Regulationsmechanismen von Oxacillinresistenz und Biofilmbildung ...

Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. med. W. Solbach
Regulationsmechanismen von Oxacillinresistenz und
Biofilmbildung: Generierung und Charakterisierung
von Deletionsmutanten des σ B Operons in
Staphylococcus epidermidis
Inauguraldissertation
zur
Erlangung der Doktorwürde
der Universität zu Lübeck
- Aus der Medizinischen Fakultät -
vorgelegt von
Sebastian Jäger
aus Hamburg
Lübeck 2006

1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. J. K.-M. Knobloch
2. Berichterstatterin: Prof. Dr. rer. nat. Christine Zühlke
Tag der mündlichen Prüfung: 02.11.2007
Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 02.11.2007
gez. Prof. Dr. med. Werner Solbach
- Dekan der Medizinischen Fakultät -

Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ................................................................................4
1.1 Das Genus Staphylococcus.............................................................. 4
1.2 Infektionen durch Koagulase-negative Staphylokokken ................ 5
1.3 Biofilmbildung von S. epidermidis ................................................. 7
1.3.1 Primäre Adhäsion ..................................................................................... 8
1.3.2 Akkumulative Phase der Biofilmbildung ............................................... 10
1.4 Regulation der Biofilmbildung......................................................12
1.5 Voraussetzungen für diese Arbeit .................................................18
1.6 Fragestellung .................................................................................19
2 Material und Methoden .........................................................20
2.1 Material..........................................................................................20
2.1.1 Geräte...................................................................................................... 20
2.1.2 Chemikalien, Plastik- und Einwegartikel ............................................... 21
2.1.3 Puffer und Lösungen............................................................................... 21
2.1.4 Nährmedien............................................................................................. 22
2.1.5 Antibiotika .............................................................................................. 24
2.1.6 Enzyme ................................................................................................... 24
2.1.7 Bezugsquellen für verwendete Reagenziensets ...................................... 24
2.1.8 Oligonukleotide ...................................................................................... 25
2.1.9 Plasmide.................................................................................................. 27
2.1.10 Organismen............................................................................................. 28
2.1.11 Datenbanken und Programme................................................................. 29
2.2 Methoden.......................................................................................29
2.2.1 Anzuchtbedingungen .............................................................................. 29
2.2.2 Quantifizierung der Biofilmbildung ....................................................... 29
2.2.3 Immunfluoreszenztest zur Identifikation von PIA.................................. 30
2.2.4 Populationsanalyse der Oxacillin Resistenz ........................................... 31
2.2.5 Präparation chromosomaler DNA aus S. epidermidis ............................ 31
2.2.6 Polymerasekettenreaktion (PCR)............................................................ 32
2.2.7 Klonierung .............................................................................................. 33

Inhaltsverzeichnis 2
2.2.8 Plasmidpräparation aus E. coli und Staphylokokken.............................. 33
2.2.9 Restriktionsverdau von Plasmid DNA.................................................... 34
2.2.10 Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA....................................... 34
2.2.11 Extraktion von DNA Fragmenten aus Agarosegelen ............................. 35
2.2.12 Ligation................................................................................................... 35
2.2.13 Elektroporation von E. coli..................................................................... 36
2.2.14 Elektroporation von Staphylokokken ..................................................... 37
2.2.15 Herstellung von Phagenlysaten............................................................... 37
2.2.16 Phagentransduktion................................................................................. 38
2.2.17 Homologer Genaustausch in S. epidermidis........................................... 39
2.2.18 Sequenzierung von DNA........................................................................ 42
2.2.19 Präparation von RNA aus S. epidermidis ............................................... 42
2.2.20 Herstellung Digoxigenin markierter Sonden .......................................... 44
2.2.21 Elektrophorese von RNA in denaturierenden Agarosegelen.................. 44
2.2.22 Transkriptionsanalyse mittels Northern Blot.......................................... 45
2.2.23 DNase Verdau und cDNA Synthese....................................................... 46
2.2.24 Quantitative Transkriptionsanalyse durch real time PCR ...................... 46
3 Ergebnisse .............................................................................48
3.1 Etablierung der Deletionsmutanten in S. epidermidis...................48
3.1.1 Generierung definierter Mutanten im σ B Operon ................................... 48
3.1.2 Transkription von erm und sigB in den Mutanten .................................. 51
3.1.3 Putativ σ B abhängiger Promotor vor rsbV .............................................. 53
3.1.4 σ B -Aktivität in den Deletionsmutanten von S. epidermidis 1457........... 54
3.2 Regulation der Biofilmbildung durch σ B ......................................57
3.2.1 Biofilmbildung der Mutanten des σ B Operons in S. epidermidis 1457 .. 57
3.2.2 Evaluation der PIA Synthese der Deletionsmutanten mittels IFT.......... 60
3.2.3 Transkriptionelle Regulation in S. epidermidis 1457 ............................. 63
3.2.4 Transduktion in unabhängige genetische Hintergründe ......................... 65
3.2.5 Evaluation der sarA Transkription in den Deletionsmutanten................ 72
3.2.6 Transkriptionsanalyse unter Induktion mit Ethanol................................ 74
3.3 Regulation der Biofilmbildung in S. epidermidis M12.................75
3.4 Expression der Oxacillinresistenz in den Deletionsmutanten.......77

Inhaltsverzeichnis 3
4 Diskussion .............................................................................79
4.1 Etablierung der Deletionsmutanten des σ B Operons.....................79
4.2 Regulation der Biofilmbildung durch σ B ......................................82
4.2.1 Untersuchung der σ B -Aktivität in S. epidermidis 1457 .......................... 82
4.2.2 Transduktion in unabhängige genetische Hintergründe ......................... 84
4.2.3 Einfluss von σ B auf die icaADBC Transkription.................................... 86
4.3 Regulation der Biofilmbildung durch barAB................................89
4.4 Einfluss von σ B auf die Oxacillinresistenz....................................92
5 Zusammenfassung .................................................................94
6 Literaturverzeichnis...............................................................96
7 Abkürzungsverzeichnis .......................................................121
8 Danksagung.........................................................................122
9 Lebenslauf und Publikationsverzeichnis .............................123

1 Einleitung 4
1 Einleitung
1.1 Das Genus Staphylococcus
Staphylokokken sind 0,5 bis 1,5 µm große, grampositive, haufenförmig wachsende,
fakultativ anaerobe, unbewegliche, nicht sporenbildende Kokkenbakterien, welche eine
Katalase-Aktivität besitzen. Typische Habitate von Staphylokokken sind die Haut, die
Hautanhangsdrüsen, sowie die Schleimhäute vieler Säugetierarten 193, 194 . Das Genus
Staphylococcus gehört neben den Gattungen Micrococcus, Planococcus und Stomatococcus
zur Familie der Micrococcaceae 233 . Innerhalb dieser Familie werden große
Unterschiede zwischen den einzelnen Gattungen bezüglich des G/C-Gehalts der
chromosomalen DNA beobachtet. Hierbei besitzen die Gattungen Staphylococcus und
Planococcus einen relativ niedrigen G/C-Gehalt von 30 bis 39 %, wohingegen die
Gattungen Micrococcus und Stomatococcus einen G/C-Gehalt von 66 bis 77 %
aufweisen 141, 285 .
Mit Hilfe einer Vielzahl von Methoden können innerhalb der Gattung die verschiedenen
Staphylokokkenspezies und Subspezies differenziert werden. Dieses erfolgt durch
Beurteilung der Koloniemorphologie, des Antibiogramms, der spezifischen Enzymausstattung
und der Fähigkeit zur Säurebildung aus verschiedenen Zuckern. Zusätzlich
wird eine eingehendere Differenzierung durch die chemischen Analysen der Aminosäurezusammensetzung
der Interpeptidbrücken des Peptidoglycans, der Teichonsäuren
der Zellwand sowie der zellulären Fettsäurekomponenten ermöglicht. Außerdem kann
durch gentechnische Methoden zum Nachweis von speziesspezifischen DNA-
Sequenzen eine weitere Differenzierung erreicht werden. Zur Zeit können mit diesen
Methoden 43 Staphylokokkenspezies unterschieden werden, von denen einige noch auf
53, 142, 144,
Subspeziesebene differenziert werden, so dass insgesamt 64 Taxa bekannt sind
162, 199, 209, 211, 250, 252, 258, 267 .
Durch den Nachweis der Prothrombin-aktivierenden Koagulase werden die beim
Menschen vorkommenden Staphylokokken in Koagulase-positive und Koagulasenegative
Staphylokokken (KNS) unterteilt 249 . Die einzige bekannte Koagulase-positive
Spezies mit human-pathogener Relevanz ist Staphylococcus aureus. Ein Teil der
Koagulase-negativen Staphylokokken können typischerweise als residente oder
temporär residente Hautflora beim Menschen isoliert werden. Dabei weisen einige
Spezies eine deutliche Präferenz bezüglich der besiedelten Körperregion auf. So wird

1 Einleitung 5
Staphylococcus capitis fast ausschließlich auf der behaarten Kopfhaut isoliert, während
Staphylococcus auricularis im äußeren Gehörgang und Staphylococcus haemolyticus
sowie Staphylococcus hominis vornehmlich im Bereich der apokrinen Schweißdrüsen
gefunden werden. Andere Spezies werden ubiquitär auf der Körperoberfläche isoliert,
wobei Staphylococcus epidermidis die am häufigsten isolierte Spezies darstellt 140, 143 .
1.2 Infektionen durch Koagulase-negative Staphylokokken
Das human-pathogene Potential von S. aureus ist schon lange bekannt. S. aureus ist
verantwortlich für eine Vielzahl von unterschiedlichen Erkrankungen von Furunkeln
über Wundinfektionen, nekrotisierende Pneumonien und Entzündungen des Pharynx bis
hin zur Sepsis 253 . Als Toxinbildner ist S. aureus verantwortlich für Lebensmittelinfektionen,
das Staphylococcal Scalded Skin Syndrom, sowie das Toxic-Schock-
Syndrom 212, 253 . Mit der Ausnahme von S. saprophyticus, der seit langem als Erreger
von Harnwegsinfektionen 276 bekannt ist, wurden Koagulase-negative Staphylokokken
lange Zeit als nicht human-pathogen eingestuft. Erste Beschreibungen Koagulasenegativer
Staphylokokken als Verursacher nosokomialer Infektionen finden sich in den
50er Jahren des zwanzigsten Jahrhunderts 52, 155, 248 . Jedoch vergingen noch zwei
Jahrzehnte bevor die herausragende Rolle Koagulase-negativer Staphylokokken als
Erreger nosokomialer Infektionen allgemein akzeptiert wurde 81, 94, 246 . In einer Studie
des National Nosocomial Infections Surveillance System (NNIS), welche in den U.S.A.
während der 70er Jahre durchgeführt wurde, konnte S. epidermidis in weniger als 4 %
der Fälle als Ursache einer nosokomialen Infektion gefunden werden und war somit
lediglich der achthäufigste Erreger 32 . Parallel zu dem vermehrten Einsatz
implantierbarer medizinischer Fremdkörper wurde in den folgenden Dezennien ein
kontinuierlicher Anstieg der Infektionen durch Koagulase-negative Staphylokokken
beobachtet. Eine Surveillance Studie des NNIS auf Intensivstationen in einem Zeitraum
von 1992 – 1998 zeigte, dass Koagulase-negative Staphylokokken bei Fremdkörperassoziierter
Septikämie, die mit Abstand am häufigsten isolierten Pathogene (39 %)
darstellten 16, 219 . Weiterhin konnte für postchirurgische Wundinfektionen gezeigt
werden, dass Koagulase-negative Staphylokokken nach S. aureus die zweithäufigsten
Verursacher dieser Infektionen sind 127 . Dieses ist sowohl von medizinischem als auch
von volkswirtschaftlichem Interesse, da die beschriebenen Infektionen zu einer

1 Einleitung 6
180, 225,
beträchtlich gesteigerten Morbidität und Mortalität betroffener Patienten führen
254 .
Den Ausgangspunkt Fremdkörper-assoziierter Septikämien stellen im Allgemeinen
therapeutisch in den Blutkreislauf implantierte Fremdkörper, wie etwa peripher- und
zentralvenöse Katheter, pulmonal- und sonstige arterielle Katheter, subkutan implantierte
Portsysteme und Herzschrittmacher dar 6, 8, 72, 96, 181, 207, 213, 214 . Hierbei erfolgt die
Besiedelung des Fremdkörpers mit dem Erreger durch Kontamination mit der Hautflora
des Patienten oder des Operateurs während der interventionellen Maßnahme. Weiterhin
kann eine Besiedelung auch per continuitatem über die Eintrittsstelle des Katheters oder
durch eine transiente Bakteriämie erfolgen 143 . Seltener werden Infektionen von Fremdkörpern
beobachtet, die als funktioneller Ersatz in den Blutkreislauf eingebracht
werden, wie künstliche Herzklappen oder Gefäßprothesen. Im Falle einer Besiedelung
können Koagulase-negative Staphylokokken aber auch hier Septikämien und Endokarditiden
verursachen 15, 36, 55, 64, 120, 135, 167, 196, 284 . In seltenen Fällen kann es bei
Patienten mit einer spezifischen oder unspezifischen Immunkompromittierung, wie zum
Beispiel im Rahmen einer Chemotherapie, einer Knochenmarkstransplantation, eines
Tumorleidens, schwerer Verbrennungen, Traumata oder einer HIV-Infektion, unabhängig
von implantierten Fremdkörpern zur Septikämie mit Koagulase-negativen
Staphylokokken kommen 21, 95, 112, 275, 287 . Von besonderer Signifikanz ist dies für Frühgeborene
auf neonatologischen Intensivstationen, da es bei ihnen häufig zu Septikämien
mit Koagulase-negativen Staphylokokken, verbunden mit einer erhöhten Mortalität
kommt 37, 58, 78, 84, 126, 190, 195, 234, 245 .
In der Mehrzahl der genannten Fremdkörper-assoziierten Infektionen mit Koagulasenegativen
Staphylokokken wird die Spezies S. epidermidis isoliert (74 – 92 %), jedoch
wurden auch durch S. capitis, S. caprae, S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis,
134, 143, 164, 180, 225, 244, 247,
S. simulans und S. warneri verursachte Infektionen beschrieben 265 . Bei postchirurgischen Wundinfektionen ist S. epidermidis ebenfalls die am
häufigsten isolierte Spezies unter den Koagulase-negativen Staphylokokken, es wurden
17, 145, 244, 261,
jedoch auch S. caprae, S. lugdunensis und S. schleiferi als Erreger isoliert 262 . In mehreren Studien wurden Koagulase-negative Staphylokokken als die häufigsten
Verursacher von Infektionen künstlicher Gelenkprothesen identifiziert. S. epidermidis
war hier ebenfalls die am häufigsten isolierte Spezies 35, 38, 75, 76, 118, 210 . Infektionen mit
Koagulase-negativen Staphylokokken werden auch bei Kathetern beobachtet, die nicht
in den Blutkreislauf eingebracht werden, wie etwa Katheter zur chronisch ambulanten

1 Einleitung 7
Peritonealdialyse (CAPD) 19, 25, 66, 208, 223, 263, 283 und ventrikulo-peritoneale Shuntsysteme
zur Senkung des Hirndruckes 29, 87, 218, 235, 251, 291 .
Die Diagnostik einer Fremdkörper-assoziierten Infektion ist problematisch, da 75 –
90 % der isolierten Koagulase-negativen Staphylokokken lediglich als Kontaminanten
zu werten sind 73, 111, 139, 220, 280 . In der Klinik stellen diese Infektionen ein wachsendes
Problem dar, da in den letzten Jahren vermehrt Stämme mit multiplen Antibiotika-
Resistenzen, insbesondere gegen β-Lactam-Antibiotika gefunden wurden 13, 83, 100 .
Außerdem können Fremdkörper-assoziierte Infektionen häufig nicht erfolgreich antibiotisch
saniert werden, selbst wenn der Erreger in vitro sensibel erscheint, so dass als
Therapieoption nur die Entfernung des entsprechenden Fremdkörpers bleibt 50, 54, 98, 291 .
Neben der gezeigten Signifikanz für die Humanmedizin sind einige Staphylokokkenspezies
ebenfalls von immanenter Bedeutung für die Veterinärmedizin, zum Beispiel
verursachen sie als Erreger von Mastitiden bei Milchkühen einen beträchtlichen volkswirtschaftlichen
Schaden 184, 185, 224, 293 .
1.3 Biofilmbildung von S. epidermidis
Biofilmbildung ist ein in der Umwelt weit verbreitetes Phänomen und bezeichnet eine
Gemeinschaft von Mikroorganismen, die an eine Oberfläche adhäriert und
akkumuliert 197 . Erstmalig beschrieben wurde dieses Wachstumsverhalten von Henrici
(1933) anhand der Beobachtung, dass Süßwasserbakterien nicht planktonisch, sondern
an eine Oberfläche gebunden wuchsen 109 . Die Fähigkeit, mehrlagige Biofilme auf den
Polymeroberflächen implantierter Fremdkörper auszubilden, ist der entscheidende
Pathogenitätsfaktor für die Verursachung Fremdkörper-assoziierter Infektionen durch
S. epidermidis 12, 40-42, 50, 51, 63, 119 . Fast alle S. epidermidis Stämme sind in der Lage, an
Polymeroberflächen zu binden, jedoch ist die Fähigkeit zur nachfolgenden
Akkumulation unterschiedlich ausgeprägt, so dass sich die Stämme bezüglich der
Quantität des produzierten Biofilms unterscheiden 67, 115, 189, 200 . Um die Biofilmbildung
auch in vitro beurteilen zu können, etablierten Christensen et al. einen Test in Flüssigkulturröhrchen,
mit dem die Biofilmbildung qualitativ erfasst werden konnte 41 . Eine
Weiterentwicklung dieses Testes ist die semiquantitative Beurteilung der Biofilmbildung
in Zellkultur-Mikrotiterplatten unter statischen Bedingungen durch
Bestimmung der optischen Dichte des angefärbten, adhärenten Biofilms 42 . Die
Organisation als Biofilm vermittelt einen Schutz gegenüber den wirtseigenen Immun-

1 Einleitung 8
108, 204, 273, 274
mechanismen und
führt außerdem zu einer verminderten Antibiotikasuszeptibilität
der Erreger 61, 69, 71, 86, 99, 154, 242 .
Die Biofilmbildung von S. epidermidis, welche von einigen Autoren auch als Schleimbildung
bezeichnet wird, weist eine Zweiphasenkinetik auf (Abbildung 1.1) 97, 169 . In der
primären Bindungsphase etablieren die Bakterien durch eine Reihe von spezifischen
und unspezifischen Faktoren Kontakt mit der Oberfläche, beziehungsweise mit dort
gebundenen extrazellulären Matrixbestandteilen. Es folgt die akkumulative Phase, in
welcher sich die Zellen als mehrschichtiger Biofilm organisieren. Hierbei ist die Mehrzahl
der Zellen nur durch interzelluläre Adhäsion in den Biofilm eingebunden und
besitzt keinen direkten Kontakt mehr zu der Polymeroberfläche 65, 82, 205 .
Abbildung 1.1
Schematische Darstellung des zweiphasigen Verlaufes der Biofilmbildung von
S. epidermidis mit Auflistung der beteiligten Faktoren. Während der primären Bindung
kommt es durch eine Reihe von spezifischen und unspezifischen Faktoren zur Adhärenz
an die Polymeroberfläche. In der zweiten Phase kommt es durch interzelluläre
Adhäsion zur Bildung eines mehrschichtigen Biofilms, in dem die meisten Zellen
keinen direkten Kontakt mehr zur Polymeroberfläche besitzen.
1.3.1 Primäre Adhäsion
Die primäre Phase der Adhäsion von S. epidermidis an nativen Polymeroberflächen ist
abhängig von einer Reihe unspezifischer Faktoren wie Oberflächenbeschaffenheit, Vander-Waals-Kräften
und hydrophoben Interaktionen zwischen Polymer- und Bakterienoberfläche
79, 114, 125, 168, 200 . Jedoch ist die primäre Adhäsion von S. epidermidis an eine
Polymeroberfläche in vivo ein komplexer Vorgang, da sowohl Polymeroberflächen als
auch Bakterienoberflächen durch Wirtsfaktoren wie zum Beispiel Albumin, Fibrinogen,
68, 143,
Fibronectin, Kollagen, Thrombozyten und Vitronectin modifiziert werden können
264, 277 . In vitro konnte ein negativer Einfluss auf die Bindung von S. epidermidis an

1 Einleitung 9
Polymeroberflächen für Albumin, Plasma und Serum nachgewiesen werden 67, 115, 200 ,
während einzelne Matrixproteine wie Fibrinogen und Fibronectin eine Bindung vermitteln
können 110, 264 , welche allerdings schwächer ist, als eine direkte Bindung an die
Polymeroberfläche 188 . Weiterhin ist S. epidermidis auch in der Lage, an Thrombozyten
und Fibrin-Thrombozytenthromben zu binden 43, 278 .
In den letzten Jahren konnte eine Vielzahl weiterer, spezifischer Faktoren beschrieben
werden, welche an der primären Bindung von S. epidermidis an Polymeroberflächen,
beziehungsweise Wirtsproteinen beteiligt sind. Das Kapselpolysaccharid/Adhäsin
(capsular polysaccharide/adhesin PS/A) wurde als funktioneller Faktor für die Bindung
von S. epidermidis an Silastic-Katheter beschrieben 187, 256 , während PS/A keinen Einfluss
auf die Bindung an Polyethylen besitzt 113 . Die Daten einer frühen Publikation zu
diesem Adhäsin deuteten nicht auf einen Einfluss von PS/A auf die Zellakkumulation
im Biofilm hin, da etwa die Hälfte PS/A-positiver S. epidermidis Isolate einen Biofilmnegativen
Phänotyp aufweisen 189 . Die chemische Struktur von PS/A konnte bisher nicht
schlüssig aufgeklärt werden. Die Tatsache, dass der für die Synthese des interzellulären
Polysaccharidadhäsins essentielle Genlokus icaADBC 182 (siehe Kapitel 1.3.2) ebenfalls
für die Synthese von PS/A verantwortlich sein soll, lässt die Existenz von PS/A als
eigenständiges, im Rahmen der primären Bindung fungierendes Adhäsin unwahrscheinlich
erscheinen. PS/A wurde mittlerweile durch den Erstbeschreiber zunächst in Poly-N-
Succinylglukosamin (PNSG) 183
und anschließend in Poly-N-Acetylglukosamin
(PNAG) 179 umbenannt. Hierbei findet sich eine hohe Homologie des PNAG Moleküls
mit dem interzellulären Polysaccharidadhäsin PIA (siehe Kapitel 1.3.2).
Das S. epidermidis Autolysin AtlE vermittelt die Bindung an das extrazelluläre Matrixprotein
Vitronectin sowie Polystyroloberflächen. Erstaunlicherweise beeinträchtigt eine
Inaktivierung von AtlE nicht die Bindung an Glasoberflächen, sondern vermag diese
sogar noch zu steigern 105 . Das erst vor kurzem beschriebene Autolysin/Adhäsin Aae
vermittelt eine Bindung an Fibrinogen, Fibronectin und Vitronectin 107 . Das S. epidermidis
Oberflächenprotein 1 (Staphylococcal surface protein Ssp 1) findet sich in einer
Fimbrien-ähnlichen Struktur auf der Zelloberfläche und vermittelt eine Bindung an
Polystyrol 255, 266 104, 192, 201, 202
. Weiterhin sind das Fibrinogen bindende Protein Fbe
sowie das Fibronectin bindende Protein Embp 286 an der Bindung von Matrixproteinen
des Wirtes beteiligt. Für die extrazelluläre S. epidermidis Lipase GehD konnte gezeigt
werden, dass sie zusätzlich als Zellwand-assoziiertes Kollagen-Adhäsin fungiert 31 .

