003). Somit unterscheidet sich die Verfügbarkeit des 

Elektronendonators in mehreren Metern Tiefe gravierend von den Oberflächensedimenten 

oder der Wassersäule und stellt demnach einen limitierenden Faktor für die mikrobiellen 

Gemeinschaften dar. Sämtliche in dieser Arbeit gefundenen Sequenzen, die der Gruppe der 

Chloroflexi zugeordnet wurden, fallen in die Untereinheit 2. Diese Untereinheit setzt sich 

hauptsächlich aus Sequenzen zusammen, die in der „deep biosphere“ gefunden wurden 

(Chandler et al., 1998; Coolen et al., 2002; Inagaki et al., 2003). In diesen Habitaten ist das 

für die Mikroorganismen verfügbare organische Material in geringen Konzentrationen 

vorhanden und ebenfalls refraktär (Coolen et al., 2002; Webster et al., 2004; Parkes et al., 

2005). Der Elektronendonator beeinflusst somit entscheidend die bakteriellen Gemeinschaften 

im Watt wie auch in der „deep biosphere“. Sulfat oder andere Elektronenakzeptoren spielen 

dagegen für die Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaften nur eine untergeordnete 

Rolle, da sich die Zusammensetzungen der bakteriellen Gemeinschaften unabhängig von z. B. 

den Sulfatkonzentrationen signifikant ändern. 

Aus der Dominanz der Chloroflexi ergibt sich zwangsläufig die Frage, welche genauen 

physiologischen Eigenschaften sie befähigen, die angesprochenen extremen Lebensräume zu 

dominieren. Da bis zum jetzigen Zeitpunkt nur wenige Isolate vorliegen und aus dem 

Wattenmeer gänzlich fehlen, ist es nicht möglich eine genaue Antwort auf diese Frage zu 

geben. Die gefundenen Chloroflexi scheinen aber unabhängig vom Sulfat zu sein, da sie 

sowohl die Sedimentschichten dominieren in denen Sulfat noch vorhanden ist, als auch in 

jenen wo Sulfat unterhalb der Detektionsgrenze liegt. Wahrscheinlich übt vielmehr das 

refraktäre organische Material einen starken Einfluss auf das Vorkommen der Chloroflexi aus, 

70

DISKUSSION 

da ihre Dominanz erst mit steigender Sedimenttiefe beginnt. Zudem zeigt ein Vergleich von 

Isolaten der ersten drei Untereinheiten der Chloroflexi, dass sie während ihrer 

Stoffwechselprozesse entweder Wasserstoff produzieren oder benötigen. Das einzige 

bekannte Isolat der Untereinheit 1 Chloroflexi UNI-1 setzt Wasserstoff bei der Fermentation 

von Zuckern frei (Sekiguchi et al., 2001). Die anoxische Photosynthese betreibenden 

Chloroflexi der Untereinheit 3 (vormals GNSB) brauchen dagegen Wasserstoff als 

Elektronendonator (Madigan et al., 2003). Das einzige Isolat aus der Untereinheit 2 

Dehalococcoides ethenogenes 195 benötigt Wasserstoff bei der Degradation von 

Tetrachlorethen, ein ebenfalls sehr refraktäres Substrat (Seshadri et al., 2005). Die 

molekularbiologisch gefundenen Sequenzen (die sich der Klasse der Chloroflexi zuordnen 

ließen) zeigen zu dem Isolat D. ethenogenes 195 die größte Ähnlichkeit, und lassen vermuten, 

dass die gefundenen Organismen ebenfalls fermentieren und dabei Wasserstoff freisetzen. 

Dieser könnte in sulfathaltigen Schichten Sulfatreduzierern und in sulfatfreien Zonen den 

methanogenen Archaeen als Elektronendonator dienen. Abschließend lässt sich die Frage der 

physiologischen Eigenschaften von Chloroflexi in tieferen Sedimentschichten des Watts nicht 

eindeutig klären, da ohne Isolate Substratteste und weitere physiologische Untersuchungen 

nicht möglich sind. Dennoch hat diese Studie gezeigt, dass in der „subsurface“ und in der 

„deep biosphere“ die Verfügbarkeit und Qualität des Elektronendonators dazu führt, dass sich 

die Bakteriengemeinschaften in ihren Zusammensetzungen habitatübergreifend ähneln. 