1 Einleitung 10
Außerdem wird beschrieben, dass Lipoteichonsäuren an der Bindung von S. epidermidis
an Fibrin-Thrombozytenthromben und Fibronectin beteiligt sind 43, 116 .
1.3.2 Akkumulative Phase der Biofilmbildung
In der akkumulativen Phase formiert sich ein mehrschichtiger Biofilm, in dem nur die
wenigsten Zellen in einem direkten Kontakt zu der Polymeroberfläche stehen. Daher ist
die Expression eines Adhäsins notwendig, welches eine Zell-zu-Zell Bindung innerhalb
des Biofilms vermittelt. Als wesentlich wird hierfür das interzelluläre Polysaccharidadhäsin
(polysaccharide intercellular adhesin PIA) angesehen, welches durch die Genprodukte
des vier Gene umfassenden icaADBC Lokus (intercellular adhesion ADBC)
synthetisiert wird. Neben der Funktion als Zelladhäsin innerhalb des Biofilms fungiert
PIA zusätzlich als Hämagglutinin 106, 169, 171, 174 .
Mittels Ionenaustauschchromatographie lässt sich PIA in die zwei unterschiedlichen
Fraktionen PIA I und PIA II auftrennen, wobei PIA I mehr als 80 % der Gesamtmenge
ausmacht 171, 172 . Mittels NMR-Spektroskopie (nuclear magnetic resonance spectroscopy)
und chemischer Analyse konnte PIA I als ein lineares Homoglykan aus durchschnittlich
130 β-(1,6)-verknüpften 2-deoxy-2-amino-D-glukopyranosyl-Einheiten charakterisiert
werden. Durchschnittlich sind 15 bis 20 % der Zuckereinheiten nicht N-
acetyliert und somit positiv geladen 171 . PIA II ist strukturell eng mit PIA I verwandt,
jedoch sind in PIA II im Durchschnitt mehr Glukosamin-Reste N-acetyliert. Zusätzlich
enthält es Phosphat und Ester-gebundenes Succinat, dieses erklärt den leicht anionischen
Charakter von PIA II 171 . Neben PIA synthetisieren eine Reihe von klinischen
S. epidermidis Isolaten die antigene Variante PIAv 149, 172 , welche möglicherweise auf
Grund ihrer höheren Antigenität besser als Impfstoff geeignet sein könnte als PIA.
Für eine Population von 179 klinischen S. epidermidis Isolaten konnte eine lineare
Korrelation zwischen PIA-Produktion und Biofilmbildung und somit die essentielle
Bedeutung von PIA für die akkumulative Phase der Biofilmbildung gezeigt werden 172 .
Die Bedeutung von PIA als Virulenzfaktor in der Genese Fremdkörper-assoziierter
Infektionen konnte in zwei Tiermodellen unter Verwendung des Biofilm-positiven,
PIA-exprimierenden Stammes S. epidermidis 1457 und der isogenen, Biofilm- sowie
PIA-negativen Mutante 1457 M10 belegt werden. In einem Mausmodell induzierte der
Wildtypstamm signifikant häufiger die Entstehung subkutaner Abszesse, konnte
seltener durch die wirtseigene Abwehr eradiziert werden und haftete stärker an den

1 Einleitung 11
implantierten Kathetern als die Biofilm- und PIA-negative Mutante 227 . Weiterhin
konnte in einem Rattenmodell gezeigt werden, dass S. epidermidis 1457 signifikant
häufiger zur Entstehung Katheter-assoziierter Infektion führt als die isogene Mutante
1457 M10 228 . Als ein weiterer möglicher Selektionsvorteil wurde die Nutzung von PIA
als Energiespeicher postuliert 129 , jedoch lässt der langsame Abbau von PIA unter
Glukose-Limitation dieses unwahrscheinlich erscheinen 124 .
Die Synthese von PIA erfolgt durch die Genprodukte des icaADBC Lokus, aus dem für
die Zellwandsynthese essentiellen Baustein UDP-N-Acetylglukosamin 88 . Diese Synthese
ist jedoch von der Zellwandsynthese unabhängig und erfolgt in Abhängigkeit
unterschiedlicher Umwelteinflüsse 48, 215, 217 . Das Protein IcaA weist vier Transmembrandomänen
auf und besitzt in vitro eine geringe N-Acetyl-glucosaminyltransferase-Aktivität.
IcaB besitzt eine Deacetylase-Aktivität, welche essentiell für die
Funktion des interzellulären Polysaccharidadhäsins ist 273 . IcaC ist ein hydrophobes
integrales Membranprotein und vermutlich an der Externalisation und Elongation von
PIA beteiligt 88 . Der Genort icaD überlappt teilweise icaA und icaB und kodiert für ein
weiteres Transmembranprotein, welches als Chaperone Protein die korrekte Faltung
von IcaA unterstützt 88, 106 . Substitutionsversuche mit den einzelnen in S. carnosus
exprimierten Proteinen haben gezeigt, dass die geringe N-Acetyl-glucosaminyltransferase-Aktivität
von IcaA durch Koexpression mit IcaD gesteigert wird, so dass N-
Acetylglukosamin-Oligomere mit einer Kettenlänge von maximal 20 Sacchariden
entstehen 88 . Erst die Koexpression der Proteine IcaA, IcaD und IcaC führt zu
Oligomeren mit ausreichender Kettenlänge, um diese mit einem für PIA-spezifischen
Antikörper reagieren zu lassen 88 . Sowohl für S. epidermidis als auch für S. aureus
konnte gezeigt werden, dass die Höhe der icaADBC Transkriptionsaktivität nicht direkt
mit der produzierten PIA Menge korreliert 57, 151, 259 . Im Gegensatz zu S. aureus besitzen
nicht alle S. epidermidis Isolate den icaADBC Genlokus 150 . Es konnte aber gezeigt
werden, dass in Infektions-assoziierten Isolaten icaADBC im Vergleich zu
kommensalen Isolaten signifikant häufiger nachgewiesen wird 7, 11, 39, 85, 295 . Anhand
eines Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus des icaADBC Operons können
S. epidermidis Stämme in zwei Genotypen eingeteilt werden. Für die beiden Genotypen
konnten keine Unterschiede bezüglich der Biofilmbildung festgestellt werden. Ihr Vorliegen
könnte auf zwei unabhängige Zeitpunkte der Akquisition des icaADBC Operons
in der Evolution von S. epidermidis hinweisen 222 .

1 Einleitung 12
Interessanterweise konnte in E. coli der zu icaADBC homologe Genlokus pgaABCD
identifiziert werden 279 . Die durch pgaABCD kodierten Proteine sind für die Synthese
eines unverzweigten ß-1,6-N-Acetyl-D-glukosamin Polymers verantwortlich, welches
eine PIA-ähnliche Struktur aufweist und die Biofilmbildung von E. coli vermittelt 279 .
Eine durch PIA-Homologe bedingte Biofilmbildung konnte insbesondere für die tierund
human-pathogenen Bakterien Actinobacillus actinomycetemcomitans und Actinobacillus
pleuropneumoniae demonstriert werden 133 . Der Nachweis von pgaABCD in
einer Vielzahl von Mikroorganismen unterstreicht die Bedeutung einer durch PIA
vermittelten Biofilmbildung 279 .
Mittels Mitomycin Mutagenese in dem Stamm S. epidermidis RP62A konnte das
140 kDa große accumulation associated protein (AAP) als ein weiteres Adhäsin mit
Bedeutung für die akkumulative Phase der Biofilmbildung identifiziert werden 236 . Es
konnte gezeigt werden, dass Stämme, die dieses Protein exprimieren, mehr Biofilm
bilden als AAP-negative Stämme 117 . In einem Meerschweinchen Tiermodell konnten
Fremdkörper-assoziierte Infektionen mit der AAP-negativen Mutante erfolgreicher
eradiziert werden als Infektionen mit dem Wildtypstamm 237 . In einem Hasen-Aortenklappen-Endokarditis-Tiermodell
hingegen, wurde kein signifikanter Unterschied
bezüglich der Infektionsrate zwischen dem Wildtypstamm und der AAP-negativen
Mutante detektiert 203 . Somit kann zurzeit noch keine eindeutige Aussage über die
Bedeutung von AAP als Virulenzfaktor in der Genese Fremdkörper-assoziierter
Infektionen getroffen werden.
In S. aureus und S. epidermidis Stämmen, die im Rahmen boviner Mastitiden isoliert
wurden, konnte weiterhin eine von dem biofilm associated protein (BAP) abhängige
Biofilmbildung demonstriert werden 49, 257 . Jedoch konnte in humanen S. epidermidis
Isolaten kein bap homologes Gen nachgewiesen werden 257 . Bhp ist ein weiteres, mit
BAP verwandtes Oberflächenprotein, welches jedoch nur in 10 bis 19% der humanen
Infektions-assoziierten Isolate nachgewiesen wurde, so dass dem Protein in diesem
Kontext keine essentielle Bedeutung zugesprochen werden kann 49, 221 .
1.4 Regulation der Biofilmbildung
Eine phänotypische Variabilität der Biofilmexpression von S. epidermidis wird sowohl
in vivo als auch in vitro beobachtet 10, 295, 296 . Umweltfaktoren wie die Zuckerkonzentration
150, 217 , Osmolarität im Medium 77, 148, 216, 217 , Temperatur 156, 217, 260 , O 2 -Span-

1 Einleitung 13
nung 48 sowie subinhibitorische Konzentrationen von Antibiotika 77, 217 und Desinfektionsmitteln
77, 149 modulieren die Transkriptionsaktivität von icaADBC, infolgedessen
die PIA Synthese und somit letztendlich die Biofilmbildung von Staphylokokken.
Weiterhin konnte beobachtet werden, dass die Insertion des insertion sequence
element IS256 im ica-Operon zu Biofilm-negativen Phasenvarianten führt. Interessanterweise
konnte gezeigt werden, dass dieser Vorgang durch exakte Exzision des
Insertionselements reversibel ist 295, 296 .
Eine Regulation der Biofilmbildung und insbesondere die Adaptation an Umweltstimuli
erfolgen durch das, in weiten Teilen noch unverstandene, Zusammenspiel einer Vielzahl
globaler Regulatoren. Einer dieser Regulatoren ist der alternative Sigmafaktor σ B ,
welcher durch Bindung an die RNA Polymerase eine Erkennung spezifischer Promotorsequenzen
und somit eine gezielte Transkription einzelner Gene erlaubt 93, 103, 294 .
Weiterhin besitzt S. epidermidis mindestens 16 Zweikomponenten-Regulator-Systeme,
unter anderem das accessory gene regulatory system (agr), sowie das S. aureus exoprotein
expression system (sae) 93, 294 . Diese Systeme bestehen zum einen aus einem
membranständigen Protein mit einer extrazellulären Sensor Domäne, sowie einer intrazellulären
Domäne mit Histidinkinaseaktivität. Den zweiten Teil bildet das eigentliche
Regulatorprotein, welches als Transkriptions-Aktivator oder -Repressor fungieren
kann 74 . Außerdem konnten acht Homologe des sar Gens (staphylococcal accessory
gene regulator) in S. epidermidis nachgewiesen werden 93, 294 . Vor kurzem konnte
bestätigt werden, dass SarA zur Familie der winged-helix Transkriptionsfaktoren gehört,
welche durch Bindung an spezifische Promotoren die Expression einer Vielzahl von
Virulenzfaktoren regulieren 62, 165 .
Mittels Transposonmutagenese mit Hilfe des temperatursensitiven Plasmids pTV1ts,
welches das aus Enterococcus faecalis stammende Transposon Tn917 241, 292 enthält,
konnten Mutanten mit einem Biofilm-negativen Phänotyp, beziehungsweise mit verminderter
Biofilmbildung generiert werden 175 . Diese Mutanten wurden nach ihrem
phänotypischen Verhalten in die Klassen I bis IV eingeteilt. Es konnte gezeigt werden,
dass der Biofilm-negative Phänotyp der Klasse I Mutanten auf einer Inaktivierung des
icaADBC Operons beruht 175 . Die Klasse II Mutante S. epidermidis M12 wies neben
einem Biofilm-negativen Phänotyp gleichzeitig eine Veränderung der Koloniemorphologie
mit grauen bis durchscheinenden Kolonien auf, die sich deutlich von den
weißen Kolonien des Wildtyps abgrenzen ließen 175 . Die Klasse III Mutanten M15 und
M19 zeichneten sich ebenfalls durch eine stark verminderte Biofilmbildung und eine

1 Einleitung 14
graue Koloniemorphologie aus, während die in ihrer Koloniemorphologie im Vergleich
zum Wildtyp unveränderte Klasse IV Mutante M17 charakteristischerweise in Medien
unterschiedlicher Hersteller eine differentielle Expression der Biofilmbildung zeigte 175 .
Eine Expression des icaADBC Operons in trans von einem Xylose-induzierbaren
Promotor führte in den Mutanten aller Klassen zu einer Xylose-abhängigen
Rekonstitution der PIA- und Biofilmsynthese. Somit konnte gezeigt werden, dass es
sich bei den inaktivierten Genorten in den Mutanten der Klasse II bis IV um regulative
Elemente der Biofilmbildung handelt und nicht um Gene, welche für die Synthese von
N-Acetylglukosamin Vorstufen oder die Exkretion von PIA verantwortlich sind 175 .
Interessanterweise konnte für die inaktivierten Genorte der Mutanten der Klassen II bis
IV ein Einfluss auf die Expression der Oxacillinresistenz in S. epidermidis 1057
nachgewiesen werden 177 .
Mit Hilfe eines arbitrary PCR Verfahrens wurde für die Klasse II Mutante
S. epidermidis M12 gezeigt, dass die Tn917 Insertion in einem offenen Leserahmen mit
hoher Homologie zu den purR Genen von B. subtilis und S. aureus lokalisiert ist
(Abbildung 1.2) 153 .
Abbildung 1.2 Vergleich der Organisation der Umgebung des purR Gens von S. epidermidis 1457
(accession no.: AY056454) mit den homologen Genen in S. aureus (accession no.:
AY056454) und B. subtilis (accession no.: Z99104). Die Tn917 Insertionsstelle der
Mutante M12 ist dargestellt. Schwarze Pfeile repräsentieren offene Leserahmen.
Doppelpfeile markieren homologe Gene.
Die Insertion führt unter anderem zu der Inaktivierung eines circa 1 kb großen
Transkriptes, welches zwei offene Leserahmen mit Homologie zu den Bacillus subtilis
Genen yabJ und spoVG umfasst. Mittels Komplementierungsversuchen wurde gezeigt,

B
1 Einleitung 15
dass die yabJ und spoVG Homologen gemeinsam für die Rekonstitution der Biofilmbildung
notwendig sind, während purR nicht essentiell ist 18 . Da für die auch in S. aureus
zu findenden homologen Gene in Staphylokokken bisher keine Funktion bekannt ist,
werden die Gene entsprechend ihrer nachgewiesenen Funktion in S. epidermidis als
biofilm accumulation regulator A und B (barAB) bezeichnet (Abbildung 1.2) 147 .
Für die Klasse III Mutante M15 konnte nachgewiesen werden, dass Tn917 19 Basen
unterhalb des Translationsstarts eines offenen Leserahmens mit hoher Homologie zu
dem ersten Gen rsbU des σ B Operons in S. aureus 146, 148, 153, 160, 289 , sowie den
entsprechenden Homologen in Bacillus subtilis 130, 288 und Listeria monocytogenes 20
lokalisiert ist (Abbildung 1.3).
Abbildung 1.3
Vergleich der Organisation des σ B Operons von S. epidermidis 1457 (accession no.:
AF274004) mit den σ B Operons von S. aureus (accession no.: Y09929) und B. subtilis
(accession no.: Z99106), sowie Lokalisation der Tn917 Insertionsstelle der Mutante
M15. Schwarze Pfeile repräsentieren offene Leserahmen. Doppelpfeile markieren
A
B
homologe Gene. P A und P B repräsentieren σ - beziehungsweise σ -abhängige
Promotoren.
Das σ B Operon kodiert für den alternativen Sigmafaktor σ B , welcher 1979 erstmalig von
Haldenwang und Losick in B. subtilis beschrieben wurde 102, 103 . In S. aureus konnte
gezeigt werden, dass σ B 27, 89,
an der Regulation einer Vielzahl von Proteinen beteiligt ist
90 . Die Charakterisierung der flankierenden chromosomalen Bereiche in S. epidermidis
ergab, dass unterhalb des Homolog von rsbU drei weitere offene Leserahmen mit
identischer Abfolge zu rsbV, rsbW und sigB von S. aureus, B. subtilis und
L. monocytogenes lokalisiert sind 148 . Aufgrund der hohen Homologie wurden die
entsprechenden Gene in S. epidermidis ebenfalls als rsbU, rsbV, rsbW und sigB
bezeichnet (Abbildung 1.3) 148, 151 .