Wattsedimente stellen auf einer sehr kleinen Tiefenskala eine Art Obergrenze dar und eignen 

sich somit als Modellstandort zur Untersuchung der "Tiefen Biosphäre". 

3.2 Vertikale Abfolge von Sulfatreduzierern und Methanogenen 

Die mittels real-time PCR erhaltenen Werte für funktionelle (dsr und mcr) und 16S rRNA 

Gene zeigten erhöhte Kopieanzahlen an den Sulfat-Methan-Übergangszonen. In diesen Zonen 

sind Methan- und Sulfatkonzentrationen gegenläufig, wofür die anaerobe Oxidation des 

Methans eine Ursache sein könnte (Iversen & Jorgensen, 1985). Der signifikante Zuwachs an 

detektierten Prokaryoten in diesen Übergangszonen deutet zudem auf eine erhöhte 

mikrobielle Aktivität hin. Solch erhöhte Gesamtzellzahlen wurden auch für andere marine 

Habitate gezeigt und mit einer erhöhten mikrobiellen Aktivität in Verbindung gebracht 

(Thomsen et al., 2001; Coolen et al., 2002; Parkes et al., 2005). 

71

DISKUSSION 

Die in dieser Arbeit detektierten methanogenen Archaeen gehören hauptsächlich zur 

Ordnung der Methanosarcinales. Darunter waren allerdings keine Archaeen der ANME 2 und 

3 Cluster, die mit der anaeroben Oxidation von Methan in Verbindung gebracht werden 

(Boetius et al., 2000). Vertreter des ANME 1 Clusters wurden ebenfalls nicht detektiert. Es ist 

allerdings nicht auszuschließen, dass Organismen aus den ANME Clustern in tieferen 

Sedimentschichten des Watts vorhanden sind. Bei der Untersuchung des 

Oberflächensedimentes eines nahe gelegenen Sandwatts (Ishii et al., 2004) wurden zwar 

Zellen des ANME Clusters mittels FISH detektiert, aber nur in sehr geringer Anzahl (ein 

Konsortium pro 5 10 4 Zellen). Da sie somit weniger als ein Prozent der Gesamtanzahl an 

Archaeen ausmachen, wären sie in der vorliegenden Studie mit den universellen Archaeen- 

Primern nicht detektiert worden. Ihre Abundanz wäre unterhalb der Nachweisgrenze der 

PCR-DGGE Methode (Murray et al., 1996). 

Die molekularbiologisch detektierten Sulfatreduzierer konnten hauptsächlich der Gattung 

Desulfotomaculum zugeordnet werden. Diese Bakterien stehen ebenfalls nicht direkt im 

Zusammenhang mit AOM. Die von Boetius et al. postulierten sulfatreduzierenden Mitglieder 

der Konsortien, die sich aus den Gattungen Desulfoccocus und Desulfosarcina zusammen 

setzen (Boetius et al., 2000; Orphan et al., 2002), wurden weder in den Sulfat-Methan- 

Übergangszonen noch in den Bereichen dazwischen nachgewiesen. Dennoch wurden 

sulfatreduzierende Prokaryoten und auch methanogene Archaeen in allen Sedimentschichten 

detektiert. In anderen Habitaten der „deep biosphere“, wo wahrscheinlich AOM stattfindet, 

wurden ebenfalls keine ANME gefunden (Parkes et al., 2005). Somit muss eine AOM nicht 

unbedingt auf die postulierten Organismen beschränkt sein. Zudem sind Alternativen zu 

einem Konsortium denkbar, da ein Intermediat bis jetzt nicht eindeutig bestimmt wurde 

(Valentine & Reeburgh, 2000; Sørensen et al., 2001; Nauhaus et al., 2002). Auch wäre die 

Möglichkeit denkbar, dass ein einzelnes Archaeon alleine fähig wäre, beide Reaktionen 

durchzuführen. 

3.3 Detektion eines neues Clusters innerhalb der Euryarchaeota 

Der Einsatz eines Eukaryoten-spezifischen Primer-Paares in Wattenmeersedimenten (Diez 

et al., 2001) ermöglichte die Detektion des „Tidal flat cluster 1“. Es handelt sich dabei um ein 

neues Cluster innerhalb der Euryarchaeota (Abb. 3). 