1 Einleitung 16
Die σ B -Aktivität wird in B. subtilis und S. aureus auf posttranskriptioneller Ebene durch
die im σ B Operon kodierten Regulatorproteine (RsbU, RsbV, RsbW) kontrolliert
(Abbildung 1.4). RsbW fungiert als Anti-Sigmafaktor, da es in der Lage ist, σ B zu
binden und somit die Bindung des alternativen Sigmafaktors an die RNA Polymerase zu
verhindern 22-24, 60, 186 . Gleichzeitig besitzt RsbW eine spezifische Kinaseaktivität für den
Anti-Anti-Sigmafaktor RsbV 3, 60, 290 . Lediglich die nicht-phosphorilierte Form von
RsbV ist in der Lage, RsbW zu binden und somit den Anti-Sigmafaktor zu inaktivieren.
Der Phosphorilierungsgrad von RsbV wird durch den Energiezustand der Zelle sowie
die RsbV-spezifische Phosphatase RsbU reguliert 14, 33, 70, 91, 198, 268-270 .
Abbildung 1.4
Modell der posttranskriptionellen Regulation der σ B -Aktivität in S aureus, beziehungsweise
der zentralen Regulationskaskade von B. subtilis. Die Bindung von σ B an die
RNA-Polymerase (RNAP) kann durch Bindung an den negativen Regulator RsbW verhindert
werden. RsbW fungiert gleichzeitig als spezifische Kinase für den Anti-Anti-
Sigmafaktor RsbV und führt durch Phosphorilierung (RsbV-P) zu dessen Inaktivierung.
RsbV-P kann durch die spezifische PP2C Phosphatase RsbU dephosphoriliert und
damit aktiviert werden. Nicht phosphoriliertes RsbV ist in der Lage, den Anti-Sigmafaktor
RsbW zu binden und auf diesem Weg dessen Bindung an σ B zu inhibieren.
Obwohl das zentrale Regulationsmotiv zwischen S. aureus und B. subtilis konserviert
ist, stellt sich die Regulation der σ B -Aktivität in B. subtilis weitaus komplexer dar. Die
σ B -Aktivität in B. subtilis wird je nach Stimulus durch unterschiedliche Aktivierungswege
des Anti-Anti-Sigmafaktors RsbV reguliert. Durch einen internen, vor rsbV
gelegenen σ B -abhängigen Promotor kann nach der initialen Aktivierung von σ B eine
weitere Autoinduktion der letzten vier Gene des σ B Operons erfolgen (Abbildung 1.3).
Eine Induktion von σ B durch Umweltstressfaktoren wird vornehmlich durch die für
RsbV spezifische PP2C Phosphatase RsbU vermittelt 131, 132, 270, 271, 290 . Die Aktivität von
RsbU wird durch die Proteine RsbS und RsbT reguliert 131, 290 . Im dephosphorilierten
Zustand bindet RsbS an RsbT und inaktiviert dieses. Durch Phosphorilierung von RsbS

1 Einleitung 17
hingegen wird RsbT freigesetzt, welches wiederum durch Bindung an RsbU dessen
Phosphataseaktivität steigt 132, 290 . Der Phosphorilierungsgrad von RsbS wird durch die
Kinase RsbT und die ebenfalls im σ B Operon unterhalb von sigB kodierte, für RsbS
spezifische PP2C Phosphatase RsbX kontrolliert 290 . Weiterhin konnte für das vom
ersten Gen des σ B Operons in B. subtilis kodierten Proteins RsbR gezeigt werden, dass
es als Aktivator der Kinaseaktivität von RsbT fungiert 2 . Innerhalb des B. subtilis
Genoms konnten sechs Proteine mit Homologie zu RsbR identifiziert werden, welche
einen Einfluss auf die Antwort von B. subtilis gegenüber Umweltstress haben, oder
zumindest mit dem RsbR-RsbS-RsbT-Regulationssystem interagieren können 1 . Außerdem
konnte für das GTP-bindende Protein Obg gezeigt werden, dass es essentiell für
eine σ B -Aktivierung durch Umweltstressfaktoren ist 238, 239 . Neben den bereits erwähnten
Regulationskaskaden kann eine σ B -Aktivierung in B. subtilis auch direkt durch Energiemangel
innerhalb der Zelle erfolgen. Ein Mangel an intrazellulärem ATP führt dazu,
dass der Anti-Sigmafaktor RsbW den Anti-Anti-Sigmafaktor RsbV nicht in ausreichendem
Maße phosphorilieren kann 3, 4, 271 .
Im Gegensatz zu B. subtilis lassen sich in S. epidermidis und in S. aureus außer den
zentralen Regulatorproteinen RsbV und RsbW, nur die RsbV-spezifische Phosphatase
RsbU nachweisen, so dass sich die Regulation der σ B -Aktivität in Staphylokokken und
B. subtilis erheblich unterscheiden muss 93, 148, 160, 289, 294 . Inwieweit die in B. subtilis
dokumentierten Regulationsmechanismen in Staphylokokken durch alternative Proteine
übernommen werden, ist derzeit noch nicht bekannt.
Neben den bereits aufgeführten Genorten wurde vor kurzem das dem icaADBC Operon
in entgegengesetzter Orientierung vorgeschaltete Gen icaR als regulatives Gen charakterisiert.
Es konnte gezeigt werden, dass icaR für einen negativen Regulator der
icaADBC Transkription und damit der PIA Expression kodiert 44, 45, 97 . Für S. aureus
konnte demonstriert werden, dass IcaR an die nichtkodierende, chromosomale DNA
zwischen dem icaADBC Operon und dem Gen icaR binden kann 128 .
Weiterhin wurde ein positiver regulativer Einfluss des sarA Gens auf die icaADBC
Transkription in S. epidermidis demonstriert 46 . Es konnte jedoch in einer Mutante mit
inaktiviertem sarA durch erhöhte Osmolarität und Supplementierung des Mediums mit
Ethanol, die icaADBC Transkription wiederhergestellt werden, ohne dass es zur
Rekonstitution der Biofilmbildung kam. Dieses könnte ein Hinweis dafür sein, dass die

1 Einleitung 18
regulative Funktion von SarA auf einer posttranskriptionellen Stufe der PIA Synthese
ansetzt 46, 56 .
Interessanterweise scheint sich trotz der Homologie des icaADBC Operons 47 , die
Regulation der Biofilmbildung zwischen S. aureus und S. epidermidis zu unterscheiden.
Phänotypische Analysen haben gezeigt, dass S. aureus im Vergleich zu S. epidermidis
andere Umweltbedingungen zur Biofilmbildung benötigt 150 . Die Daten bezüglich der
Bedeutung des alternativen Sigmafaktors σ B für die Biofilmbildung von S. aureus sind
widersprüchlich. Die Arbeitsgruppe von Valle et al. konnte demonstrieren, dass der
alternative Sigmafaktor σ B in S. aureus kein essentieller Regulator der PIA/PNAG
Synthese sowie der Biofilmbildung ist 259 . Gleichzeitig konnte in dieser Arbeit sarA als
zentraler Regulator der Biofilmsynthese von S. aureus identifiziert werden 259 . Im
Gegensatz dazu konnten Rachid et al. unter hoch-osmolaren Anzuchtbedingungen in
einem einzelnen klinischen S. aureus Isolat eine σ B -abhängige Biofilmbildung nachweisen,
während für andere Isolate keine σ B -abhängige Regulation nachgewiesen werden
konnte 216 .
1.5 Voraussetzungen für diese Arbeit
Der Arbeitsgruppe von Professor Mack war es gelungen, die chemische Struktur des
interzellulären Polysaccharidadhäsins PIA aufzuklären 171 und durch Transposonmutagenese
eine Reihe von PIA- und Biofilm-negativen Mutanten des Wildtyps
S. epidermidis 1457 zu generieren 175 . Knobloch et al. hatten die Einflüsse jener Stressfaktoren
auf die Biofilmbildung untersucht, welche für das natürliche Habitat von
S. epidermidis, also Haut und Schleimhaut von Bedeutung sind. Zum einen wurde die
Biofilmbildung unter erhöhter Osmolarität untersucht, da aufgrund der Salzsekretion
beim Schwitzen eine erhöhte Osmolarität auf der Haut vorherrscht. Zum anderen wurde
die Biofilmbildung in Nährmedien, welche mit Alkoholen supplementiert wurden untersucht,
da im klinischen Alltag häufig aliphatische Alkohole zur Hautdesinfektion eingesetzt
werden. Mutanten mit einer Transposoninsertion im icaADBC Operon (Klasse I
Mutanten) sind unter keinen Bedingungen in der Lage, einen Biofilm zu bilden 175 ,
während für die Klasse III Mutanten eine differentielle Expression der Biofilmbildung
demonstriert wurde 148 . Der Biofilm-positive Wildtypstamm S. epidermidis 1457 ist
sowohl durch erhöhte Osmolarität, als auch durch Supplementierung des Mediums mit
Ethanol in seiner Biofilmexpression induzierbar, die Biofilm-negative Mutante M15

1 Einleitung 19
kann jedoch nur durch Zugabe von Ethanol in ihrer Fähigkeit zur Biofilmbildung rekonstituiert
werden. Weiterhin konnte für diesen inaktivierten Genort ein Einfluss auf die
Expression der Oxacillinresistenz in S. epidermidis 1057 M15 nachgewiesen werden 177 .
Als Insertionsstelle des Transposons Tn917 in diesen Klasse III Mutanten konnte das
Gen rsbU des σ B Operons identifiziert werden 148 , während für die Klasse II Mutante
S. epidermidis M12 ein offener Leserahmen mit hoher Homologie zu den purR Genen
von B. subtilis und S. aureus als Insertionsstelle nachgewiesen werden konnte 153 .
1.6 Fragestellung
Phänotypische Untersuchungen der Biofilm-negativen Mutante M15 des Wildtypstammes
S. epidermidis 1457 hatten gezeigt, dass eine Transposoninsertion in das Gen
rsbU des σ B Operons zu einer differentiellen Expression der Biofilmbildung führt 146, 148 .
Aufgrund dieser phänotypischen Beobachtung konnte jedoch noch keine Aussage
darüber getroffen werden, ob RsbU selbst als Regulator der Biofilmbildung fungiert,
oder ob die Regulation der Biofilmbildung über eine mögliche Regulation des
alternativen Sigmafaktors σ B vermittelt wird. Außerdem konnte nicht sicher ausgeschlossen
werden, dass die beobachteten Veränderungen lediglich auf polaren
Effekten der Transposoninsertion beruhten.
Zur Klärung dieser Fragen sollten im Rahmen dieser Doktorarbeit Mutanten von S. epidermidis
1457 generiert werden, bei denen gezielt die Einzelgene des σ B Operons
(rsbU, rsbV, rsbW und sigB), die regulative Kaskade (rsbUVW), sowie das gesamte
Operon (rsbUVWsigB) inaktiviert sind. Weiterhin sollte der Einfluss des σ B Operons auf
die Expression des für die Biofilmbildung essentiellen interzellulären Polysaccharidadhäsins
PIA evaluiert werden 171 . In diesem Zusammenhang sollte ebenfalls die
Regulation des icaADBC Lokus 106 , dessen Genprodukte für die PIA Synthese
verantwortlich sind, untersucht werden. Außerdem sollte der in der Biofilm-negativen
Mutante M12 inaktivierte Genort näher charakterisiert, sowie der Einfluss von
Regulatoren der Biofilmbildung auf die Expression der Oxacillinresistenz von S. epidermidis
untersucht werden. Durch die Aufklärung der Regulationswege der PIA
Expression sollten mögliche neue Zielstrukturen für verbesserte Therapie- und Verhütungsstrategien
Fremdkörper-assoziierter Infektionen ermittelt werden.

2 Material und Methoden 20
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Geräte
Tabelle 2.1 Verwendete Geräte
Hersteller
Laborgerät
AD Krauth, Hamburg, Deutschland
GFL1083 Schüttelwasserbad
Agfa Geavert AG, Leverkusen, Deutschland Crurix 2425 Entwickler
Applied Biosystems, Foster City, USA ABI Prism 310 Sequencer
B. Braun, Melsungen, Deutschland Lab-Shaker Schüttelinkubator
Beckmann, München, Deutschland
J2-21 Kühlzentrifuge
Spectrophotometer 34
Behring, Marburg, Deutschland
ELISA Processor II Spectrophotometer
BioRad, München, Deutschland
iCycler iQ Thermoycler
Gene Pulser II Elektroporationssystem
PowerPac 3000 Power Supply
SmartSpec Plus Spectrophotometer
Gelkammern
Don Whitley Scientific Ltd., Shipley, England WASP Spiral Plater
Dr. Gruß KG, Neuß am Rhein, Deutschland Inkubator F / 30
Eppendorf, Hamburg, Deutschland Eppendorfzentrifuge 5415
Thermomixer 5436
Mastercycler gradient
Heinemann, Schwäbisch Gmünd, Deutschland Branson Sonifier 250-D
Heraeus-Christ, Osterode, Deutschland Cryofuge 6-6 Kühlzentrifuge
Megafuge 1.0 R Kühlzentrifuge
Biofuge pico Tischzentrifuge
Brutschrank 5050E
Hettich, Tuttlingen, Deutschland
Tischzentrifuge Rotana / S
Knick, Berlin, Deutschland Digital-pH-Meter 646
Keutz Laborgeräte, Hamburg, Deutschland Gelkammern
Leica, Bensheim, Deutschland
TCS SP2 AOBS
Leitz, Wetzlar, Deutschland Feinwaage 2432
Mettler Waagen GmbH, Gießen, Deutschland PC4400 Waage
MWG Biotech, München, Deutschland
Primus 96 Thermocycler
Gelkammern
Nettler-Hinz, Hamburg, Deutschland Thermoinkubator 5320
New Brunswick Scientific Co., New
Brunswick, USA
Pharmacia, Freiburg, Deutschland
Phase, Lübeck, Deutschland
Q-Biogene, Irvine, CA, USA
Controlled Environment Incubator
Schüttelinkubator
Genequant
GelCam Photodokumentationssystem
FastPrep FP120

2 Material und Methoden 21
2.1.2 Chemikalien, Plastik- und Einwegartikel
Bei den Chemikalien handelt es sich, soweit nicht anders angegeben, um analysenreine
Substanzen der Firmen Fluka (Taufkirchen, Deutschland), Merck (Darmstadt,
Deutschland), Roth (Karlsruhe, Deutschland) und Sigma (Taufkirchen, Deutschland).
Plastik- und Einwegartikel stammen, wenn nicht anders angegeben, von den Firmen
Eppendorf (Hamburg, Deutschland), Greiner (Nürtingen, Deutschland), Becton
Dickenson (Cockeysville, MD, USA) und Nunc (Roskilde, Dänemark).
2.1.3 Puffer und Lösungen
Alle Puffer und Lösungen wurden, sofern nicht anders angegeben, in vollentionisiertem
(VE) Wasser angesetzt.
EDTA-Lösung:
Gelladepuffer (DNA):
Gelladepuffer (RNA):
0,5 M Na-EDTA
pH 7,5
0,25 % (wt/vol) Bromphenolblau
0,25 % (wt/vol) Xylen Cyanol FF
15 % (wt/vol) Ficoll
250 µl Formamid
83 µl Formaldehyd 37 %
50 µl 10 × MOPS
13 µl H 2 O
4 µl 1 % Bromphenolblaulösung jeweils frisch angesetzt
10 × MOPS: 200 mM Morpholinopropansulfonsäure
50 mM Natriumacetat
10 mM EDTA
pH 7,0
Na-Acetat Lösung:
PBS:
SDS Stammlösung
3 M Na-Acetat
pH 7,0
140 mM NaCl
9 mM Na 2 HPO 4
2 mM KCl
1 mM KH 2 PO 4
pH 7,4
20 % (wt/vol) Natrium-Dodecylsulfat
20 × SSC: 3 M NaCl
0,3 M Natriumcitrat
pH 7,0

2 Material und Methoden 22
TBE-Puffer:
TE-Puffer:
Tris-HCl:
X-Gal-Lösung:
90 mM Tris
90 mM Borsäure
2,5 mM EDTA,
pH 8,0
10 mM Tris-HCl
1 mM EDTA
pH 8,0
5 M Tris
pH 7,5 eingestellt mit HCl
40 mg/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galaktosid in
Dimethylformamid
2.1.4 Nährmedien
Alle Nährmedien wurden in VE Wasser angesetzt und durch Erhitzen (15 min, 121 °C,
3,0 bar) in einem Dampfautoklaven sterilisiert. Zur Verfestigung von Flüssigmedien
wurde, wenn nicht anders angegeben, 15 g/l Bacto-Agar (Difco, Detroit, MI, USA) hinzugegeben.
Die verwendeten Grundsubstanzen und fertigen Trockenmedien wurden,
sofern nicht gesondert angegeben von den Firmen Becton Dickinson (Cockeysville,
MD, USA), Difco oder Oxoid (Basingstoke, England) bezogen.
BHI-Agar:
BHI-Softagar:
Blut-Agar:
NYE-Agar:
30 g/l Brain Heart Infusion Broth
12 g/l Bacto-Agar
30 g/l Brain Heart Infusion Broth
7 g/l Bacto-Agar
20 mM NaCitrat
42,0 g/l Columbia-Agar
1,0 g/l Bacto-Agar
2,2 g/l Glukose
72 ml/l Schafsblut
pH 7,0
10 g/l Caseinhydrolysat
5 g/l Hefeextrakt
5 g/l NaCl
STA-Agar: 20 g/l Nutrient Broth No. 2
5 g/l NaCl
0,4 g/l CaCl 2
12 g/l Bacto-Agar

2 Material und Methoden 23
STA-Softagar: 20 g/l Nutrient Broth No. 2
5 g/l NaCl
0,4 g/l CaCl 2
7 g/l Bacto-Agar
B2 Brühe:
BHI+ Brühe:
Einfriermedium:
Luria-Bertani Brühe (LB):
Mueller-Hinton Brühe (MH):
10 g/l Caseinhydrolysat
25 g/l Hefeextrakt
1 g/l Di-Kaliumhydrogenphosphat K 2 HPO 4
5 g/l Glukose
25 g/l NaCl
30 g/l Brain Heart Infusion Broth
20 mM NaCitrat
100 ml 1,5 % (wt/vol) Bacto-Pepton
60 ml Glycerin 87 %
Die Bestandteile wurden getrennt autoklaviert und
anschließend zusammengefügt.
10 g/l Trypton
5 g/l Hefeextrakt
10 g/l NaCl
pH 7,0
21 g/l Mueller-Hinton Broth
pH 7,3
NB2+ Brühe: 20 g/l Nutrient Broth No 2
0,4 g/l CaCl 2
SOC-Medium:
Trypton Soja Brühe (TSB):
TSB NaCl 4%
TSB EtOH 2%, 3% oder 4%
TSB ohne Glukose (TSB∅):
20,0 g/l Trypton
5,0 g/l Hefeextrakt
0,6 g/l NaCl
0,5 g/l KCl
20 mM Glukose
20 mM Mg 2+
pH 7,0
30 g/l TSB (Becton Dickinson)
pH 7,3
TSB supplementiert mit 4 % (wt/vol) NaCl
TSB mit 2, 3 und 4 % (vol/vol) Ethanol
17,0 g/l Trypton
3,0 g/l Soja Pepton
5,0 g/l NaCl
2,5 g/l K 2 HPO 4
pH 7,3

2 Material und Methoden 24
2.1.5 Antibiotika
Zur Selektion wurden die Medien mit unterschiedlichen Antibiotika in verschiedenen
Konzentrationen supplementiert. Sämtliche Antibiotika wurden bei Sigma (Taufkirchen,
Deutschland) bezogen.
Tabelle 2.2 Verwendete Antibiotika-Stammlösungen
Antibiotikum Stammlösung
Ampicillin: 100 mg/ml in 80 % (v/v) Ethanol, Aliquots gelagert bei –20 °C
Chloramphenicol: 10 mg/ml in 95 % (v/v) Ethanol, Aliquots gelagert bei 4 °C
Erythromycin: 50 mg/ml in 95 % (v/v) Ethanol, Aliquots gelagert bei 4 °C
Oxacillin: 10-200 mg/ml in 95 % (v/v) Ethanol, Aliquots gelagert bei–20 °C
2.1.6 Enzyme
Enzym
RNase (DNase frei)
T4-DNA-Ligase
BamHI
EcoRI
HindIII
KpnI
NheI
SacI
DNase (RNase frei)
Lysostaphin
Proteinase K
Shrimp alkaline Phosphatase (SAP)
Tabelle 2.3 Verwendete Enzyme
Hersteller
Boehringer, Mannheim, Deutschland
Pharmacia, Freiburg, Deutschland
Promega, Madison, WI, USA
Sigma, Taufkirchen, Deutschland
USB Corporation, Cleveland, OH, USA
2.1.7 Bezugsquellen für verwendete Reagenziensets
Tabelle 2.4 Verwendete Reagenziensets
Bezeichnung
Hersteller
λ Phagen DNA -HindIII /
Finnzymes, Espoo, Finnland
øX174 Phagen DNA -HaeIII Verdau
ABI PRISM dGTP BigDye Terminator Applied Biosystems, Foster City, CA, USA
Ready-Reaction Kit
Anti-Digoxigenin-AP Fab Fragment Roche, Mannheim, Deutschland
Anti-Kaninchen-IgG-FITC-Konjugat Sigma, Taufkirchen, Deutschland
CDP-Star
Roche, Mannheim, Deutschland
DIG Wash and Blockbufferset Roche, Mannheim, Deutschland
DIG-Easy Hyb granules
Roche, Mannheim, Deutschland

2 Material und Methoden 25
DyNazyme DNA Polymerase Kit
Elektroporationsküvette 0,1 cm
Expand High Fidelity PCR System
iQ SYBR Green Supermix
iScript cDNA Synthesis Kit
Lumi Film
Lysing MatrixB
One-Phor-All Buffer PLUS
PCR DIG Probe Synthesis Kit
QIAamp DNA Mini Kit
QIAprep Spin Miniprep Kit
QIAquick Gel Extraction Kit
QIAquick PCR purification Kit
RNA Molecular Weight Marker I
RNAeasy Puffer
RNAeasy Protect Bacteria Mini Kit
SeaKem ME Agarose
SYTO 61
TOPO TA Cloning Kit (pCR2.1-TOPO
Vektor) mit TOP10 chemisch
kompetenten E. coli
Zeta-probe Membran
Finnzymes, Espoo, Finnland
BioRad, München, Deutschland
Roche, Mannheim, Deutschland
BioRad, München, Deutschland
BioRad, München, Deutschland
Roche, Mannheim, Deutschland
Qbiogene, Irvine, CA, USA
Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden
Roche, Mannheim, Deutschland
Qiagen, Hilden, Deutschland.
Qiagen, Hilden, Deutschland.
Qiagen, Hilden, Deutschland.
Qiagen, Hilden, Deutschland.
Roche, Mannheim, Deutschland
Qiagen, Hilden, Deutschland.
Qiagen, Hilden, Deutschland.
Biozym Scientific, Oldendorf, Deutschland
Molecular Probes, Eugene, OR, USA
Invitrogen, Carlsbad, CA, USA
BioRad, München, Deutschland
2.1.8 Oligonukleotide
Sämtliche Oligonukleotide wurden von der Firma MWG-Biotech (Ebersberg,
Deutschland) synthetisiert.
Tabelle 2.5 In dieser Arbeit verwendete Oligonukleotide
Bezeichnung Sequenz (in 5´-3´ Richtung) Schnittstelle Bemerkung
Für homologen Genaustausch
ermR2 CTCGAGCTCTGACGGTGACATCTCTCTATTG SacI ErythromycinermL1
CTCGCTAGCGAAAAGTACCATAAACGGTCG NheI Resistenzkassette
vrsbUR1 CTCGGATCCAGCGAAAATACCAACCCACG BamHI
vrsbUL1 CTCGAGCTCGAAATGCGCCTCCTTACTTC SacI
Fragment vrsbU
hrsbUR1 CTCGCTAGCGATGGTGTTACAGAGGCACG NheI
hrsbUL1 CTCGGTACCAGCTGGCAACCGCATTTC KpnI
Fragment hrsbU
vrsbVR1 CTCGGATCCGAGGAAATTGGTGTGCGAGG BamHI
vrsbVL1 CTCGAGCTCTGTGCCTTCTTGTCTCATTG SacI
Fragment vrsbV
hrsbVR1 CTCGCTAGCGTTAATGAAGGACGGAGGTAG NheI
hrsbVL1 CTCGGTACCTTGAGCTTGGCTATCTTCG KpnI
Fragment hrsbV
vrsbWL1 CTCGAGCTCAGCTGGCAACCGCATTTC SacI
Fragment vrsbW
mit vrsbVR1
hrsbWR1 CTCGCTAGCGTTATTTCAGACCAAGGTG NheI
hrsbWL1 CTCGGTACCTTATCATTCTGTTGTCCCAT KpnI
Fragment hrsbW

2 Material und Methoden 26
Bezeichnung Sequenz (in 5´-3´ Richtung) Schnittstelle Bemerkung
vsigBR1 CTCGGATCCCCAATGAGACAAGAAGGCAC BamHI
Fragment vsigB
vsigBL1 CTCGAGCTCCTTGAGCTTGGCTATCTTCG SacI
hsigBR1 CTCGCTAGCCGAAAGAAGCTCAGGTGGAC NheI
Fragment hsigB
hsigBL1 CTCGGTACCGATGCTGAATAAACTGATGCG KpnI
Die Erkennungssequenzen für die hinter den Oligonukleotiden genannten Restriktionsenzyme sind
jeweils unterstrichen.
Für Insertionskontrollen und Sequenzierungen
erm.rev
AACCATACGCAAGACCAATC
erm.for
GCCTACGGGGAATTTGTATC
JMK7
AGATTTAGTTCAAGTTGGTA
JMK8
TTATCATCTTGTTGTCCCAT
JMK16
CTTGAGCTTGGCTATCTTCG
JMK17
TTCTACGTGAAGGTGGTCTAGG
JMK19
GCCAAAAAGAGACTGGTGAA
JMK24
TCAAAATCACCTATACCCTACA
JMK28
GTGAATGTCCATAAGCATCC
JMK34
TTTCTTTTAGCCTCAGTTGC
JMK36
GTCTTTTCTACCACGCTTTTC
JMK46
TTCTGGTAACACATCGAGCG
JMK47
AGAAGCAGATAAAGATGGTTCG
JMK48
AATTACCCTCTACATCTCGTGC
JMK50
ATAATCCTAGACCACCTTCACG
JMK55
TGTTTATTTAGCGGATTTATCACC
Für Hybridisierungssonden
asp23.for1 AAAATCAAAAAGCACTTGAGCG
asp23.rev2 AAAAAATTGCAGGTATTGCAG
erm.for1 AATTGGAACAGGTAAAGGGC
erm.rev1 AACATCTGTGGTATGGCGG
icaA.for1 GAATCCAAAATTAGGCGCAG
icaA.rev2 AACATCCAGCATAGAGCACG
icaR.for1 CCTCTTTATCCAAAGCGATG
icaR.rev2 TCCGAAAAGGGGTACGATG
sarA.for1 ATAGGGAGGTTTCATTAATGGC
sarA.rev2 TTTGCTTCTGTGATACGGTTG
sigB.for1 AGATTTAGTTCAAGTTGGTA
sigB.rev2 TTATCATCTTGTTGTCCCAT
barA.for1 ACGGTTTTGTCTTTACATCAGG
barA.rev2 TTTACGTCTTTAGGCAACCG
Für quantitative Transkriptionsanalyse
asp23real2.for TCCAACTTCTACAGATACGCC
asp23real3.rev AAAATTGCAGGTATTGCAGC
gyrB-real1.for CTGACAATGGCCGTGGTATTC
gyrB-real1.rev GAAGATCCAACACCGTGAAGAC
icaA-real1.for TGTATCAAGCGAAGTCAATCTC
icaA-real1.rev GGCACTAACATCCAGCATAG
icaR-real1.for TGAAGATGGTGTTTGATTTGTG
icaR-real2.rev CCATTGACGGACTTTACCAG

2 Material und Methoden 27
Bezeichnung
rsbU-real1.for
rsbU-real2.rev
rsbVW-real1.for
rsbVW-real2.rev
sarA-real1.for
sarA-real2.rev
Sequenz (in 5´-3´ Richtung)
AGCGTTTGAGGAAATTGGTGTG
CCTCTACATCTCGTGCCTCTG
TTGTCACCGCTTCACTCAC
AGGACGGAGGTAGAATAACATG
AAAAACGTAATGAACACGATG
TTGCTTCTGTGATACGGTTG
2.1.9 Plasmide
Tabelle 2.6 Übersicht über die verwendeten Plasmide
Stamm Bemerkung Referenzen
pCR2.1 TOPO E. coli Vektor für die Klonierung von PCR Amplifikaten Invitrogen
pBT2
Temperatursensitiver E. coli/Staphylococcus Shuttlevektor
34
pJKMK440-6.2 pCR2.1-TOPO mit erm Fragment Diese Arbeit
pJKMK440-1.2 pCR2.1-TOPO mit Fragment vrsbU Diese Arbeit
pJKMK440-2.2 pCR2.1-TOPO mit Fragment hrsbU Diese Arbeit
pSJ440-2.2.1 pCR2.1-TOPO mit Fragment hrsbU nach Religation Diese Arbeit
pSJ440-2.2.2 pCR2.1-TOPO mit Fragment erm und hrsbU nach Religation Diese Arbeit
pSJ440-2.2.3
pCR2.1-TOPO mit Konstrukt zur Deletion von rsbU durch Diese Arbeit
homologen Genaustausch
pJKMK440-3.2 pCR2.1-TOPO mit Fragment vrsbV Diese Arbeit
pJKMK440-4.3 pCR2.1-TOPO mit Fragment hrsbV Diese Arbeit
pSJ440-4.3.1 pCR2.1-TOPO mit Fragment hrsbV nach Religation Diese Arbeit
pSJ440-4.3.2 pCR2.1-TOPO mit Fragment erm und hrsbV nach Religation Diese Arbeit
pSJ440-4.3.3
pCR2.1-TOPO mit Konstrukt zur Deletion von rsbV durch Diese Arbeit
homologen Genaustausch
pJKMK440-5.2 pCR2.1-TOPO mit Fragment vrsbW Diese Arbeit
pJKMK440-7.2 pCR2.1-TOPO mit Fragment hrsbW Diese Arbeit
pSJ440-7.2.1 pCR2.1-TOPO mit Fragment hrsbW nach Religation Diese Arbeit
pSJ440-7.2.2 pCR2.1-TOPO mit Fragment erm und hrsbW nach Religation Diese Arbeit
pSJ440-7.2.3
pCR2.1-TOPO mit Konstrukt zur Deletion von rsbW durch Diese Arbeit
homologen Genaustausch
pJKMK440-8.2 pCR2.1-TOPO mit Fragment vsigB Diese Arbeit
pSJ1 pCR2.1-TOPO mit Fragment hsigB Diese Arbeit
pSJ1.1 pCR2.1-TOPO mit Fragment hsigB nach Religation Diese Arbeit
pSJ1.2 pCR2.1-TOPO mit Fragment erm und hsigB nach Religation Diese Arbeit
pSJ1.3
pCR2.1-TOPO mit Konstrukt zur Deletion von sigB durch Diese Arbeit
homologen Genaustausch
pSJ2
pCR2.1-TOPO mit Konstrukt zur Deletion von rsbUVW durch Diese Arbeit
homologen Genaustausch
pSJ3
pCR2.1-TOPO mit Konstrukt zur Deletion von rsbUVWsigB Diese Arbeit
durch homologen Genaustausch
pSJrsbU
pBT2 mit Konstrukt zur Deletion von rsbU durch homologen Diese Arbeit
Genaustausch
pSJrsbV
pBT2 mit Konstrukt zur Deletion von rsbV durch homologen Diese Arbeit
Genaustausch
pSJrsbW
pBT2 mit Konstrukt zur Deletion von rsbW durch homologen Diese Arbeit
Genaustausch
pSJsigB
pBT2 mit Konstrukt zur Deletion von sigB durch homologen Diese Arbeit
Genaustausch
pSJrsbUVW
pBT2 mit Konstrukt zur Deletion von rsbUVW durch Diese Arbeit
homologen Genaustausch
pSJrsbUVWsigB pBT2 mit Konstrukt zur Deletion von rsbUVWsigB durch
homologen Genaustausch
Diese Arbeit

2 Material und Methoden 28
2.1.10 Organismen
Tabelle 2.7 Verwendete E. coli Stämme
Stamm Bemerkung Referenzen
TOP10 Ausgangsstamm für Transformationen mit Plasmid pCR2.1 Invitrogen
SJrsbU TOP10 mit Plasmid pSJrsbU Diese Arbeit
SJrsbV TOP10 mit Plasmid pSJrsbV Diese Arbeit
SJrsbW TOP10 mit Plasmid pSJrsbW Diese Arbeit
SJsigB TOP10 mit Plasmid pSJsigB Diese Arbeit
SJrsbUVW TOP10 mit Plasmid pSJrsbUVW Diese Arbeit
SJrsbUVWsigB TOP10 mit Plasmid pSJrsbUVWsigB Diese Arbeit
Tabelle 2.8 Verwendete Staphylokokken Stämme
Stamm Bemerkung Referenzen
Wildtypstämme
S. epidermidis 1457 Stark Biofilm-positives Isolat von einem infizierten zentralvenösen
172, 178
Katheter
S. epidermidis 8400 Biofilm-positives Blutkulturisolat
178
S. epidermidis 1057 Biofilm-positives Isolat von einem infizierten zentralvenösen
191
Katheter
S. aureus RN4220 Restriktionsdefizienter Empfängerstamm
159
S. epidermidis Transposonmutanten
1457-M10 Transposonmutante mit Insertion von Tn917 in icaA
M15
Transposonmutante mit Insertion von Tn917 in rsbU
M12
Transposonmutante mit Insertion von Tn917 in purR
1057-M10 Transduktante von 1457-M10 in S. epidermidis 1057
1057-M15 Transduktante von M15 in S. epidermidis 1057
8400-M15 Transduktante von M15 in S. epidermidis 8400
174
148
175
177
177
148
S. epidermidis Deletionsmutanten (homologer Genaustausch)
1457rsbU S. epidermidis 1457 mit Deletion des Gens rsbU Diese Arbeit
1457rsbV S. epidermidis 1457 mit Deletion des Gens rsbV Diese Arbeit
1457rsbW S. epidermidis 1457 mit Deletion des Gens rsbW Diese Arbeit
1457sigB S. epidermidis 1457 mit Deletion des Gens sigB Diese Arbeit
1457rsbUVW
S. epidermidis 1457 mit Deletion der Gene rsbU, rsbV und Diese Arbeit
rsbW
1457rsbUVWsigB S. epidermidis 1457 mit Deletion der Gene rsbU, rsbV, rsbW Diese Arbeit
und sigB
1457rsbU-trans Transduktante von 1457rsbU in S. epidermidis 1457 Diese Arbeit
1457rsbV-trans Transduktante von 1457rsbV in S. epidermidis 1457 Diese Arbeit
1457rsbW-trans Transduktante von 1457rsbW in S. epidermidis 1457 Diese Arbeit
1457sigB-trans Transduktante von 1457sigB in S. epidermidis 1457 Diese Arbeit
1457rsbUVW-trans Transduktante von 1457rsbUVW in S. epidermidis 1457 Diese Arbeit
1457rsbUVWsigB-trans Transduktante von 1457rsbUVWsigB in S. epidermidis 1457 Diese Arbeit
8400rsbU Transduktante von 1457rsbU in S. epidermidis 8400 Diese Arbeit
8400rsbV Transduktante von 1457rsbV in S. epidermidis 8400 Diese Arbeit
8400rsbW Transduktante von 1457rsbW in S. epidermidis 8400 Diese Arbeit
8400sigB Transduktante von 1457sigB in S. epidermidis 8400 Diese Arbeit
8400rsbUVW Transduktante von 1457rsbUVW in S. epidermidis 8400 Diese Arbeit
8400rsbUVWsigB Transduktante von 1457rsbUVWsigB in S. epidermidis 8400 Diese Arbeit
1057rsbU Transduktante von 1457rsbU in S. epidermidis 1057 Diese Arbeit
1057rsbV Transduktante von 1457rsbV in S. epidermidis 1057 Diese Arbeit
1057rsbW Transduktante von 1457rsbW in S. epidermidis 1057 Diese Arbeit
1057sigB Transduktante von 1457sigB in S. epidermidis 1057 Diese Arbeit
1057rsbUVW Transduktante von 1457rsbUVW in S. epidermidis 1057 Diese Arbeit
1057rsbUVWsigB Transduktante von 1457rsbUVWsigB in S. epidermidis 1057 Diese Arbeit

2 Material und Methoden 29
2.1.11 Datenbanken und Programme
Die erhaltenen Sequenzen wurden mit Hilfe der Programme des HUSAR (Heidelberg
Unix Sequence Analysis Resources; EMBL, Heidelberg: http://genius.embnet.dkfzheidelberg.de/)
oder des Programms Vector NTI (InforMax, Oxford, UK) bearbeitet und
analysiert. Aus den Datenbanken des „National Centers for Biotechnology Information“
(NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov) und des „The Institute for Genomic Research“ (TIGR,
www.tigr.org) konnten zum Abschluss dieser Arbeit die vollständigen Sequenzen von
S. epidermidis ATCC 12228 und RP62A bezogen werden. Oligonukleotidsequenzen für
die quantitative real time-PCR wurden mit dem Programm Beacon Designer 2
(PREMIER Biosoft International, Palo Alto, CA, USA) generiert.
2.2 Methoden
Für alle Lösungen, Medien oder Puffer finden sich die genauen Zusammensetzungen
und Zubereitungsangaben in Kapitel 2.1.3 und 2.1.4. Die Bezugsquellen für verwendete
Reagenziensets sind in Kapitel 2.1.7 aufgeführt.
2.2.1 Anzuchtbedingungen
Zur Stammhaltung wurden die Bakterien auf Agarplatten kultiviert, welche falls nötig
mit Antibiotikum supplementiert wurden. Staphylokokkenstämme wurden auf Blutagar,
E. coli Stämme auf LB-Agar kultiviert und circa alle zwei Wochen überimpft. Die
Kultivierung der Bakterien erfolgte, soweit nicht gesondert angegeben, bei 37 °C in
einem Brutschrank (Agarkulturen) oder als Flüssigkultur, schüttelnd in einem Schüttelinkubator
bei 150 Upm. Zur Selektion wurden Antibiotika, sofern nicht anderweitig
angegeben, in folgenden Konzentrationen eingesetzt: Ampicillin 100 µg/ml, Chloramphenicol
10 µg/ml, Erythromycin 50 µg/ml. Für die langfristige Aufbewahrung
wurden die Bakterien in 500 µl Einfriermedium suspendiert und bei -80 °C gelagert.
Flüssigkulturmedien wurden für Induktionsversuche der Biofilmbildung mit 4 %
(wt/vol) NaCl, bzw. 2, 3 und 4 % (vol/vol) Ethanol supplementiert.
2.2.2 Quantifizierung der Biofilmbildung
Die Fähigkeit zur Biofilmbildung von S. epidermidis wurde mit Hilfe des nach
Christensen 42 modifizierten, semiquantitativen Tests in einer 96-Loch-Zellkulturplatte
evaluiert. Für die Vorkultur wurden 2 ml TSB∅ mit einer Kolonie des zu unter-

2 Material und Methoden 30
suchenden Stammes von einer frisch über Nacht kultivierten Blutagar-Platte beimpft
und für 18 bis 24 h bei 37 °C im Schüttelinkubator kultiviert. Die Vorkultur wurde im
Verhältnis 1:100 in 2 ml des Mediums, welches für die Hauptkultur verwendet wurde
verdünnt. Das Medium der Hauptkultur wurde je nach Bedarf mit unterschiedlichen
Konzentrationen von NaCl und Ethanol supplementiert. Pro zu untersuchendem Stamm
wurden jeweils vier Näpfe der Zellkulturplatte (Nuclon Delta Oberfläche, Nunc) mit
200 µl der Hauptkultur beimpft und mit Folie abgeklebt, um ein Verdunsten des
supplementierten Ethanols zu vermeiden. Nach einer Inkubationsperiode von 20 bis
22 h bei 37 °C im Brutschrank wurde die Platte kräftig ausgeschlagen, jede Vertiefung
viermal mit je 200 µl PBS gespült und erneut kräftig ausgeschlagen. Die Platte wurde
anschließend über Nacht bei Raumtemperatur oder für vier Stunden bei 37 °C
getrocknet, und der adhärente Biofilm wurde für 5 min mit je 50 µl Gentianaviolettlösung
angefärbt. Die Platte wurde unter fließendem Wasser gründlich gespült, erneut
kräftig ausgeschlagen und bei Raumtemperatur getrocknet. Zur Quantifizierung des
gebildeten Biofilms wurde die Intensität der Färbung durch Messung der Absorption bei
570 nm (A 570 ) in einem BEPII-Photometer im evaluation mode 3 bestimmt. Die
Ergebnisse von vier parallelen Messungen wurde gemittelt und eine A 570 von größer
oder gleich 0,1 wurde als Biofilm-positiv gewertet. Bei Versuchen zur Induzierbarkeit
der Biofilmbildung wurden die Stämme als induzierbar gewertet, deren gemittelte A 570
sich mindestens verdoppelte, beziehungsweise die ausgehend von einem ursprünglich
Biofilm-negativen Phänotyp den Grenzwert der A 570 von 0,1 nach Induktion
überschritten.
2.2.3 Immunfluoreszenztest zur Identifikation von PIA
Um PIA an Zellen und Zellclustern direkt nachzuweisen, wurde ein Immunfluoreszenztest
mit Hilfe eines spezifischen Anti-PIA-Antiserums 173, 178 und eines fluoreszenzmarkierten
Zweitantikörpers durchgeführt. Zur besseren Darstellung wurden die Zellen
abschließend mit einem nukleinsäurebindenden Farbstoff gegengefärbt (SYTO 61).
Eine Vorkultur in 2 ml TSB∅ wurde für 18 bis 24 h bei 37 °C im Schüttelinkubator
kultiviert und im Verhältnis 1:100 in 10 ml des jeweiligen Mediums der Hauptkultur
verdünnt. Das Medium der Hauptkultur wurde je nach Bedarf mit unterschiedlichen
Konzentrationen von NaCl und Ethanol supplementiert. Die Hauptkultur wurde in eine
Zellkulturschale überführt (∅ 9 cm, Nuclon Delta Oberfläche, Nunc) und für 20 bis
22 h bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Mit Hilfe eines Zellschabers (Nunc) konnten

2 Material und Methoden 31
die Zellen von der Oberfläche gelöst und in PBS mit einer optischen Dichte bei 570 nm
(OD 570 ) von 0,2 bis 0,3 resuspendiert werden. Je 20 µl dieser Bakteriensuspension
wurden auf die Felder eines Objektträgers für Immunfluoreszenz (bioMérieux, Marcy
l`Etoile, Frankreich) aufgebracht und bei Raumtemperatur getrocknet. Die Proben
wurden für zwei Minuten in eiskaltem Aceton fixiert und erneut getrocknet. Es wurde
auf jedes Feld 20 µl des 1:50 in PBS verdünnten Anti-PIA-Antiserums aufgetragen und
für 30 min bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubiert. Anschließend wurden die
Objektträger dreimal für je drei Minuten in PBS gewaschen und getrocknet. Es folgte
eine weitere Inkubation für 30 min bei 37 °C in der feuchten Kammer mit je 20 µl 1:80
in PBS verdünntem Anti-Kaninchen-IgG-FITC-Konjugat. Anschließend wurden die
Objektträger zweimal für je drei Minuten in PBS sowie einmal in VE Wasser
gewaschen und getrocknet. Abschließend wurden die Proben für 30 min mit je 20 µl
5 µM SYTO 61 inkubiert, kurz mit VE Wasser gespült und getrocknet. Die
Objektträger wurden mit Glycerin benetzt und mit einem konfokalen Lasermikroskop
(TCS SP2 AOBS) ausgewertet und dokumentiert.
2.2.4 Populationsanalyse der Oxacillin Resistenz
Die zu untersuchenden Stämme wurden über Nacht auf Blutagar-Platten subkultiviert
und anschließend zu einer OD 570 von 1 – 1,1 suspendiert 122, 177 . Dieses entsprach circa
1 x 10 9 Kolonie bildenden Einheiten (KBE)/ml. Mit Hilfe eines WASP 2 Spiral Platers
wurden die Proben auf Müller-Hinton-Agarplatten, welche mit 2 % NaCl, sowie mit
Oxacillin in unterschiedlichen Konzentrationen (0 - 400 µg/ml) supplementiert waren,
ausplattiert. Der Spiral Plater brachte hierbei in einer archimedischen Spirale, zentrifugalwärts
immer kleiner werdende Volumina der Bakteriensuspension auf der Agarplatte
aus. Anhand einer Schablone konnte so, gemäß den Herstellerangaben, nach einer
Inkubationszeit von 48 h bei 37 °C die Zahl der KBE/ml, der bei einer bestimmten
Oxacillin Konzentration überlebenden Population ausgezählt werden.
2.2.5 Präparation chromosomaler DNA aus S. epidermidis
Zur Extraktion chromosomaler DNA wurde das QIAamp DNA Mini Kit mit einem
leicht modifizierten Protokoll verwendet 170 . Die Stämme wurden in 2 ml BHI,
gegebenenfalls unter entsprechender Antibiotikaselektion, bei 37 °C für 16 bis 20 h im
Schüttelinkubator kultiviert. Durch Zentrifugation (1 min, 16.000 x g, Raumtemperatur)
wurden 500 µl der Bakterienkultur geerntet, anschließend wurde das entstandene Pellet