72

DISKUSSION 

Euryarchaeota 

Thermoplasmatales 

Archaeoglobales 

TF1cluster 

360NF51E 

360NS49E 

360NS47E 

280NJ33E 

180NS20E 280NJ34E 

180NJ18E 

Methanosarcinales DHVE1 

ARC1 

Methanococcales 

Thermococcales 

Nanoarchaeota 

Crenarchaeota 

Methanomicrobiales 

ANME2 

Ricecluster1 

DHVE3 

Halobacteriales 

Methanobacteriales 

Bacteria Eukarya 

Korarchaeota 

AAG 

Abb. 3: Phylogenetische Einordnung des TF1-Clusters innerhalb der Euryarchaeota. Die 

erste Zahl gibt die Sedimenttiefe an, in der die Sequenzen detektiert wurde. 

Das TF1-Cluster wurde somit mit einer Primer-Kombination detektiert, die bis jetzt nicht in 

tieferen Sedimenten eingesetzt wurde und auch Archaeen nicht detektieren sollte. Die 

Detektion dieses Clusters ab einer Tiefe von 160 cm und die Verschiebung der dominierenden 

Bakterien zu den Chloroflexi auch unterhalb dieser Tiefe könnte ein Hinweis sein, dass der 

Elektronendonator ebenfalls eine wichtige Rolle bei diesen Archaeen spielt. 

Eine 100 %ig genaue phylogenetische Einordnung der gefundenen Sequenzen ist nicht 

möglich gewesen, da diese von DGGE Banden abgeleitet wurden, deren Fragmentlänge 

etwa 450 bp war. Die momentane Einordnung des Clusters in das Phylum der Euryarchaeota 

lässt die Vermutung zu, dass es sich ebenfalls um methanogene Archaeen handeln könnte, da 

der Großteil der Euryarchaeota und auch die nächsten Verwandten des TF1-Clusters 

methanogene Archaeen sind (Garcia et al., 2000). Die einzig molekularbiologische Detektion 

dieses neuen Clusters lässt aber keine weiteren physiologischen Vermutungen über die 

gefundenen Organismen zu. Ein ähnliches ungewöhnliches Ergebnis beim Einsatz von 

Eukaryoten-spezifischen Primern ist auch von Schippers und Neretin beschrieben worden 

(Schippers & Neretin, 2006). Sie erhielten bei ihren Untersuchungen von Ozeansedimenten 

des Kontinentalrandes vor Peru zusätzlich zu PCR-Amplikons der erwarteten Länge kürzere, 

73

DISKUSSION 

aber nicht näher untersuchte PCR Fragmente. Dieser Sachverhalt wurde als eine Degradation 

der DNA interpretiert. Die in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Amplifikate zeigten für das 

TF1-Cluster eine um 50 bp kürzere weitere Bande in den Agarosegelen, die sich als 

Sequenzen des TF1-Clusters erwiesen. 

Die molekularbiologischen Untersuchungen werfen aber auch die Frage auf, ob die 

molekularbiologische Analyse der funktionellen Gene (dsr und auch mcr) in der Lage waren, 

mit zunehmender Tiefe die funktionellen Gene noch adäquat zu detektieren. Mutationen 

innerhalb der Primer-Bindungsstellen der untersuchten Gene könnten eine Amplifikation 

verhindert haben. Damit würde eine deutliche Unterschätzung der erhaltenen Kopiezahlen für 

dsr und mcr mit einher gehen. Das es zu Anpassungen an das Habitat und Mutationen sogar 

auf Genomebene kommen kann, wurde schon mittels DNA-DNA Hybridisierung für 

Bakterien aus einem Frischwasser-Habitat gezeigt, wo mehrere Isolate eine hohe Homologie 

des 16S rRNA Gens aufzeigen, aber eine große Diversität bei der Hybridisierung zeigten 

(Jaspers & Overmann, 2004). Somit kann es mit zunehmender Tiefe im Watt zu einer 

Anpassung auf genomischer Ebene gekommen sein, was auch das Fehlen von erhöhten 

Kopieanzahlen in der untersten Sulfat-Methan-Übergangszone erklären könnte. 

3.4 Ausblick 

Um diese Arbeit weiterzuführen, sollte das für die Prokaryoten verfügbare organische 

Material näher untersucht werden. Über diesen Erkenntnisgewinn könnten Vermutungen über 

die Stoffwechselaktivitäten und eventuell auch Bilanzierungen getroffen werden. Da es sich 

beim organischen Material um refraktäres Material handelt, wird es hauptsächlich von 

fermentativ lebenden Organismen verwertet. Mittels einer detaillierten Bestimmung der 

vorhanden C-Quellen könnten somit die dominierenden Stoffwechselwege der Gärer 

postuliert werden, was eventuell ein Primer-design für die so eingegrenzten Bakterienarten 

ermöglichen könnte. Sich mittels molekularbiologischer Methoden einen Überblick über diese 

nicht unbedeutende Gruppe von Mikroorganismen zu verschaffen (Schink, 2002), könnte 

weitere Rückschlüsse über die „subsurface“ von Wattensedimenten liefern. Da eine 

Kultivierung dieser Organismen problematisch zu sein scheint (Köpke et al., 2005), würde 

eine molekularbiologische Untersuchung hier ein adäquates Mittel sein, diese Gruppe näher 

zu untersuchen. Dennoch wird eine Detektion mittels DGGE oder anderen 

molekularbiologischen Methoden ebenfalls schwierig sein (Nachweisgrenze 1 %, [Murray et 

74

DISKUSSION 

al., 1996]), da eine hohe Diversität vermutet wird und somit nur eine geringe Anzahl an 

Organismen einer Art vorhanden sein werden. Dennoch könnten diese Untersuchungen 

wichtige Erkenntnisse im Stoffkreislauf der „subsurface“ des Wattenmeeres liefern. 

Des weiteren sollte versucht werden, Vertreter der Chloroflexi zu isolieren, um mehr 

Informationen über die physiologischen Eigenschaften dieses abundanten Vertreters zu 

erhalten. Der mögliche Zusammenhang dieser Organismen als potentielle Produzenten von 

Wasserstoff könnte einen entscheidenden Einfluss auf das Wachstum von Sulfatreduzierern 

und auch Methanogenen haben. Eine Quantifizierung der Chloroflexi mittels real-time PCR 

würde eine Bilanzierung ermöglichen, die dann im Zusammenhang mit Sulfatreduktionsraten 

und Methanbildungsraten ein umfangreicheres Bild des Habitates liefern könnte. 

Ein weiterer Punkt wäre die Untersuchung des neu detektierten TF1-Clusters. Neben dem 

Versuch einer Isolierung wäre die Entwicklung von spezifischen Primern über die momentan 

vorhanden Sequenzen möglich. Dadurch wären genauere phylogenetische Einordnungen 

möglich. Zudem könnten diese Stammbaumberechnungen Aussagen über ihre evolutionäre 

Einordnung liefern, da sie eventuell größere Gemeinsamkeiten auf der 16S rRNA Gen-Ebene 

mit Eukaryoten aufweisen als andere Archaeen. Eine mögliche Detektion von weiteren TF1- 

Sequenzen durch den Einsatz von spezifischen Primern in anderen Habitaten der „deep 

biosphere“ könnte dagegen den Sachverhalt untermauern, dass das Watt die Obergrenze 

dieser Habitate darstellt und sich als Modellstandort zur Untersuchung der „Tiefen Biosphäre“ 

eignet. 

3.5 Literatur 

Boetius, A., Ravenschlag, K., Schubert, C.J., Rickert, D., Widdel, F., Gieseke, A. et al. (2000) 

A marine microbial consortium apparently mediating anaerobic oxidation of methane. 

Nature 407: 623-626. 

Chandler, D.P., Brockman, F.J., Bailey, T.J., and Fredrickson, J.K. (1998) Phylogenetic 

diversity of archaea and bacteria in a deep subsurface Paleosol. Microbial Ecol. 36: 

37-50. 

Coolen, M.J.L., Cypionka, H., Sass, A.M., Sass, H., and Overmann, J. (2002) Ongoing 

modification of Mediterranean Pleistocene sapropels mediated by prokaryotes. Science 

296: 2407-2410. 

75

DISKUSSION 

Diez, B., Pedros-Alio, C., Marsh, T.L., and Massana, R. (2001) Application of denaturing 

gradient gel electrophoresis (DGGE) to study the diversity of marine picoeukaryotic 

assemblages and comparison of DGGE with other molecular techniques. Appl. 