2 Material und Methoden 32
in 180 µl TE-Puffer pH 7,0 resuspendiert. Nach Zugabe von 5 µl Lysostaphin
(1.500 U/ml) wurde die Zellwand für 30 min bei 37 °C lysiert. Anschließend wurden
180 µl ATL-Puffer, sowie 20 µl Proteinase K hinzugefügt, durch Vortexen vermischt
und für zwei Stunden bei 56 °C inkubiert. Nach Zugabe von 200 µl AL-Puffer wurde
die Probe für 10 Minuten bei 70 °C inkubiert, anschließend mit 200 µl Ethanol (96%)
versetzt und die DNA an die im Kit enthaltene Silicatmatrix adsorbiert. Nach zwei
Waschschritten mit jeweils 500µl AW1 und AW2-Puffer wurde die DNA in 200 µl AE-
Puffer eluiert und bei -20 °C gelagert.
2.2.6 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) ist eine Standardmethode
zur Amplifikation von DNA Fragmenten 229 . Dabei dient doppelsträngige DNA
als Vorlage (template). Zwei zu den Einzelsträngen komplementäre, gegenläufige
(forward und reverse) Oligonukleotide, die sogenannten Primer, dienen der DNA-Polymerase
als Start. Durch abwechselnde Zyklen von Denaturierung der DNA, Anlagerung
der Primer (annealing) und Synthese des komplementären Stranges kommt es zur exponentiellen
Amplifikation des vorliegenden Fragments. Die Standard-PCRs wurden mit
Hilfe des DyNazyme DNA Polymerase Kits in einem Primus 96 Thermocycler durchgeführt.
In einem 50 µl Ansatz wurden ca. 25-100 ng template-DNA, je 10 pmol
forward- und reverse Primer, 5 µl Optimized-DyNAzyme-Puffer, Desoxynukleotide
(dNTPs) in einer Konzentration von je 200 µM und 1 U Polymerase eingesetzt. Initial
wurde die DNA 2 min bei 94 °C denaturiert, in den anschließenden Zyklen nur für 30 s.
Die annealing Temperatur betrug in Abhängigkeit von den verwendeten Primern
zwischen 51 und 64 °C für eine Dauer von 30 s. Der Zweitstrang wurde bei 72 °C
synthetisiert, wobei sich die Dauer nach der Länge des zu amplifizierenden DNA Fragments
richtete und mit 40 s/kb angesetzt wurde. Nach 30 Zyklen schloss sich eine
siebenminütige Synthesephase an, um eine vollständige Komplementierung aller
Einzelstränge zu gewährleisten. Abschließend wurden die Proben auf 4 °C abgekühlt
und bei dieser Temperatur bis zur weiteren Verwendung gelagert. Zur Kontrolle der
PCR fand anschließend eine Agarosegelelektrophorese (Kapitel 2.2.10) statt. Wenn die
amplifizierte DNA kloniert oder sequenziert werden sollte, so wurde die Expand High
Fidelity Polymerase, welche eine 3'-5' exonuklease proofreading Aktivität besitzt,
gemäß Herstellerangaben verwendet.

2 Material und Methoden 33
2.2.7 Klonierung
Die Klonierung von PCR-Amplifikaten erfolgte mit Hilfe des TOPO TA Cloning Kits
nach Herstellerangaben. Hierbei besitzt der linearisierte Vektor pCR2.1 TOPO
beidseitig 3´-Thymidin-Überhänge, sowie eine kovalent gebundene Topoisomerase I 243 .
Das Amplifikat hingegen besitzt 3´-Adenosin-Überhänge, da die in der PCR Reaktion
verwendete Polymerase eine terminale Transferase Aktivität besitzt. Mit Hilfe der
Topoisomerase I wurden Vektor und Amplifikat ligiert und anschließend in chemisch
kompetente E. coli TOP10 Zellen transformiert. Da die multiple cloning site des
Vektors in einem lacZ Gen liegt, konnten Klone mit erfolgreicher Insertion anhand Ihrer
weißen oder nur leicht bläulichen Koloniefärbung (blue/white screening) 230 identifiziert
werden. Es wurden 1 µl PCR Produkt zusammen mit 1 µl Salt Solution (im Kit
enthalten), 1 µl pCR2.1 TOPO Vektor und 3 µl sterilem H 2 O für 5 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert. 80 µl chemisch kompetente E. coli TOP10 Zellen wurden auf Eis
aufgetaut, mit 2 µl des Ligationsansatzes durch vorsichtiges Schwenken vermengt und
für 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für 30 s einem
Hitzeschock von 42 °C im Wasserbad ausgesetzt und danach erneut auf Eis gestellt. Die
Zellen wurden mit 250 µl SOC-Medium versetzt und für eine Stunde bei 37 °C unter
Schütteln inkubiert. Je 50 µl Transformationsansatz wurden auf LB-Agarplatten
ausplattiert, die zur Selektion 100 µg/ml Ampicillin enthielten und zuvor mit 40 µl
X-Gal beschichtet worden waren. Nach 24 h Bebrütung bei 37 °C konnten die Klone
mit erfolgreicher Insertion durch ihre Koloniefärbung identifiziert und nach einer Subkultivierung
genauer analysiert werden.
2.2.8 Plasmidpräparation aus E. coli und Staphylokokken
Die Präparation von Plasmid DNA erfolgte mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kits,
wobei der Zellaufschluß bei dieser Methode durch alkalische Lyse nach Birnboim und
Doly erfolgt 26 . Hierbei wird die chromosomale DNA denaturiert und im Komplex mit
Proteinen und Zelltrümmern präzipitiert, wobei sie von der in Lösung verbleibenden
Plasmid-DNA getrennt werden kann. Ein höherer Reinheitsgrad wird dadurch erreicht,
dass die Plasmid-DNA nach dem Entfernen der Proteine und Zelltrümmer in Anwesenheit
hoher Salzkonzentrationen an eine Silicatmatrix adsorbiert wird. Die anschließende
Elution der DNA erfolgte in salzarmem Puffer. Für die Plasmidpräparation aus E. coli
wurden die Zellen unter entsprechender antibiotischer Selektion für 16 bis 20 h in 2 ml
LB-Medium als Schüttelkultur bei 37 °C kultiviert. In der Regel wurde 1 ml der Kultur

2 Material und Methoden 34
durch Zentrifugation in einem Eppendorfreaktionsgefäß pelletiert und in 250 µl P1-
Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von 250 µl P2 und 350 µl N3-Puffer wurde die
Probe für 10 Minuten (16.000 x g, Raumtemperatur) zentrifugiert und der Überstand auf
die im Kit enthaltene Silicatmatrix gegeben. Nach zwei Waschschritten mit 500 µl PB
und 750 µl PE-Puffer konnte die Plasmid DNA in 50 µl EB-Puffer eluiert werden.
Zur Plasmidpräparation aus Staphylokokken wurde das Protokoll modifiziert, da sich
ihre Zellwand durch das oben beschriebene Verfahren nicht ohne weiteres aufschließen
ließ. Die Stämme wurden in 2 ml BHI, gegebenenfalls unter entsprechender Antibiotikaselektion
bei 37 °C für 16 bis 20 h im Schüttelinkubator kultiviert. Durch
Zentrifugation (1 min, 16.000 x g, Raumtemperatur) wurden 1000 µl der Bakterienkultur
geerntet. Anschließend wurde das entstandene Pellet in 250 µl P1-Puffer
resuspendiert und 5 µl Lysostaphin (1.500 U/ml) hinzugefügt. Nach einer Inkubationsphase
von 30 min bei 37 °C wurde gemäß dem oben beschriebenen Protokoll fortgefahren.
2.2.9 Restriktionsverdau von Plasmid DNA
Restriktionsendonukleasen erkennen spezifische Basensequenzen in einem DNA-
Doppelstrang und schneiden beide Stränge an definierten Stellen (Restriktionsverdau)
230 . Zur Restriktionsspaltung von präparativen Ansätzen wurden 10 bis 20 µg
Plasmid DNA und je 1 µl der entsprechenden Restriktionsenzyme in einem Gesamtreaktionsvolumen
von 50 µl eingesetzt. Für alle in dieser Arbeit verwendeten Kombinationen
von Restriktionsenzymen wurde die einfache Konzentration des One-Phor-All
Buffer PLUS verwendet. Der Ansatz wurde 22 h bei 37 °C inkubiert, anschließend
wurde die vollständige Spaltung durch Gelelektrophorese in 0,7 % Agarosegel
kontrolliert (Kapitel 2.2.10). Analytische Restriktionsverdaue wurden mit 0,5 bis 1 µg
Plasmid DNA in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 µl mit je 0,5 µl Restriktionsenzym
angesetzt und eine Stunde bei 37 °C inkubiert.
2.2.10 Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA
Mittels horizontaler Gelelektrophorese wurden Fragmente gespaltener Plasmide oder
Amplifikate aus PCR Reaktionen nach ihrer Ladung, Größe und Konformation in einem
elektrischen Feld aufgetrennt 230 . Je nach Größe der zu separierenden Fragmente wurden
0,7 bis 2 %ige [w/v] Agarosegele verwendet. SeaKem ME Agarose wurde in 100 ml
0,5 x TBE-Puffer aufgekocht, abgekühlt, mit 3,3 µl 1 %iger Ethidiumbromid-Lösung

2 Material und Methoden 35
versetzt und in einen Gelträger mit Kamm gegossen. Die Proben wurden mit 3 µl DNA
Gelladepuffer vermischt und in die Taschen des ausgehärteten und mit 0,5 x TBE-
Puffer überschichteten Gels pipettiert. Als Größenstandard wurden in die jeweils
äußersten Geltaschen 2,5 µl eines λ Phagen DNA -HindIII und øX174 Phagen DNA -
HaeIII Verdaus mitgeführt. Eine Auftrennung erfolgte je nach Größe der zu
analysierenden Fragmente bei konstanter Spannung von 1-6 V/cm. Die Gele wurden auf
einem UV-Transilluminator mit einer angeschlossenen digitalen CCD-Kamera (GelCam
Photodokumentationssystem) dokumentiert.
2.2.11 Extraktion von DNA Fragmenten aus Agarosegelen
DNA Fragmente wurden aus Agarosegelen mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kits
extrahiert. Dafür wurde die gewünschte Bande mit einem Skalpell auf einem UV-Transilluminator
aus dem mit Ethidiumbromid gefärbten Gel ausgeschnitten und auf einer
Feinwaage gewogen. Der Agaroseblock wurde in ein Eppendorfröhrchen überführt,
gewichtsadaptiert mit QG-Puffer (300 µl Puffer pro 100 mg Agarosegel) versetzt und
bei 50 °C geschmolzen. Nach Hinzugabe von Isopropanol (100 µl pro 100 mg
Agarosegel) wurde die DNA Salz- und pH-Wert abhängig an eine Silicatmatrix adsorbiert.
Kontaminationen wurden durch zwei Waschschritte mit 500 µl QG-Puffer und
750 µl PE-Puffer eliminiert. Abschließend wurde die DNA in 50 µl EB-Puffer eluiert
und die Integrität der eluierten DNA mittels Gelelektrophorese überprüft.
2.2.12 Ligation
Ligationen wurden durchgeführt zur Zusammenstellung der Konstrukte für den homologen
Genaustausch und um die fertigen Konstrukte in den temperatursensitiven
Shuttlevektor pBT2 34 zu integrieren. Um eine Autoligation des linearisierten Vektors zu
vermeiden, wurden die freiliegenden 5' Enden des Vektors mit einer Shrimp alkaline
Phosphatase (SAP) dephosphoryliert. Hierfür wurden 45 µl aus dem Ansatz des
Restriktionsverdaus (Kapitel 2.2.9) mit 1 U SAP, 6 µl SAP-Puffer und 8 µl H 2 O für
90 min bei 37 °C inkubiert. Vor der Ligation wurden alle Enzyme durch Erhitzen auf
65 °C für 15 min inaktiviert und im Verhältnis 1:3 verdünnt. Für die Ligation wurden
1 µl des verdünnten Vektors mit der mit entsprechenden Restriktionsenzymen
gespaltenen und aufgereinigten DNA des Inserts in den Verhältnissen 1:3, 1:1 und 3:1
vermischt. Auf Eis wurden 1 U T4-DNA-Ligase und 1 µl Ligase Puffer hinzugefügt,

2 Material und Methoden 36
mit sterilem H 2 O auf 10 µl Gesamtreaktionsvolumen aufgefüllt und bei 16 °C für 22 h
inkubiert.
2.2.13 Elektroporation von E. coli
Um Bakterienzellen elektrisch transformieren zu können, muss die Bakterienzellsuspension
möglichst salzfrei sein. Zur Herstellung solcher elektrokompetenten E. coli
Zellen wurde eine Vorkultur in 10 ml LB-Medium für 16 h bei 37 °C im Schüttelinkubator
kultiviert. 250 ml LB-Medium wurden mit dieser Vorkultur inokuliert, bei
37 °C im Schüttelinkubator kultiviert und beim Erreichen einer OD 570 von 0,5 bis 0,6
für 15 min in einem Eiswasserbad abgekühlt. Die im Folgenden benutzten sterilen
Gefäße, Lösungen und Zentrifugen waren alle vorgekühlt und die Zentrifugationsschritte
wurden bei 4 °C durchgeführt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation für
15 min bei 5.155 x g geerntet und das Pellet dreimal in je 250 ml sterilem aqua bidest
gewaschen. Anschließend wurde das Pellet in 20 ml sterilem 10 % Glycerin resuspendiert,
in ein 50 ml Falcon-Röhrchen überführt und mit 4.332 x g zentrifugiert. Das
entstandene Pellet wurde in 2 ml sterilem 10 % Glycerin aufgenommen, in 80 µl
Portionen in Eppendorfröhrchen aliquotiert und bei -80 °C bis zur Elektroporation
gelagert.
Bei der Elektrotransformation wird durch Anlegen einer Spannung kurzzeitig die Zellwand
der Bakterien perforiert, so dass fremde DNA aufgenommen werden kann 59 . Die
Elektrotransformationen erfolgten mit dem Elektroporator Gene-Pulser II. Für die
Elektroporation wurden 0,5 bis 1 µl des zu transformierenden Plasmids zu den auf Eis
aufgetauten E. coli Zellen gegeben, vorsichtig vermischt und für 30 min ebenfalls auf
Eis inkubiert. Die Zellsuspension wurde in eine vorgekühlte 0,1 cm Elektroporationsküvette
überführt und sofort unter folgenden Bedingungen elektroporiert: 200 Ω
Widerstand, 2,0 bis 2,5 kV Spannung, 25 µF Kapazität. Im Anschluss wurden 250 µl
SOC-Medium direkt in die Küvette pipettiert, mit den Zellen vermischt und die Zellsuspension
in ein Reagenzglas überführt. Nach einer Inkubationsperiode von 1 h bei
37 °C im Schüttelinkubator wurden je 50 bis 100 µl der Zellsuspension auf LB-Agar
mit entsprechender Antibiotikaselektion ausplattiert und für 24 h bei 37 °C inkubiert.
Die entstandenen Klone wurden gepickt, subkultiviert und mittels PCR (Kapitel 2.2.6)
und Restriktionsverdau (Kapitel 2.2.9) eingehender analysiert.

2 Material und Methoden 37
2.2.14 Elektroporation von Staphylokokken
9, 151
Für die Präparation elektrokompetenter Staphylokokken wurden
die Stämme
zunächst als Vorkultur in 5 ml B2-Brühe bei 37 °C für 16 h im Schüttelinkubator
kultiviert. 24 ml B2-Brühe wurden mit 1 ml der Vorkultur inokuliert und bei 37 °C im
Schüttelinkubator bis zu dem Erreichen einer OD 570 von 0,6 bis 0,8 kultiviert. Die im
Folgenden benutzten sterilen Gefäße, Lösungen und Zentrifugen waren alle vorgekühlt
und die Zentrifugationsschritte wurden bei 4 °C durchgeführt. Die Zellen wurden in
einem 50 ml Falcon-Tube für 15 min bei 4.332 x g zentrifugiert und dreimal mit je
25 ml destilliertem Wasser gewaschen. Das Zellpellet wurde anschließend in 5 ml
sterilem 10 % Glycerin resuspendiert, in ein 14 ml Falcon-Röhrchen überführt und
erneut durch Zentrifugation für 15 Minuten bei 4.332 x g pelletiert. Das Pellet wurde
nochmals mit 2,5 ml sterilem 10 % Glycerin gewaschen. Das gewaschene Pellet wurde
abhängig von der Ausgangs-OD 570 in 600 bis 800 µl sterilem 10 % Glycerin resuspendiert
(circa 10 9 Zellen pro ml). Die elektrokompetenten Zellen wurden für die anschließende
Elektroporation in 70 µl Portionen in Eppendorfröhrchen aliquotiert.
Elektrokompetente Zellen von S. aureus RN4220 wurden ohne entscheidende
Verringerung der Transformationseffizienz bei –80 °C gelagert, während elektrokompetente
Zellen von S. epidermidis M15 in der Regel frisch verwendet wurden.
Für die Elektroporation der Zellen wurde einem Aliquot elektrokompetenter Zellen 1
bis 2 µl einer Plasmidpräparation zugegeben und das Gemisch circa 30 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Anschließend wurden die Zellen in eine 0,1 cm Elektroporationsküvette
überführt und unter folgenden Bedingungen bei Raumtemperatur elektroporiert:
100 Ω Widerstand, 2,0 bis 2,3 kV Spannung, 25 µF Kapazität. Nach Zugabe von 390 µl
B2-Brühe wurde die Suspension in ein Reagenzglas überführt und bei 37 °C im
Schüttelinkubator für 1 h inkubiert. Je 100 µl wurden auf NYE-Agar mit entsprechender
Antibiotikaselektion ausplattiert und für 24 bis 48 h bei lediglich 30 °C inkubiert, um
eine Eliminierung des temperatursensitiven E. coli/Staphylococcus Shuttlevektors
pBT2 34 zu vermeiden.
2.2.15 Herstellung von Phagenlysaten
Für die Herstellung der Phagenlysate 170 aus S. epidermidis wurden Vorkulturen der
jeweiligen Stämme in 5 ml NB2+ Brühe über Nacht im Schüttelinkubator (150 Upm)
inkubiert. Stämme mit dem temperatursensitiven Shuttlevektor pBT2 wurden bei 30 °C
unter Chloramphenicol Selektion (10 µg/ml) kultiviert, während Deletionsmutanten bei

2 Material und Methoden 38
37 °C unter Selektion von Erythromycin (50µg/ml) und Wildtyp Stämme ohne antibiotische
Selektion bei 37 °C angezüchtet wurden. Für die Hauptkultur wurde NB2+
Brühe im Verhältnis 50:1 mit der Vorkultur inokuliert und unter Selektion von Chloramphenicol
(1 µg/ml), beziehungsweise Erythromycin (2,5 µg/ml) in einem Schüttelinkubator
(150 Upm) bis zu einer OD 570 von 0,1 bis 0,2 inkubiert. Diese OD 570
entsprach einer Zellkonzentration von circa 5 x 10 7 KBE/ml.
STA-Softagar wurde in einer Mikrowelle aufgekocht und im Wasserbad auf 46 °C abgekühlt.
3 ml STA-Softagar wurden mit 500 µl der Bakteriensuspension, 2 x 10 5 Plaque
bildenden Einheiten (PBE) des S. epidermidis Phagen 71 (Φ71) vermischt und auf einer
STA-Agarplatte ausplattiert. Pro Stamm wurden 3 STA-Agarplatten vorbereitet und
nach dem Aushärten bei 30 °C für 24 h im Brutschrank inkubiert.
Es wurden je 5 ml NB2+ Brühe auf die Platten gegeben, der Softagar mit Hilfe eines
sterilen Glasspatels von der STA-Agarplatte abgelöst und zerkleinert. Der Softagar von
jeweils 3 Platten wurde zusammen mit der NB2+ Brühe mit einer Glaspipette aufgenommen
und in ein 50 ml Falcon Tube überführt. Durch kräftiges Schütteln der
NB2+/Softagarsuspension konnten die Phagen aus dem Softagar extrahiert werden.
Durch Zentrifugation für 15 min bei 4.332 x g, 4 °C wurden der Agar und die Bakterien
von der Phagensuspension getrennt. Der geklärte Überstand wurde in ein frisches
Röhrchen überführt und erneut für 15 min bei 4.332 x g, 4 °C zentrifugiert. Der Überstand
wurde steril-filtriert (Sterilfilter Porengröße 0,2 µm) und zur baldigen Verwendung
bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahrt oder bei -80 °C gelagert.
Um den erreichten Phagentiter bestimmen zu können, wurde das Phagenlysat zehnerlogarithmisch
von 10 -6 bis 10 -9 in NB2+ verdünnt. Je 1 ml der Phagenverdünnung
wurde mit 3 ml STA-Softagar (46 °C) und 0,5 ml einer Suspension von S. epidermidis
1457 mit einer OD 570 von 0,1 bis 0,2 vermischt und auf einer STA-Agarplatte ausplattiert.
Nach einer Inkubation von 24 h bei 30 °C konnte durch Auszählen der
entstandenen Plaques unter Berücksichtigung der Vorverdünnung der Phagentiter
berechnet werden.
2.2.16 Phagentransduktion
Für die Phagentransduktion 170 wurden 3 Blutagar-Platten mit dem Empfängerstamm inokuliert
und über Nacht bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Mit einem sterilen Wattetupfer
wurde der Bakterienrasen von der Agarplatte aufgenommen und bis zu einer
OD 570 von 11 (0,5 bis 1 x 10 10 KBE/ml) in NB2+ Brühe suspendiert. Zu 1 ml dieser

2 Material und Methoden 39
Suspension wurde eine geeignete Verdünnung des Phagenlysates hinzugegeben, so dass
sich ein Phagen-Bakterien-Verhältnis (multiplicity of infection, MOI) von 0,1 bis 1
ergab. Die Suspension wurde für 30 min bei 37 °C im Schüttelinkubator (150 Upm) inkubiert,
anschließend wurde die Absorption der Phagen durch Zugabe von 40 µl 1 M
Natriumcitrat gestoppt und die Bakterien für 15 min bei 4.332 x g, 4 °C zentrifugiert.
Das Pellet wurde zweimalig in 2 ml BHI mit 20 mM Natriumcitrat gewaschen, anschließend
in 3 ml des gleichen Mediums resuspendiert und für 1 h bei 37 °C in einem
Schüttelinkubator (150 Upm) inkubiert. BHI-Softagar mit 20 mM Natriumcitrat wurde
aufgekocht, im Wasserbad auf 46 °C abgekühlt, mit der Suspension vermischt und auf
einer BHI-Agarplatte ausplattiert. Zur Selektion des pBT2 Vektors wurden Softagar und
Agarplatten mit 10 µg/ml Chloramphenicol versetzt und für bis zu 72 h bei 30 °C
bebrütet, während zur Selektion von Deletionsmutanten Softagar und Agarplatten mit
10 µg Erythromycin verwendet und für bis zu 48 h bei 37 °C inkubiert wurden.
2.2.17 Homologer Genaustausch in S. epidermidis
Homologer Genaustausch 161 wurde verwendet, um einzelne Gene gezielt zu inaktivieren.
Die dafür erforderlichen Klonierungsschritte wurden in dem Plasmid pCR2.1
und dem E. coli/Staphylokokken Shuttlevektor pBT2 in E. coli TOP10 durchgeführt.
Zunächst wurden die chromosomalen DNA Abschnitte, welche die zu inaktivierenden
Gene flankieren, amplifiziert und in dem Plasmid pCR2.1 subkloniert (Abbildung 2.1).
Abbildung 2.1
Schematische Darstellung der für den homologen Genaustausch amplifizierten Fragmente.
Schwarze Pfeile stellen die Gene des σ B Operons, graue Pfeile stellen die
amplifizierten flankierenden Genabschnitte dar (Tabelle 2.6). Vertikale Linien
markieren die Lage der jeweils verwendeten Primer (Tabelle 2.5) im σ B Operon.