Environ. Microbiol. 67: 2942-2951. 

Freese, E., and Rullkötter, J. (2003) Characterisation of organic matter in sediments from the 

Wadden Sea of the German Bight. Ber. Forschungszentrum Terramare 12: 57-58. 

Garcia, J.-L., Patel, B.K.C., and Ollivier, B. (2000) Taxonomic, phylogenetic, and ecological 

diversity of methanogenic archaea. Anaerobe 6: 205-226. 

Gray, J.P., and Herwig, R.P. (1996) Phylogenetic analysis of the bacterial communities in 

marine sediments. Appl. Environ. Microbiol. 62: 4049-4059. 

Inagaki, F., Suzuki, M., Takai, K., Oida, H., Sakamoto, T., Aoki, K. et al. (2003) Microbial 

communities associated with geological horizons in coastal subseafloor sediments 

from the sea of Okhotsk. Appl. Environ. Microbiol. 69: 7224-7235. 

Ishii, K., Mußmann, M., MacGregor, B.J., and Amann, R. (2004) An improved fluorescence 

in situ hybridization protocol for the identification of bacteria and archaea in marine 

sediments. FEMS Microbiol. Ecol. 50: 203-212. 

Iversen, N., and Jorgensen, B.B. (1985) Anaerobic methane oxidation rates at the sulfatemethane 

transition in marine sediments from Kattegat and Skagerrak (Denmark). 

Limnol. Oceanogr. 30: 944-955. 

Jaspers, E., and Overmann, J. (2004) Ecological significance of microdiversity: Identical 

16S rRNA gene sequences can be found in bacteria with highly divergent genomes 

and ecophysiologies. Appl. Environ. Microbiol. 70: 4831-4839. 

Kim, B.-S., Oh, H.-M., Kang, H., Park, S.-S., and Chun, J. (2004) Remarkable bacterial 

diversity in the tidal flat sediment as revealed by 16S rDNA analysis. J. Microbiol. 

Biotechnol. 14: 205-211. 

Köpke, B., Wilms, R., Engelen, B., Cypionka, H., and Sass, H. (2005) Microbial diversity in 

coastal subsurface sediments: A cultivation approach using various electron acceptors 

and substrate gradients. Appl. Environ. Microbiol. 71: 7819-7830. 

Llobet-Brossa, E., Rossello-Mora, R., and Amann, R. (1998) Microbial community 

composition of Wadden Sea sediments as revealed by fluorescence in situ 

hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 64: 2691-2696. 

Madigan, M.T., Martinko, J.M., and Parker, J. (2003) Brock. Biology of Microorganisms. 

Pearson Education, Inc. Upper Saddle River, NJ 07458 10th ed. 

76

DISKUSSION 

Murray, A.E., Hollibaugh, J.T., and Orrego, C. (1996) Phylogenetic compositions of 

bacterioplankton from two California estuaries compared by denaturing gradient gel 

electrophoresis of 16S rDNA fragments. Appl. Environ. Microbiol. 62: 2676-2680. 

Nauhaus, K., Boetius, A., Kruger, M., and Widdel, F. (2002) In vitro demonstration of 

anaerobic oxidation of methane coupled to sulphate reduction in sediment from a 

marine gas hydrate area. Environ. Microbiol. 4: 296-305. 

Orphan, V.J., House, C.H., Hinrichs, K.-U., McKeegan, K.D., and DeLong, E.F. (2002) 

Multiple archaeal groups mediate methane oxidation in anoxic cold seep sediments. 

Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 7663-7668. 

Parkes, R.J., Webster, G., Cragg, B.A., Weightman, A.J., Newberry, C.J., Ferdelman, T.G. 

et al. (2005) Deep sub-seafloor prokaryotes stimulated at interfaces over geological 

time. Nature 436: 390-394. 

Schink, B. (2002) Synergistic interactions in the microbial world. Antonie van Leeuwenhoek 

81: 257-261. 

Schippers, A., and Neretin, L.N. (2006) Quantification of microbial communities in nearsurface 

and deeply buried marine sediments on the Peru continental margin using realtime 

PCR. Environ. Microbiol. 8: 1251-1260. 

Sekiguchi, Y., Takahashi, H., Kamagata, Y., Ohashi, A., and Harada, H. (2001) In situ 

detection, isolation, and physiological properties of a thin filamentous microorganism 

abundant in methanogenic granular sludges: A novel isolate affiliated with a clone 

cluster, the green non-sulfur bacteria, subdivision I. Appl. Environ. Microbiol. 67: 

5740-5749. 

Seshadri, R., Adrian, L., Fouts, D.E., Eisen, J.A., Phillippy, A.M., Methe, B.A. et al. (2005) 

Genome sequence of the PCE-dechlorinating bacterium Dehalococcoides 

ethenogenes. Science 307: 105-108. 

Sørensen, K.B., Finster, K., and Ramsing, N.B. (2001) Thermodynamic and kinetic 

requirements in anaerobic methane oxidizing consortia exclude hydrogen, acetate, and 

methanol as possible electron shuttles. Microbial Ecol. 42: 1-10. 

Stevens, H., Brinkhoff, T., and Simon, M. (2005) Composition of free-living, aggregate- and 

sediment surface-associatd bacterial communities in the German Wadden Sea. Aquat. 

Microb. Ecol. 38: 15-30. 

Thomsen, T.R., Finster, K., and Ramsing, N.B. (2001) Biogeochemical and molecular 


Microbiol. 67: 1646-1656. 

77

DISKUSSION 

Valentine, D.L., and Reeburgh, W.S. (2000) New perspectives on anaerobic methane 

oxidation. Environ. Microbiol. 2: 477-484. 

Webster, G., Parkes, R.J., Fry, J.C., and Weightman, A.J. (2004) Widespread occurrence of a 

novel division of bacteria identified by 16S rRNA gene sequences originally found in 

deep marine sediments. Appl. Environ. Microbiol. 70: 5708-5713. 

Ziehe, D. (2005) Datierung von biogenen Carbonaten mit Aminosäurenantiomerenverhältnissen. 

Diplomarbeit an der Carl von Ossietzky Universität Oldenburg, 

Fakultät V. 

78

DANKSAGUNG 

Danksagung 

Ich möchte mich herzlichst bei Herrn Prof. Dr. Heribert Cypionka für die Bereitstellung und 

der Möglichkeit zur Bearbeitung des äußerst interessanten Themas und auch für das 

entgegengebrachte Vertrauen und die dargebrachte Unterstützung bedanken. Bei Herrn Prof. 

Dr. Ralf Rabus bedanke ich mich für die Übernahme der Zweitgutachtertätigkeit. Auch Herrn 

Prof. Dr. Meinhard Simon danke ich für seine Tätigkeit im Prüfungskomitee. 

Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Dr. Bert Engelen für die umfangreiche Einführung in 

die Techniken der Molekularbiologie und für die aufgebrachte Zeit um das Beste aus den 

Ergebnissen herauszuholen und damit äußerst gute Publikationen zu verfassen. Bert, Danke 

für alles! 

Außerdem danke ich Herrn Dr. Henrik Sass für die umfangreichen Einblicke in die „Welt der 

Bakterien“ und hier nicht nur in die „Welt der Kultivierung“, sondern auch in die „Welt der 

Physiologie“. Zudem danke ich ihm für seinen Einsatz bei der Erstellung der Publikationen 

und auch dem Geraderücken von Interpretationen einiger Ergebnisse. 

Für die Hilfe und den Einsatz bei den Probenahmen danke ich den Mitarbeitern vom 

Senckenberg Institut, des Terramare Wilhelmshaven und der Besatzung des Forschungskutter 

„Senkenberg“ undenkbar waren, danke ich auch der Crew der FK „Senckenberg“. Hierbei 

besonders Alexander Bartholomae, Tae Soo Chang, Elke Tilch und Helmo Nicolai für die 

geologischen Ratschläge und logistischen und menschlichen Unterstützungen bei den 

diversen Probenahmen. 