2 Material und Methoden 40
Hierfür wurde eine High Fidelity Polymerase PCR mit chromosomaler DNA von S. epidermidis
1457 als Template und den in Tabelle 2.5 aufgeführten Primern verwendet.
Ebenso wurde die Erythromycin Resistenzkassette (erm) des Transposon Tn917 amplifiziert
und subkloniert, um später Klone mit erfolgreicher homologer Rekombination
selektionieren zu können.
Bei Fragmenten, an deren 5´-Ende die Resistenzkassette kloniert werden sollte, wurden
mittels Restriktionsverdau mit KpnI und anschließender Gelelektrophorese die korrekte
Orientierung im pCR2.1 Plasmid überprüft. Außerdem wurden in diesen Plasmiden
durch Verdau mit KpnI und Religation der Plasmide störende EcoRI, BamHI und SacI
Restriktionsschnittstellen eliminiert (Abbildung 2.2). Im Folgenden wurde die Erythromycin
Resistenzkassette (erm) nach Restriktionsverdau mit EcoRI und NheI in diese
Plasmide ligiert. Nach einem Endonucleaseverdau mit EcoRI und SacI wurden anschließend
die entsprechenden 5´-flankierende Fragmente in die Plasmide ligiert und in
E. coli TOP10 transformiert. Mittels Restriktionsverdau mit BamHI und HindIII wurden
die kompletten Konstrukte aus dem pCR2.1 Vektor ausgeschnitten, anschließend in den
temperatursensitiven E. coli/Staphylokokken Shuttlevektor pBT2 ligiert und durch
Elektroporation (Kapitel 2.2.13) in E. coli TOP10 transformiert.
Abbildung 2.2 Klonierungsstrategie zur Erstellung der Plasmide für den homologen Genaustausch.
Alle benötigten Fragmente wurden amplifiziert und in den pCR2.1 Vektor ligiert.
Störende Schnittstellen wurden durch KpnI Verdau mit anschließender Religation eliminiert.
Nach entsprechenden Endonuklease-Verdauen wurden die fehlenden Fragmente
konsekutiv in den pCR2.1 Vektor ligiert. Abschließend wurde das Konstrukt mittels
EcoRI und BamHI Verdau exzidiert und in den temperatursensitiven E. coli / Staphylokokken
Shuttlevektor pBT2 ligiert.

2 Material und Methoden 41
Da die aus E. coli TOP10 aufgereinigten Plasmide nicht direkt in die S. epidermidis
Zielstämme transformiert werden konnten, wurden die Shuttleplasmide zunächst mittels
Elektroporation in den restriktionsdefizienten Staphylokokkenstamm S. aureus RN4220
transformiert (Kapitel 2.2.14). Die aus diesem Stamm extrahierten Plasmide konnten
wiederum mittels Elektroporation in den Stamm S. epidermidis M15 transformiert und
von hier aus mit Hilfe von Phagentransduktion in die gewünschten Zielstämme
transduziert werden. Eine Vorkultur der jeweiligen Stämme wurde in 5 ml Müller
Hinton Brühe mit 50 µg/ml Erythromycin über Nacht bei 30 °C im Schüttelinkubator
(150 Upm) kultiviert. Die Vorkultur wurde im Verhältnis 1:5000 im gleichen Medium
verdünnt, und auf TSB-Agarplatten mit Erythromycin (50 µg/ml) ausplattiert. Durch
Kultivierung bei einer, für das temperatursensitive Plasmid pBT2 nicht permissiven
Temperatur (42 °C) konnten Klone mit einer erfolgreichen Insertion des erm Gens
selektioniert werden. Die Klone wurden mit einem Zahnstocher aufgenommen und auf
einer TSB-Agarplatte mit Chloramphenicol (10 µg/ml), sowie auf einer TSB-Agarplatte
mit Erythromycin (50 µg/ml) ausgestrichen. Mutanten mit einer erfolgreichen
homologen Rekombination konnten so durch den Verlust des Resistenzmarkers des
pBT2 Plasmids (Chloramphenicol), bei gleichzeitig erhaltener Erythromycin-Resistenz,
identifiziert werden. Abschließend wurde die korrekte Insertion mittels PCR validiert.
Bei den verwendeten Primerpaaren lag jeweils ein Primer innerhalb der erm Kassette,
wohingegen der zweite Primer jeweils außerhalb der manipulierten Region lag (Tabelle
2.5, Abbildung 2.3). Zum Ausschluss neu induzierter Mutationen wurden die
manipulierten Bereiche außerdem sequenziert und auf ihre Integrität überprüft.
Abbildung 2.3
Schematische Darstellung der Primerlokalisation. Gerade Pfeile stellen die Gene des σ B
Operons und der Erythromycin Resistenzkassette (erm) dar. Geknickte Pfeile markieren
die Lage der Primer im σ B Operon (Tabelle 2.5). Es wurde jeweils der Primer erm.for
beziehungsweise erm.rev in Kombination mit einem der oben gezeigten Primern
verwendet (siehe auch Abbildung 3.2). Anhand der Größe der entstehenden
Amplifikate, konnte auf die Lokalisation der Erythromycin Resistenzkassette zurückgeschlossen
werden (Abbildung 3.1).

2 Material und Methoden 42
2.2.18 Sequenzierung von DNA
Die durchgeführten Sequenzierungen von DNA basierten auf einer modifizierten
Didesoxy-Kettenabbruch-Methode nach Sanger 231, 232 . Es wurde das ABI PRISM dGTP
BigDye Terminator Ready Reaction Kit gemäß den Herstellerangaben verwendet. Zunächst
wurde der zu sequenzierende Abschnitt mit der Expand High Fidelity Polymerase
(Kapitel 2.2.6) amplifiziert und mit dem QIAquick PCR purification Kit gemäß
den Herstellerangaben von überschüssigen Primern und Nukleotiden bereinigt. Als
Template für die Sequenzierungsreaktion wurden 5 µl des aufgereinigten Amplifikats
verwendet und mit 10 pmol Primer, 4 µl BigDye (im Kit enthalten) und sterilem H 2 O zu
einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 µl aufgefüllt. Im Primus 96 Thermocycler
wurden die Reaktionen initial für 5 min bei 96 °C denaturiert. Danach wurden
30 Zyklen mit 20 s Denaturierung bei 96 °C, 20 s Oligonukleotidanlagerung bei 50 °C
und 4 min Reaktionszeit bei 60 °C durchgeführt. Anschließend wurden die Reaktionsansätze
gemäß den Herstellerangaben, mittels Ethanol/NaAcetat Präzipitation von
störenden Rückständen gereinigt. Abschließend wurde die Sequenz durch Kapillarelektrophorese
im ABI Prism S310 Sequencer ermittelt und mit dem Programm Vector
NTI ausgewertet.
2.2.19 Präparation von RNA aus S. epidermidis
Um eine Vergleichbarkeit der Experimente zu gewährleisten, wurden für die RNA Extraktionen
aus S. epidermidis dieselben Anzuchtbedingungen gewählt, wie auch schon
für die Immunfluoreszenztests (Kapitel 2.2.3) und die Untersuchungen zur Quantifizierung
der Biofilmbildung (Kapitel 2.2.2). Eine Vorkultur wurde in 5 ml TSB∅ über
Nacht bei 37 °C im Schüttelinkubator (150 Upm) kultiviert. 10 ml TSB Medium
wurden mit 100 µl der Vorkultur inokuliert und in einer 9 cm Zellkulturschale (Nuclon
Delta Oberfläche, Nunc) bei 37 °C im Brutschrank kultiviert. Bei entsprechenden
Experimenten wurde das TSB-Medium der Hauptkultur mit NaCl oder Ethanol
supplementiert. Um eine ausreichende Zellzahl für die RNA Extraktion zu
gewährleisten, wurden in Abhängigkeit des gewählten Zeitpunktes der Zellernte, 1 bis 4
Zellkulturschalen pro Stamm angelegt. Zu entsprechenden Zeitpunkten wurden die Zellkulturschalen
auf Eis gestellt, die Zellen mit Hilfe eines Zellschabers vom Boden der
Zellkulturschale gelöst, mitsamt dem Medium in ein vorgekühltes 50 ml Falcon
Röhrchen überführt und durch Zentrifugation für 5 min bei 4.332 x g, 4 °C pelletiert.
Der Überstand wurde verworfen und die Pellets von Stämmen mit einem Biofilm-

2 Material und Methoden 43
positiven Phänotyp wurden mit 2 ml eiskaltem, sterilem PBS überschichtet, während
Biofilm-negative Stämme mit 3 ml eiskaltem, sterilem PBS überschichtet wurden. Um
die Zellen resuspendieren zu können, wurden sie auf Eis für 10 s bei 70 % Amplitude
mit Ultraschall (Branson Sonifier 250-D mit Microtip) behandelt. Um die RNA zu
stabilisieren, wurden 1,5 ml dieser Zellsuspension zu 3 ml der RNAeasy Lösung gegeben
und für 5 - 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden anschließend
für 10 min, 4.332 x g bei Raumtemperatur pelletiert. Zur Entfernung der extrazellulären
Matrix wurden die Zellen in 10 ml PBS resuspendiert und auf Eis, mit einem zwischengeschalteten
Waschschritt (10 ml PBS), zweimalig mit Ultraschall behandelt (3 x 30 s
mit jeweils 30 s Pause). Anschließend wurden die Zellen für 5 min, 4.332 x g bei Raumtemperatur
pelletiert und der Überstand verworfen. Bei Bedarf wurden die Zellen nach
diesem Schritt bis zur RNA Extraktion bei –20 °C gelagert.
Durch Lysostaphin-Verdau wurde die Zellwand lysiert, zusätzlich wurden die Zellen in
Lysing MatrixB Röhrchen, welche 0,1 mm durchmessende Silikatkügelchen enthalten
homogenisiert. Zur Extraktion der RNA wurde das RNAeasy Protect Bacteria Mini Kit
verwendet. Das Kit basiert auf dem Prinzip, dass Nukleinsäuren in Gegenwart eines
chaotropen Salzes an die Silikatmatrix einer RNeasy-Säule binden. Verunreinigungen
werden durch Waschschritte eliminiert und abschließend wird die RNA mit H 2 O aus der
Säule eluiert.
Die Zellen wurden hierfür in 180 µl TE-Puffer resuspendiert, mit 20 µl Lysostaphinstammlösung
(1.500 U/ml) versetzt und für 10 min bei 37 °C unter Schütteln auf einem
Heizblock inkubiert. Der Probe wurde 700 µl RLT-Puffer mit Mercaptoethanol (1 ml
RLT-Puffer versetzt mit 10 µl Mercaptoethanol) zugegeben und für 15 s gevortext. Der
Ansatz wurde in ein 2 ml Lysing MatrixB Röhrchen überführt und dreimalig für je 20 s
bei maximaler Geschwindigkeit mit dem FastPrep FP120 Gerät homogenisiert. Das
Lysing MatrixB Röhrchen wurde anschließend für 2 min, 16.000 x g bei Raumtemperatur
zentrifugiert und der Überstand in ein neues Eppendorfröhrchen überführt.
Nach Zugabe von 470 µl Ethanol absolut und gründlichem Mischen, wurde die Probe
auf eine RNeasy Spin Säule gegeben und für 15 s, 8.000 x g, Raumtemperatur
zentrifugiert. Die Säule wurde einmal mit 700 µl RW1-Puffer und zweimal mit je
500 µl RPE-Puffer gewaschen. Die RNA wurde mit 50 µl RNase freiem Wasser aus der
Säule eluiert und die Menge der Gesamt-RNA durch Messung der Absorption bei
260 nm bestimmt. Die RNA konnte bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert
werden.

2 Material und Methoden 44
2.2.20 Herstellung Digoxigenin markierter Sonden
Für die Transkriptionsanalyse im Northern Blot wurden zunächst geeignete Sonden
generiert. Hierzu wurden 200 bis 400 bp große Fragmente der zu untersuchenden Gene
durch PCR mit den in Tabelle 2.5 aufgeführten Primern und dem High Fidelity System
amplifiziert und in das pCR2.1 TOPO Plasmid in E. coli TOP10 kloniert. 10 – 100 pg
der aufgereinigten Plasmid DNA wurden als Matrize für die Generierung nichtradioaktiver,
Digoxigenin (DIG) markierter Sonden 136 mit dem PCR DIG Probe Synthesis
Kit verwendet. Der in der PCR-labeling Reaktion verwendete Nukleotidmix enthielt
neben dATP, dCTP und dGTP ebenfalls dTTP und Digoxigenin-11-dUTP (im Verhältnis
3:1). Somit wurden die Digoxigenin markierten Nukleotide während der PCR
Reaktion in die Sonde inkorporiert. Die PCR Reaktion wurde gemäß den Herstellerangaben
durchgeführt, die optimalen annealing Temperaturen für die jeweiligen
Primerpaare wurden in einem Mastercycler gradient Thermocycler ermittelt. Zur
Beurteilung der Qualität der Reaktion wurden jeweils 5 µl der PCR Reaktion auf ein
1,2 % Agarosegel aufgetragen und mit einem Kontroll-PCR-Ansatz, welcher keine
DIG-markierten Nukleotide enthielt verglichen.
2.2.21 Elektrophorese von RNA in denaturierenden Agarosegelen
Um die Bildung von Sekundärstrukturen in der RNA durch intramolekulare Wasserstoff-Brückenbindungen
zu vermeiden, wurde diese unter denaturierenden Bedingungen
163 in einer horizontalen Gelelektrophoresekammer aufgetrennt. Um eine Kontamination
mit RNasen zu minimieren, wurden alle verwendeten Plastikmaterialien vor
Arbeitsbeginn mit 1 M NaOH und 1 M HCl gespült und anschließend mit 70 % EtOH
ausgewischt. In 100 ml 1 x MOPS Puffer wurde 1 % (wt/vol) Agarose durch Aufkochen
gelöst und anschließend im Wasserbad auf 60 °C abgekühlt. Nach Zugabe von 7,5 ml
Formaldehyd (37 %) und 3,3 µl einer 1 %igen Ethidiumbromid-Lösung wurde das Gel
unter einem Abzug gegossen. Je 5 µg Gesamt-RNA der zu untersuchenden Probe wurde
mit dem vierfachen Volumen RNA-Gelladepuffer versetzt, 10 min bei 70 °C denaturiert
und in eine Tasche des ausgehärteten Gels pipettiert. In die jeweils äußersten Taschen
des Gels wurden als Größenstandard 3 µl des DIG markierten RNA Molecular Weight
Marker I pipettiert. Die RNA wurde in 1 x MOPS Puffer bei 70 V Spannung über 3 -
4 h aufgetrennt. Anschließend wurde das Gel dreimalig für je 15 min in 20 x SSC
geschwenkt, um das Formaldehyd auszuwaschen. Abschließend konnte es mit Hilfe
eines UV-Transilluminators mit angeschlossener CCD-Kamera dokumentiert werden.

2 Material und Methoden 45
2.2.22 Transkriptionsanalyse mittels Northern Blot
Die Übertragung der RNA aus dem Formaldehyd-Agarosegel auf eine Nylonmembran
erfolgte mittels kapillaren Transfers 5 in einem hochosmolaren Puffer. Hierfür wurde
zwischen zwei mit 20 x SSC gefüllten Plastikschalen eine Glasscheibe gelegt, auf die
überlappend Filterpapiere aufgelegt wurden. Das Formaldehyd-Agarosegel wurde
blasenfrei auf die Filterpapiere aufgelegt und eine Zeta-probe Membran wurde
vorsichtig blasenfrei mit einer Glaspipette angepresst. Das Gel wurde mit Seranfolie
umsäumt, um einen seitlichen Übertritt des Puffers zu vermeiden. Die Membran wurde
mehrlagig mit in 2 x SSC getränktem Filterpapier sowie trockenem Zellstoff bedeckt
und mit einer Glasscheibe beschwert. Nach einer Transferzeit von 18 h wurde die
Membran kurz in 2 x SSC gewaschen und die RNA durch Backen für 2 Stunden bei
80 °C fixiert.
Für die Hybridisierung wurde die Membran in einen Plastikbeutel eingeschweißt und
zunächst für 30 min im Schüttelwasserbad bei 50 °C in 10 ml/100 cm 2 DIG easy HYB
Lösung prähybridisiert. Die DIG markierte Sonde aus der PCR labeling Reaktion
(Kapitel 2.2.20) wurde in 50 µl H 2 O verdünnt und in einem kochendem Wasserbad für
5 min denaturiert. Anschließend wurde der Ansatz kurz auf Eis abgekühlt und mit auf
50 °C vorgewärmter DIG Easy Hyb Lösung zusammengeführt (2 µl PCR Produkt/ml
Hybridisierungslösung). Die Membran wurde über Nacht im Schüttelwasserbad bei
50 °C in 3,5 ml Hybridisierungslösung pro 100 cm 2 Membran hybridisiert. Die Sonde
wurde anschließend bei -20 °C eingefroren und konnte nach erneuter Denaturierung bis
zu fünf mal wieder verwendet werden. Nicht gebundene, bzw. unspezifisch gebundene
Sonden wurden zweimalig in 2 x SSC / 0,1 % SDS bei Raumtemperatur, zweimalig in
0,1 x SSC / 0,1 % SDS bei 50 °C und abschließend in DIG washing buffer bei Raumtemperatur
von der Membran gewaschen. Die Membran wurde gemäß den Herstellerangaben
mit blocking solution präadsorbiert, um eine unspezifische Bindung des Antikörpers
an die Membran zu vermeiden. Im Folgenden wurde die Membran für 30 min
mit Anti-Digoxigenin-AP Fab Fragmenten inkubiert, welche als Fab Fragmente eines
Anti-Digoxigenin-Antikörpers vom Schaf, konjugiert mit alkalischer Phosphatase an
das Digoxigenin der Sonden binden. Ungebundene Antikörper wurden 2 x 15 min mit
washing solution abgespült, die Membran 5 min in Detektionspuffer äquilibriert und auf
einer Klarsichtfolie ausgelegt. Für die Detektion der hybridisierten Sonden wurde CDP-
Star, ein Chlor substituiertes 1,2-Dioxethan Chemilumineszenz-Substrat der alkalischen
Phosphatase, luftblasenfrei auf der Membran verteilt. Die Membran wurde 5 min in-

2 Material und Methoden 46
kubiert und anschießend luftdicht in Klarsichtfolie verschweißt. Zur Detektion der
Chemolumineszenz wurde ein Lumi Film 5 – 20 min belichtet und anschließend in
einem Crurix 2425 entwickelt. Durch zweimaliges Kochen der Membranen für 8 min in
2 x SSC / 0,1 % SDS konnten die hybridisierten Sonden entfernt und die Membranen
maximal dreimal wiederverwendet werden. Alle Hybridisierungsuntersuchungen
wurden mindestens dreimal mit RNA aus unterschiedlichen Präparationen durchgeführt.
2.2.23 DNase Verdau und cDNA Synthese
Zunächst wurde ein DNase Verdau durchgeführt, um genomische DNA-Kontaminationen,
welche die real time-PCR Ergebnisse verfälschen würden, aus der RNA-Präparation
zu entfernen. Hierfür wurden 4 µg Gesamt-RNA, 4 U DNase und 2 µl DNase Puffer in
20 µl Endvolumen für 45 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 2 µl DNase
Stop Solution hinzupipettiert und der Ansatz für 10 min bei 68 °C im Wasserbad
inkubiert. Zur Kontrolle der DNase Reaktion wurden parallel Ansätze mitgeführt,
welche keine DNase enthielten.
Zur Synthese von RNA komplementärer DNA (cDNA) wurde die isolierte Gesamt-
RNA einer reversen Transkription mit dem iScript cDNA Synthesis Kit unterzogen. Der
DNase Verdau wurde 1:10 verdünnt und 5 µl wurden als Template, zusammen mit 5 µl
Reaktionsmix (bestehend aus reverser Transkriptase, Nukleotiden, und Random
Primern) in 20 µl Gesamtreaktionsvolumen eingesetzt. Die reverse Transkription
erfolgte gemäß den Herstellerangaben nach initialer Inkubation für 5 min bei 25 °C, für
45 min bei 42 °C, mit anschließender Denaturierung der reversen Transkriptase für
5 min bei 85 °C. Die cDNA konnte bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert
werden.
2.2.24 Quantitative Transkriptionsanalyse durch real time PCR
Bei der real time PCR wurde dem PCR-Ansatz der Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green
zugesetzt, der mit Doppelstrang-DNA einen charakteristisch fluoreszierenden Komplex
eingeht. Somit ließ sich bei jedem Temperaturzyklus der Anstieg der Fluoreszenz als
Maß für die Produktentstehung verfolgen. Der Anstieg der Fluoreszenz bei der PCR-
Reaktion ließ auf die Ausgangsmenge der amplifizierten Sequenz schließen. Dazu
wurde die Anzahl der Temperaturzyklen (C T -Wert) bestimmt, ab der die Fluoreszenz
einen Schwellenwert innerhalb der exponentiellen Phase der Reaktion überschritt 92 . Die
relativen transkriptionellen Unterschiede innerhalb eines Experimentes wurden mittels

2 Material und Methoden 47
der 2 -ΔΔC T Methode 166 berechnet. Als Referenzgen wurde gyrB ausgewählt, da es als
essentielles Gen (housekeeping gene) einer möglichst geringen Regulation unterliegt.
Im ersten Schritt wurde der C T Wert des Referenzgenes (gyrB) vom C T Wert des zu
untersuchenden Gens abgezogen (ΔC T = C T Zielgen – C T Referenzgen). Nach dieser
Normierung wurde vom ΔC T Wert der Deletionsmutante der ΔC T Wert der Wildtypkontrolle
subtrahiert (ΔΔC T = ΔC T Deletionsmutante - ΔC T Wildtypkontrolle). Der
relative Expressionsunterschied zwischen dem Gen der entsprechenden Mutante und
dem Wildtyp ergab sich somit aus 2 -ΔΔC T.
Die real time-PCR wurde mit den iQ SYBR Green Supermix Reagenzien in einem
iCycler iQ Thermocycler durchgeführt. Geeignete Primerpaare für die real time-PCR
wurden mit Hilfe des Programms Beacon Designer 2 ausgewählt (Tabelle 2.5). Mittels
Verdünnungsreihen einer bekannten cDNA wurde in Probemessungen überprüft, ob die
ausgewählten Primer für eine Quantifizierung geeignet sind.
Der cDNA Ansatz (Kapitel 2.2.23) wurde nochmals 1:4 verdünnt und 3 µl dieser
Lösung wurden zusammen mit jeweils 10 pmol Primern und 25 µl iQ SYBR Green
Supermix in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 µl eingesetzt. Die quantitative real
time-PCR wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 1. 95 °C, 3 min; 2.
35 x [94 °C, 30 s; 55 °C, 30 s; 72 °C, 30 s]; 3. 4 °C. Alle real time-PCR Analysen
erfolgten jeweils im Dreifachansatz mit mindestens drei unabhängigen RNA
Präparationen.

3 Ergebnisse 48
3 Ergebnisse
In den Vorarbeiten der Arbeitsgruppe von Professor Knobloch wurden die Einflüsse
von erhöhter Osmolarität und Alkoholen auf die Biofilmbildung untersucht. Die
phänotypische Charakterisierung der Mutante M15 konnte nicht die Frage beantworten,
ob die Regulation der Biofilmbildung über eine Regulation des alternativen Sigmafaktors
σ B erfolgt, oder ob RsbU selbst als Regulator der Biofilmbildung fungiert 146, 148 .
Außerdem konnte nicht beurteilt werden, ob die beobachteten Veränderungen lediglich
auf polare Effekte der Transposoninsertion zurück zu führen sind. Zur Klärung dieser
Fragen sollten im Rahmen dieser Doktorarbeit Mutanten generiert werden, bei denen
gezielt die Einzelgene des σ B Operons (rsbU, rsbV, rsbW und sigB), die regulative
Kaskade (rsbUVW), sowie das gesamte Operon (rsbUVWsigB) inaktiviert sind.
3.1 Etablierung der Deletionsmutanten in S. epidermidis
3.1.1 Generierung definierter Mutanten im σ B Operon
Um definierte Gene selektiv inaktivieren zu können, wurde die Methode des homologen
Genaustausches 151 gewählt. Hierfür wurden 540 – 798 bp große Fragmente amplifiziert,
welche das jeweilige zu deletierende Gen flankieren (Abbildung 2.1). Zwischen zwei
solcher Fragmente wurde als Selektionsmarker für eine erfolgreiche homologe Rekombination
eine Erythromycin (erm) Resistenzkassette in den temperatursensitiven
E. coli/Staphylokokken Shuttlevektor pBT2 kloniert (Abbildung 2.2). Um eine Transkription
der in Richtung 3´ Ende liegenden Gene zu ermöglichen und die Bildung von
antisense-RNA zu vermeiden, wurde die erm Kassette in positiver Orientierung in
Bezug zu dem σ B Operon kloniert. Die in E. coli klonierten Plasmide wurden zunächst
mittels Elektroporation in den restriktionsdefizienten S. aureus Stamm RN4220 transformiert.
Nach der Passage in diesem Zwischenwirt konnten die Plasmide durch Elektroporation
in S. epidermidis M15 transformiert und aus diesem Stamm durch Phagentransduktion
mit Φ71 in den eigentlichen Zielstamm S. epidermidis 1457 transduziert
werden. Durch Kultivierung bei für den temperatursensitiven Shuttlevektor nicht
permissiven Temperaturen, konnten durch entsprechende Antibiotikasupplementierung,
Mutanten mit einem erfolgreichen homologen Genaustausch selektioniert werden
(Tabelle 2.8, Abbildung 3.1).

3 Ergebnisse 49
Abbildung 3.1
Strategie für den homologen Genaustausch. Dargestellt ist jeweils das σ B Operon von
S. epidermidis (gene bank accession no.: AF274004) mit den in pBT2 klonierten Fragmenten
für den homologen Genaustausch (schematische Darstellung, nicht maßstabsgetreu).
Pfeile repräsentieren offene Leserahmen, Kreuze markieren die jeweiligen rekombinierten
Bereiche zwischen diesen Fragmenten und dem σ B Operon. Es wurden Mutanten
mit Deletion der Einzelgene rsbU (A), rsbV (B), rsbW (C) und sigB (D) sowie
der Regulationskaskade rsbUVW (E) und des gesamten Operons rsbUVWsigB (F)
generiert.

3 Ergebnisse 50
Mittels PCR wurde die korrekte Insertion der erm Resistenzkassette überprüft, wobei
von den Primerpaaren ein Primer (Tabelle 2.5, Tabelle 3.1) jeweils innerhalb der erm
Kassette lag und sich der andere Primer außerhalb der manipulierten Region befand
(Abbildung 2.3). Die Größe der Amplifikate entsprach den zu erwartenden Größen bei
einer korrekten Insertion (Tabelle 3.1, Abbildung 3.2).
Mutante Gelbande Primer Erwartete Fragmentgröße
1457rsbU
1457rsbV
1457rsbW
1457sigB
1457UVW
1457UVWsigB
Tabelle 3.1
1 JMK55 und erm.rev 903 bp
2 erm.for und JMK50 1.091 bp
3 vrsbUR1 und erm.rev 1.992 bp
4 erm.for und JMK8 1.168 bp
5 vrsbUR1 und erm.rev 2.218 bp
6 erm.for und JMK36 1.386 bp
7 hrsbUR1 und erm.rev 1.374bp
8 erm.for und JMK34 781 bp
9 JMK55 und erm.rev 903 bp
10 erm.for und JMK36 1.386 bp
11 JMK55 und erm.rev 903 bp
12 erm.for und JMK34 781 bp
Erwartete Größe der Amplifikate bei korrekter Insertion der Erythromycin Resistenzkassette
(erm) in den jeweiligen Mutanten. Es sind die jeweils verwendeten Primer
aufgeführt (Sequenz siehe Tabelle 2.5). Außerdem ist die Position des Amplifikates in
der unten gezeigten Gelelektrophorese dargestellt (Abbildung 3.2).
Abbildung 3.2
PCR zur Kontrolle einer korrekten Insertion der erm Resistenzkassette. PCR der Mutante
1457rsbU (1,2), 1457rsbV (3,4), 1457rsbW (5,6), 1457sigB (7,8), 1457UVW
(9,10) und 1457UVWsigB (11,12) mit den in Tabelle 3.1 angegebenen Primerpaaren.
Die Größe der Amplifikate entsprach der zu erwartenden Größe bei einer korrekten
Insertion (Tabelle 3.1).

3 Ergebnisse 51
Weiterhin wurde, um die Integrität der benachbarten Gene sicherzustellen, das σ B
Operon aller Mutanten amplifiziert und anschließend sequenziert. Alle überprüften
Mutanten zeigten eine regelrechte Insertion der Resistenzkassette ohne Veränderungen
der flankierenden Gene (Daten nicht gezeigt). Mittels Phagentransduktion wurden alle
Deletionen erneut in den Zielstamm S. epidermidis 1457 transduziert, um zu überprüfen,
ob der beobachtete Phänotyp mit dem Genotyp gekoppelt ist. Alle Transduktanten
in S. epidermidis 1457 zeigten in den nachfolgend beschriebenen Untersuchungen
einen nahezu identischen Phänotyp im Vergleich zu den primär generierten
Mutanten, so dass die Koppelung von Genotyp und Phänotyp bestätigt werden konnte.
3.1.2 Transkription von erm und sigB in den Mutanten
Um die Transkription stromabwärts gelegener Gene zu ermöglichen, wurde die erm
Resistenzkassette in gleichsinniger Leserichtung zum σ B Operon kloniert. Eine unerwünschte
Interferenz der vorgeschalteten Gene durch antisense-RNA sollte so vermieden
werden. Um diese Annahme zu überprüfen, wurde mittels Northern Blot und real
time-PCR die Transkription von sigB und erm in den Mutanten mit dem Wildtyp verglichen.
Durch Hybridisierung mit einer sigB-spezifischen Sonde konnte für den Wildtyp
ein circa 1,7 kb großes Transkript nachgewiesen werden (Abbildung 3.3 A).
Abbildung 3.3
Northern Blot Hybridisierung mit Digoxigenin markierten Sonden von S. epidermidis
1457 und den entsprechenden Deletionsmutanten mittels. (A) Hybridisierung mit einer
sigB-spezifischen Sonde. Hierbei stellte sich im Wildtyp ein ca. 1,7 kb großes Transkript
(Pfeil) dar, welches der Transkriptionseinheit rsbVWsigB entsprach. In Mutanten
mit intaktem sigB wurden Transkripte detektiert (graue Pfeilspitzen), welche durch die
Insertion der erm Kassette entsprechend vergrößert waren. (B) Hybridisierung mit einer
erm-spezifischen Sonde. In Mutanten mit intaktem sigB wurden Transkripte detektiert
(graue Pfeilspitzen), welche die gleiche Größe aufwiesen, wie in der zuvor gezeigten
Hybridisierung mit einer sigB-spezifischen Sonde. Auch in den Mutanten mit einer
Deletion des sigB Gens konnten nun ca. 1,3 kb große Transkripte detektiert werden
(schwarze Pfeilspitzen), welche nur wenig größer waren, als die in allen Mutanten
hybridisierten, schwachen Transkripte des erm Gens (Pfeil). Es sind jeweils Ergebnisse
repräsentativer Experimente dargestellt.

3 Ergebnisse 52
Diese Größe entsprach den Genen rsbV, rsbW und sigB, welche von einem putativ σ B -
abhängigen Promotor vor rsbV transkribiert wurden. Für die Mutanten 1457rsbU,
1457rsbV, 1457rsbW und 1457rsbUVW konnten mit Hilfe der sigB-spezifischen Sonde
Transkripte mit jeweils circa 3,4, 2,6, 2,3 und 2,3 kb Größe nachgewiesen werden
(Abbildung 3.3 A). Diese entsprachen den zu erwartenden Größen bei einem Transkriptionsstart
von dem σ A -abhängigen erm Promotor (Abbildung 3.4).
Abbildung 3.4
Schematische Darstellung des σ B Operons von S. epidermidis 1457 und den Deletionsmutanten
1457rsbU, 1457rsbV, 1457rsbW und 1457rsbUVW. Es sind jeweils die
Größen der mit einer sigB-spezifischen Sonde hybridisierten Transkripte eingezeichnet
(vergleiche Abbildung 3.3). Die Größe des im Wildtypstamm detektierten Transkripts
entsprach den Genen rsbV, rsbW und sigB, welche von einem putativ σ B -abhängigen
Promotor vor rsbV transkribiert wurden. Die Größen der in den Deletionsmutanten
detektierten Transkripte entsprachen den zu erwartenden Größen bei einem Transkriptionsstart
von dem σ A -abhängigen erm Promotor. Schwarze Pfeile stellen die Gene des
σ B Operons, graue Pfeile die inserierte erm Kassette dar. Mögliche σ A -, beziehungsweise
σ B -abhängige Promotoren sind mit P A beziehungsweise P B
B gekennzeichnet.
Für die Mutanten mit deletiertem sigB (1457sigB und 1457rsbUVWsigB) konnten mit
dieser Sonde erwartungsgemäß keine Transkripte nachgewiesen werden.
Mit einer erm-spezifischen Sonde konnten für die Mutanten 1457rsbU, 1457rsbV,
1457rsbW und 1457rsbUVW Transkripte detektiert werden, welche die gleiche Größe
aufwiesen, wie die jeweiligen mit einer sigB-spezifischen Sonde detektierten

3 Ergebnisse 53
Transkripte (Abbildung 3.3 B). In den Mutanten 1457sigB und 1457rsbUVWsigB
konnte ein jeweils circa 1,3 kb großes Transkript nachgewiesen werden, während im
Wildtyp S. epidermidis 1457 erwartungsgemäß kein Signal mit der erm-spezifischen
Sonde zu detektieren war. Weiterhin konnte mit dieser Sonde in allen Mutanten ein
schwaches, circa 1,2 kb großes Transkript hybridisiert werden. Dieses entsprach der
Erythromycin Resistenzkassette, welche einen schwachen Transkriptionsterminator
besitzt, der jedoch die Transkription der in 3´ Richtung gelegenen Gene nicht
signifikant inhibierte.
Ein von dem vor rsbU gelegenen σ A -abhängigen Promotor abgelesenes Transkript
konnte in keinem der untersuchten Stämme mittels Hybridisierung mit einer rsbUspezifischen
Sonde detektiert werden (Daten nicht gezeigt). Somit umfasst das im Wildtypstamm
mit einer sigB-spezifischen Sonde nachgewiesene 1,7 kb große Transkript nur
rsbV, rsbW und sigB, jedoch nicht rsbU. Mittels real time-PCR mit den im rsbU Gen
gelegenen Primern rsbU-real1.for und rsbU-real2.rev (Tabelle 2.5, Abbildung 3.5)
konnte gezeigt werden, dass zwischen Wildtyp und Mutanten mit intaktem rsbU keine
signifikanten Transkriptionsunterschiede für rsbU bestanden, während in Mutanten mit
deletiertem rsbU erwartungsgemäß auch mittels real time-PCR kein solches Transkript
nachweisbar war (Tabelle 3.2).
1457rsbU 1457rsbV 1457rsbW 1457sigB 1457rsbUVW 1457rsbUVWsigB
nicht - 1,37 fach + 1,8 fach + 1,11 fach nicht nicht
nachweisbar
nachweisbar nachweisbar
Tabelle 3.2
Relativer Transkriptionsunterschied von rsbU zwischen S. epidermidis 1457 Wildtyp
und den jeweiligen Mutanten. Es handelt sich um Mittelwerte aus je drei unabhängigen
real time PCR Experimenten, berechnet mittels 2 -ΔΔC T.Methode.
Diese Ergebnisse der Northern Blot Analyse demonstrierten die korrekte Insertion der
Erythromycinkassette und bestätigten das gewünschte Transkriptionsverhalten der
Deletionsmutanten, so dass die Mutanten weiter charakterisiert wurden.
3.1.3 Putativ σ B abhängiger Promotor vor rsbV
Für B. subtilis und S. aureus konnte bereits ein σ B -abhängiger Promotor im σ B Operon
unmittelbar vor dem Gen rsbV identifiziert werden 206, 240 . Auch in S. epidermidis 1457
konnte ein putativ σ B -abhängiger Promotor (TAGATTAA N 14 GGGTAT) mit hoher
Homologie zu der Konsensussequenz für σ B -abhängige Promotoren ausgemacht werden
(Abbildung 3.5) 101, 206 .

B
3 Ergebnisse 54
Für die von dem σ A -abhängigen Promotor ausgehende Transkriptionseinheit wurde in
der Mutante 1457sigB verglichen mit dem Wildtyp, kein signifikanter Transkriptionsunterschied
detektiert (Tabelle 3.2, Abbildung 3.5). Mittels real time PCR mit den
Primern rsbVW-real1.for und rsbVW-real2.rev (Tabelle 2.5, Abbildung 3.5), wurde die
Transkription der stromabwärts des putativ σ B -abhängigen Promotors gelegenen Gene
untersucht. Es konnte eine gegenüber dem Wildtypstamm um den Faktor 8,6 verringerte
Transkription von rsbV dokumentiert werden. Somit konnte belegt werden, dass der
putativ σ B -abhängige Promotor vor rsbV tatsächlich σ B -abhängig transkribiert wird.
Abbildung 3.5
Schematische Darstellung des σ B Operons von S. epidermidis 1457. Gerade Pfeile markieren
offene Leserahmen. P A und P B repräsentieren σ - beziehungsweise σ -abhän-
A
B
gige Promotoren. Geknickte Pfeile markieren die Lage der verwendeten real time PCR
Primer in Bezug zu den untersuchten Promotoren (nicht maßstabsgetreu, vergleiche
Tabelle 2.5).
3.1.4 σ B -Aktivität in den Deletionsmutanten von S. epidermidis 1457
Aus B. subtilis uns S. aureus war bekannt, dass die Aktivität von σ B posttranskriptionell
durch die Genprodukte der regulativen Gene rsbU, rsbV und rsbW moduliert wird 22-24,
60, 240 . Somit konnte die Transkriptionsanalyse von sigB (Kapitel 3.1.2) nicht herangezogen
werden, um zu überprüfen, ob in S. epidermidis eine vergleichbare Regulation
besteht. Es mussten daher zur Beurteilung der σ B -Aktivität solche Gene untersucht
werden, die σ B -abhängig transkribiert werden. In S. epidermidis war der P 1 Promotor
des sarA Gens (staphylococcal accessory gene regulator A) der bisher einzige beschriebene
Promotor, dessen σ B -abhängige Transkription mittels Primer extension Analyse
bestätigt wurde 30, 80 . Da sarA in S. epidermidis jedoch von zwei weiteren σ A -abhängigen
Promotoren transkribiert wird 80 , war es für die im weiteren Verlauf geplante Analyse
der σ B -Aktivität mittels real time PCR ungeeignet. Zu diesem Zweck sollte zusätzlich
die Transkription eines weiteren, möglichst ausschließlich σ B -abhängigen Gens
charakterisiert werden. Das alkaline shock protein 23 (asp23) ist in S. aureus als σ B -

3 Ergebnisse 55
abhängiges Gen gut charakterisiert und wird regelmäßig als Kontrolle für die σ B -
Aktivität eingesetzt 89, 91, 161 . In einem Bereich von 5000 bp stromaufwärts des asp23-
Homologen konnten mittels Konsensussequenzsuche 206 drei putative σ B -abhängige
Promotoren in S. epidermidis gefunden werden. Ein Sequenzvergleich mit S. aureus
zeigte, dass die Promotoren P 1 und P 2 in beiden Spezies hinsichtlich ihrer -10 und -35
Sequenzen konserviert waren (Abbildung 3.6, Abbildung 3.7). Die -35 Sequenz des P 3
Promotors entsprach der Konsensussequenz für putativ σ B -abhängige Promotoren,
jedoch war die Sequenz zwischen den beiden Spezies nicht konserviert.
Abbildung 3.6 Sequenzvergleich der Promotorregionen vor den asp23 Genen mit Homologie zu σ B -
abhängigen Promotoren in S. aureus (gene bank accession no.: AP003136) und
S. epidermidis (gene bank accession no.: AE016750). Das gesuchte Sequenzmuster
entsprach: DGWKTNDN 12–15 GGRWAW (D= A, G, T; W= A, T; K= G, T; R= A, G;
N= A, C, G, T) 206 . Gezeigt sind jeweils die Promotorsequenz sowie der Abstand zum
Translationsstart des asp23 Gens. Zwischen S. aureus und S. epidermidis konservierte
Basen, die der Konsensussequenz entsprechen, sind rot dargestellt. Konservierte Basen,
die der Konsensussequenz nicht entsprechen, sind blau dargestellt. Nicht konservierte
Basen, die der Konsensussequenz entsprechen, erscheinen in grün.
Die Konservierung der Sequenzen der P 1 und P 2 Promotoren von asp23 ließ vermuten,
dass sie in S. epidermidis, vergleichbar zu S. aureus, σ B -abhängig transkribiert werden,
so dass asp23 als möglicher Indikator für die σ B -Aktivität mittels Northern Blot weiter
evaluiert wurde. Hierfür wurde der Wildtypstamm S. epidermidis 1457 unter statischen
Bedingungen in TSB Medium angezüchtet, zu den Zeitpunkten 4, 7, 10, 14, 17, 20 und
24 h geerntet und anschließend die RNA extrahiert. Im Northern Blot wurden die
Proben mit Digoxigenin markierten, sarA- und asp23-spezifischen Sonden hybridisiert.
Die höchste σ B -Aktivität wurde nach 7 h in der exponentiellen Wachstumsphase
detektiert (Abbildung 3.7), so dass die RNA der Deletionsmutanten von S. epidermidis
1457 für die folgenden Experimente zu diesem Zeitpunkt extrahiert wurde.