Vielen Dank an alle Arbeitsgruppen des ICBMs und dessen Mitarbeitern für die vielseitigen 

Hilfestellungen und Gespräche während die letzten Jahre. Besonderen Dank sei natürlich den 

Leuten der Arbeitsgruppen „Cypionka“ und auch „Simon“ ausgesprochen, die bei 

Diskussionen der Ergebnisse mit Rat und Tat täglich zur Verfügung standen. Besonders 

hervor heben möchte ich dabei: Beate Köpke für die gemeinsame Zeit, die wir an einem 

schönen Projekt verbracht haben und für die guten Diskussionen und vielen Anregungen. 

Willm Martens-Habbena für Hilfestellungen wo immer Probleme auftraten. Andrea 

Schlingloff für das Überlassen ihres Wissen bei der Sequenzierung. Jacqueline Süß für das 

ständige Verbessern der real-time Technik. Melanie Beck, Thorsten Brinkhoff, Yvonne

DANKSAGUNG 

Hilker, Martin Könneke, Jürgen Köster und Falko Mathes für die Einführungen in neue 

Techniken, für fruchtbare Diskussionen und Hilfestellungen bei Problemen. Und auch allen 

weiteren nicht namentlich Erwähnten und doch nicht Vergessenen, die während der letzten 

Jahre kamen und gingen und immer für eine positive Stimmung im Labor und Institut sorgten. 

Dann möchte ich meiner Freundin Sandra Heckelmann für die ununterbrochene und liebe 

Unterstützung während der letzten Monate danken. Meinem Sohn Jonas danke ich für das 

freundliche Lächeln, mit dem ich jeden Abend begrüßt werde. Und nicht zuletzt sei auch 

meinen Eltern aufs herzlichste gedankt, auf deren Unterstützung ich mich immer verlassen 

konnte und kann und die mir damit die Möglichkeit gaben diese Arbeit durchzuführen und 

fertig zu stellen. 

Der Deutschen Forschungsgemeinschaft gilt mein Dank für die finanzielle Unterstützung, 

ohne die dieses Projekt ebenfalls nicht zustande gekommen wäre. 

Abschließend möchte ich mich noch bei allen bedanken, die bisher nicht namentlich erwähnt 

wurden und die auf die eine oder andere Weise zur Fertigstellung dieser Arbeit beigetragen 

haben.

LEBENSLAUF 

LEBENSLAUF 

ANGABEN ZUR PERSON 

Name: 

WILMS, Manfred Reinhard Werner Hartmud 

Adresse: 

Zur Kalkkaute 21, 35041 Marburg 

Staatsangehörigkeit: Deutsch 

Geburtsdatum: 24. 03. 1972 

Geburtsort: Wilhelmshaven 

SCHUL- UND BERUFSBILDUNG 

Ab 04.2006 

Angestellt bei Novartis Vaccines and Diagnostics GmbH & Co. KG 

09. 2001- 11. 2006 Promotion am Institut für Chemie und Biologie des Meeres (ICBM) der 

Carl von Ossietzky Universität Oldenburg in der Arbeitsgruppe 

Paläomikrobiologie bei Prof. Dr. HERIBERT CYPIONKA. Titel der 

Dissertation: „Molekularbiologische Erfassung und Charakterisierung 

der mikrobiellen Gemeinschaften im Rückseitenwatt der Insel 

Spiekeroog“. 

10. 1995 - 08. 2001 Studium der Biologie an der Carl von Ossietzky Universität Oldenburg 

Studienschwerpunkte: Mikrobiologie, Genetik, Biochemie 

09. 1997 Vordiplom 

08. 2001 Diplom 

Thema der Diplomarbeit bei H. Doz. Dr. LUISE BERTHE-CORTI: 

„Versuche zum Nachweis und zur Isolierung von Alkan- 

Monooxygenasen in Fundibacter jadensis.“ 

10. 1995 - 09. 1996 Studium der Mathematik an der Carl von Ossietzky Universität 

Oldenburg 

10. 1994 - 09. 1995 Studium der Interkulturellen Pädagogik an der Carl von Ossietzky 

Universität Oldenburg 

11. 1992 - 01. 1994 Zivildienst bei der Gesellschaft für Paritätische Sozialarbeit mbH, in 

Wilhelmshaven 

08. 1984 - 06. 1992 Mariengymnasium, Jever 

Erworbene Qualifikation: Abitur

Erklärung 

Hiermit bestätige ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig verfasst und nur die 

angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. 

Marburg, den 25. August 2006

von Herrn Reinhard Wilms - ICBM

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