3 Ergebnisse 56
Abbildung 3.7
Transkriptionsanalyse mittels Northern Blot von S. epidermidis 1457 zu den Zeitpunkten
4h, 7h, 10h und 24h. Es ist außerdem die genetische Organisation des asp23
und des sarA Gens in S. epidermidis mit den publizierten Promotoren gezeigt (gene
bank accession no.: AE016750 und AF054173). (A) Hybridisierung mit einer asp23-
spezifischen Sonde. Es wurden zwei Transkripte mit circa 0,6 kb und 1,5 kb detektiert.
Die Größe entsprach einem Transkriptionsstart von den σ B -abhängigen Promotoren P B1
und P B2 . Die höchste Transkriptionsaktivität wurde nach 7h detektiert. (B)
Hybridisierung mit einer sarA-spezifischen Sonde. Es konnten drei Transkripte dokumentiert
werden. Das kleinste entsprach einem Transkriptionsstart von dem erwiesenermaßen
σ B -abhängigen Promotor P B1 . Die Größe der beiden anderen Transkripte
entsprach einem Transkriptionsstart von den σ A -abhängigen Promotoren P A2 .und P A3 .
Die höchste Transkriptionsaktivität wurde auch hier nach 7h gemessen. Gerade Pfeile
A
B
markieren offene Leserahmen. P A und P B
B repräsentieren σ - beziehungsweise σ -abhängige
Promotoren Es sind jeweils Ergebnisse repräsentativer Experimente dargestellt.
Durch Hybridisierung mit einer asp23-spezifischen Sonde konnten im Wildtyp S. epidermidis
1457 und in den Mutanten 1457rsbW und 1457rsbUVW zwei Transkripte
detektiert werden. Die Transkriptgröße entsprach mit circa 1,5 und 0,6 kb der zu erwartenden
Größe bei einem Transkriptionsstart von den Promotoren P 1 und P 2 (Abbildung
3.8 A). Ein Translationsbeginn von dem P 3 Promotor konnte jedoch nicht mit absoluter
Sicherheit ausgeschlossen werden, da in S. epidermidis der P 2 und der P 3 Promotor
lediglich 88 bp voneinander entfernt liegen. In den Mutanten 1457rsbV, 1457sigB und
1457rsbUVWsigB konnte mit der asp23-spezifischen Sonde kein Hybridisierungssignal
detektiert werden. Lediglich in vereinzelten Experimenten konnte durch sehr lange Belichtungszeiten
eine schwache σ B -abhängige Transkription in der Mutante 1457rsbU
detektiert werden (Daten nicht gezeigt). Mit einer sarA-spezifischen Sonde konnten im
Wildtyp S. epidermidis 1457 und in den Mutanten 1457rsbW und 1457rsbUVW drei
Transkripte nachgewiesen werden (Abbildung 3.8 B), deren Größe den publizierten

3 Ergebnisse 57
Transkriptgrößen von 640, 760 und 850 bp entsprach 80 . In den Mutanten 1457rsbV,
1457sigB und 1457rsbUVWsigB konnte mit der sarA-spezifischen Sonde kein Transkript
von dem erwiesenermaßen σ B -abhängigen Promotor P 1 detektiert werden,
während die beiden σ A -abhängigen Transkripte des sarA Gens von den Promotoren P 2
und P 3 weiterhin detektiert werden konnten. Wiederum konnten durch lange
Belichtungszeiten in einzelnen Experimenten für die Mutante 1457rsbU eine schwache
σ B -Aktivität nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 3.8
Einfluss der Deletionen auf die Transkription der σ B -abhängigen Gene asp23 und sarA.
Die dargestellten Northern Blots zeigen Hybridisierungen mit einer asp23-spezifischen
(A) und einer sarA-spezifischen (B) Sonde. In den Mutanten 1457rsbU, 1457rsbV,
1457sigB und 1457rsbUVWsigB ließen sich keine σ B -abhängigen Transkripte
detektieren. Es sind jeweils Ergebnisse repräsentativer Experimente dargestellt.
Somit konnte asp23 als geeignetes Gen zur Beurteilung der σ B -Aktivität in real time
PCR Experimenten identifiziert werden, da es im Gegensatz zu sarA ausschließlich σ B -
abhängig transkribiert wird.
3.2 Regulation der Biofilmbildung durch σ B
3.2.1 Biofilmbildung der Mutanten des σ B Operons in S. epidermidis 1457
Um den Einfluss der generierten Deletionen des σ B Operons auf die Biofilmbildung zu
untersuchen, wurden semiquantitative Biofilmtests in 96-Loch-Zellkulturplatten mit
einer Nuclon Delta Oberfläche durchgeführt. Die Mutanten 1457rsbU, 1457rsbV,
1457sigB und 1457rsbUVWsigB, also jene Mutanten mit einer stark verminderten,

3 Ergebnisse 58
beziehungsweise fehlenden σ B -Aktivität, zeigten in TSB Medium eine gegenüber dem
Wildtyp stark verminderte Biofilmbildung. Im Gegensatz dazu zeigten Mutanten mit Inaktivierung
des Anti-Sigmafaktors RsbW bei intaktem sigB Gen (1457rsbW und
1457rsbUVW) in TSB Medium eine im Vergleich zum Wildtyp gesteigerte
Biofilmbildung (Abbildung 3.9). Durch Supplementierung des TSB Mediums mit 4%
NaCl konnte die Biofilmproduktion sowohl des Wildtyp Stammes, als auch der
Mutanten mit inaktiviertem RsbW induziert werden. Im Gegensatz dazu ließen sich
Mutanten mit verminderter σ B -Aktivität nicht durch Zugabe von NaCl zur Biofilmbildung
induzieren. Bemerkenswerterweise ließen sich der Wildtyp, sowie alle untersuchten
Mutanten unabhängig von der jeweiligen Deletion, durch Zugabe von Ethanol
in das Nährmedium zur Biofilmbildung stimulieren.
Abbildung 3.9
Biofilmbildung von S. epidermidis 1457 und den primär generierten Deletionsmutanten.
Die Biofilmbildung wurde in 96-Loch-Zellkulturplatten mit Nuclon Delta Oberfläche
untersucht. Es wurden folgende Nährmedien verwendet: TSB, TSB NaCl 4% , TSB EtOH 2%
und TSB EtOH 4% . Nach Anfärbung mit Gentianaviolett wurde die Absorption bei 570 nm
gemessen (A 570 ). Es sind jeweils Ergebnisse repräsentativer Experimente dargestellt.
Um auszuschließen, dass die beobachteten Unterschiede der Biofilmexpression auf
unterschiedliche Wachstumsraten der Mutanten zurückzuführen sind, wurden die jeweils
erreichten Zellzahlen verglichen. (Abbildung 3.10). In den getesteten Nährmedien
konnten bezüglich der Höhe der erreichten KBE, keine signifikanten Unterschiede
zwischen den Mutanten und dem Wildtypstamm S. epidermidis 1457 festgestellt
werden.

3 Ergebnisse 59
Abbildung 3.10 Bestimmung der Zellzahl von S. epidermidis 1457 und den jeweiligen Deletionsmutanten
unter verschiedenen Kulturbedingungen. Die Stämme wurden in Zellkulturschalen
mit Nuclon Delta Oberfläche mit folgenden Nährmedien kultiviert: TSB,
TSB NaCl 4% , TSB EtOH 2% und TSB EtOH 4% . Die Zellsuspension wurde homogenisiert,
ausplattiert und anschließend wurde die Zahl der Koloniebildenden Einheiten (KBE)
bestimmt. Es sind Ergebnisse repräsentativer Experimente dargestellt.
Die Analyse der Transduktanten in S. epidermidis 1457 (1457rsbU-trans, 1457rsbVtrans,
1457rsbW-trans, 1457sigB-trans, 1457rsbUVW-trans und 1457rsbUVWsigBtrans)
ergab im Vergleich zu den primär generierten Mutanten ein nahezu identisches
Expressionsmuster der Biofilmproduktion (Abbildung 3.11).
Abbildung 3.11 Biofilmbildung von S. epidermidis 1457 und den Transduktanten. Die Biofilmbildung
wurde in 96-Loch-Zellkulturplatten mit Nuclon Delta Oberfläche untersucht. Es wurden
folgende Nährmedien verwendet: TSB, TSBBNaCl 4%, TSB EtOH 2% und TSB EtOH 4% . Nach
Anfärbung mit Gentianaviolett wurde die Absorption bei 570 nm gemessen (A 570 ). Es
sind jeweils Ergebnisse repräsentativer Experimente dargestellt.

3 Ergebnisse 60
3.2.2 Evaluation der PIA Synthese der Deletionsmutanten mittels IFT
Das interzelluläre Polysaccharidadhäsin PIA vermittelt die Zell zu Zell Adhäsion
innerhalb des Biofilms von S. epidermidis 171-173, 178 . Um zu überprüfen, ob die beobachteten
σ B -abhängigen Unterschiede der Biofilmbildung auf eine differentielle PIA
Synthese zurückzuführen sind, wurde ein Immunfluoreszenztest mit Hilfe eines
spezifischen Anti-PIA-Antikörpers 173, 178 und eines fluoreszenzmarkierten Zweitantikörpers
durchgeführt. Der Wildtypstamm S. epidermidis 1457 bildete unter statischen
Kulturbedingungen in TSB Medium große Zellhaufen. Mit Hilfe des Anti-PIA-Antikörpers
konnte nachgewiesen werden, dass die Zellen innerhalb des Polysaccharids eingebettet
sind. Dieses Verhalten des Wildtyps konnte ebenfalls bei Anzucht in TSB NaCl 4%
beobachtet werden, wobei die im semiquantitativen Biofilmassay gezeigte Induktion der
Biofilmbildung mit dieser Methode nicht mit Sicherheit detektiert werden konnte.
Mutanten mit Inaktivierung von RsbW bei intaktem sigB Gen bildeten in TSB und in
TSB NaCl 4% große, PIA-positive Zellkonglomerate. Im Gegensatz dazu bildeten Mutanten
mit fehlender, beziehungsweise stark verminderter σ B -Aktivität weder in TSB noch
in TSB NaCl 4% signifikante Zellkonglomerate. Mit Hilfe des Anti-PIA-Antikörpers
konnte bei diesen Mutanten kein PIA an den einzeln liegenden Zellen nachgewiesen
werden. Interessanterweise bildeten alle Mutanten sowie der Wildtypstamm in
TSB EtOH 3% , große PIA-positive Zellhaufen (Abbildung 3.12 und 3.13 und 3.14).
Abbildung 3.12 Biofilmbildung von S. epidermidis 1457rsbU. Es wurden folgende Nährmedien verwendet:
TSB, TSB NaCl 4% und TSB EtOH 3% . Die Zellen wurden mit SYTO61 rot dargestellt.
PIA wurde mit Hilfe eines spezifischen Anti-PIA-Antikörpers und eines fluoreszenzmarkierten
Zweitantikörpers grün dargestellt. 1457rsbU bildete weder in TSB
noch in TSB NaCl 4% signifikante Zellkonglomerate (1, 2 ,4, 5). In TSB EtOH 3% wurden
große, PIA-positive Zellhaufen gebildet (3, 6). Es sind jeweils Ergebnisse repräsentativer
Experimente dargestellt.

3 Ergebnisse 61
Abbildung 3.13 Biofilmbildung von S. epidermidis 1457rsbV, 1457rsbW und 1457sigB. Die Anzucht
und Färbung erfolgte nach den oben beschriebenen Bedingungen (Abbildung 3.12). Die
Mutante 1457rsbW bildete in TSB und in TSB NaCl 4% große, PIA-positive Zellkonglomerate
(7, 8, 10, 11). Mutanten mit fehlender, beziehungsweise stark verminderter σ B -
Aktivität bildeten weder in TSB noch in TSB NaCl 4% signifikante Zellkonglomerate (1, 2,
4, 5, 13, 14, 16, 17). Alle Mutanten bildeten in TSB EtOH 3% große, PIA-positive Zellhaufen
(3, 6, 9, 12, 15, 18). Es sind jeweils Ergebnisse repräsentativer Experimente
dargestellt.

3 Ergebnisse 62
Abbildung 3.14 Biofilmbildung von S. epidermidis 1457rsbUVW, 1457rsbUVWsigB und 1457 Wildtyp.
Die Anzucht und Färbung erfolgte nach den oben beschriebenen Bedingungen
(Abbildung 3.12). Die Mutante 1457rsbUVW und der Wildtypstamm bildeten in TSB
und in TSBBNaCl 4% große, PIA-positive Zellkonglomerate (1, 2, 4, 5, 13, 14, 16, 17).
1457rsbUVWsigB bildete weder in TSB noch in TSB NaCl 4% signifikante Zellkonglomerate
(7, 8, 10, 11). Alle Mutanten und der Wildtypstamm bildeten in TSB EtOH 3%
große, PIA-positive Zellhaufen (3, 6, 9, 12, 15, 18). Es sind jeweils Ergebnisse repräsentativer
Experimente dargestellt.

3 Ergebnisse 63
3.2.3 Transkriptionelle Regulation in S. epidermidis 1457
Da gezeigt werden konnte, dass der biofilmnegative Phänotyp mit einer fehlenden PIA
Synthese einhergeht, wurde zunächst die Transkription des PIA Syntheseoperons
88, 106
icaADBC analysiert.
Hierfür wurde die RNA während der exponentiellen
Wachstumsphase in Zellkulturschalen mit Nuclon Delta Oberfläche unter statischen Bedingungen
aus den Zellen isoliert. Mittels Northern Blot Hybridisierung mit einer icaAspezifischen
Sonde konnte ein circa 3,6 kb großes Transkript in S. epidermidis 1457
detektiert werden (Abbildung 3.15 A). In den Mutanten 1457rsbV, 1457sigB und
1457rsbUVWsigB hingegen konnten dieses Transkript nicht mehr detektiert werden,
während in 1457rsbU in einzelnen Experimenten ein im Vergleich zum Wildtyp sehr
schwaches Signal beobachtet werden konnte (nicht in dem gezeigten Blot). Für die Mutanten
1457rsbW und 1457rsbUVW konnten im Vergleich zum Wildtyp keine signifikanten
Unterschiede bezüglich der icaA Transkription detektiert werden. Interessanterweise
konnte, trotz der demonstrierten σ B -abhängigen Regulation mittels Konsensussequenzsuche
206 kein σ B -abhängiger Promotor stromaufwärts des icaADBC Operons gefunden
werden.
Abbildung 3.15 Transkriptionsanalyse von S. epidermidis 1457 mit den entsprechenden Deletionsmutanten
in Northern Blot Technik mittels Hybridisierung mit einer icaA-spezifischen
(A), bzw. icaR-spezifischen (B) Sonde. Es ist außerdem die genetische Organisation mit
den publizierten σ A -abhängigen Promotoren (P A ) dargestellt (gene bank accession no.:
SEU43366). In Mutanten mit fehlender, beziehungsweise stark verminderter σ B -
Aktivität stellte sich die icaA Transkription deutlich vermindert dar. Die Transkription
des negativen Regulators icaR hingegen war in diesen Mutanten, im Vergleich zu dem
Wildtypstamm, deutlich gesteigert. Es sind jeweils Ergebnisse repräsentativer Experimente
gezeigt.
Außerdem wurde der kürzlich beschriebene negative Regulator der icaADBC Transkription
icaR (intercellular adhesion regulator) 45 mit Hilfe einer Digoxigenin markierten,
icaR-spezifischen Sonde in Northern Blot Technik unter den vorhergehend aufgeführten

3 Ergebnisse 64
Bedingungen analysiert (Abbildung 3.15 B). Dabei konnte für alle Mutanten und den
Wildtypstamm ein circa 900 bp großes Transkript detektiert werden. Jedoch zeigten die
Mutanten 1457rsbU, 1457rsbV, 1457sigB und 1457rsbUVWsigB eine erheblich gesteigerte
Transkriptionsaktivität im Vergleich zum Wildtyp. Für die Mutanten 1457rsbW
und 1457rsbUVW wurde kein signifikanter Unterschied in Bezug auf die icaR Transkription
im Vergleich zum Wildtyp festgestellt.
Um die relativen Transkriptionsunterschiede schneller und genauer quantifizieren zu
können, wurde eine quantitative real time PCR etabliert. Exemplarisch für Mutanten mit
verminderter σ B -Aktivität wurde die Mutante 1457rsbUVWsigB untersucht, während
beispielhaft für Mutanten mit Inaktivierung von RsbW bei intaktem sigB Gen die
Mutante 1457rsbUVW verwendet wurde. Die Bakterien wurden unter statischen Bedingungen
in Zellkulturplatten mit Nuclon Delta Oberfläche kultiviert und die RNA
nach 7 h (exponentielle Phase), beziehungsweise 17 h (stationäre Phase) isoliert. Nach
einem DNase-Verdau wurde die RNA in komplementäre DNA (cDNA) mittels reverser
Transkriptase und random Primern umgeschrieben. Die Bestimmung der relativen
Transkriptionsunterschiede erfolgte jeweils im Dreifachansatz aus mindestens drei unabhängigen
RNA-Präparationen mittels 2 -ΔΔC T Methode, wobei Mittelwerte aus drei Experimenten
berechnet wurden. Als signifikant wurden Unterschiede der relativen Transkriptionsaktivität
gewertet, wenn eine mindestens 2,5-fache Veränderung detektiert
werden konnte.
Die Transkriptionsaktivität von asp23, welches von zwei σ B -abhängigen Promotoren
transkribiert wird, wurde als Marker für die σ B -Aktivität verwendet (Abbildung 3.16 A
und B). Die Mutante mit Deletion des gesamten σ B Operons wies zu den beiden
untersuchten Zeitpunkten eine 560- beziehungsweise 420-fache Reduktion der asp23
Transkription auf, so dass die Inaktivierung des alternativen Sigma Faktors bestätigt
werden konnte. Die Mutante 1457rsbUVW zeigte zu keinem Zeitpunkt eine signifikante
Veränderung der asp23 Transkription gegenüber dem Wildtyp.
In der Mutante 1457rsbUVWsigB mit Inaktivierung des gesamten σ B Operons, wurde in
der exponentiellen Phase eine 13,6-fach reduzierte, sowie in der stationären Phase eine
18,2-fach reduzierte icaA Transkription nachgewiesen. Somit stellte sich zu beiden
untersuchten Zeitpunkten analog zu den gezeigten Northern Blot Ergebnissen, eine stark
verminderte icaA Transkription dar. Ebenfalls analog zu den zuvor gezeigten Northern
Blot Untersuchungen konnte in der exponentiellen Phase eine 5,1-fach gesteigerte,

3 Ergebnisse 65
sowie in der stationären Phase eine 4,4-fach gesteigerte icaR Transkription dokumentiert
werden. Die Mutante 1457rsbUVW mit Inaktivierung der regulativen Kaskade
wies nur in der exponentiellen Phase eine 4,5-fach gesteigerte icaA Transkriptionsaktivität
auf, während die Regulation von icaR zu keinem Zeitpunkt signifikante Unterschiede
im Vergleich zum Wildtyp aufwies (Abbildung 3.16 A und B).
Abbildung 3.16 Transkriptionsanalyse der Gene asp23, icaA und icaR in den Mutanten
1457rsbUVWsigB und 1457rsbUVW (A+B) mittels quantitativer real time-PCR. Die
RNA wurde in drei unabhängigen Experimenten während der exponentiellen (A), beziehungsweise
stationären Wachstumsphase (B) isoliert. Relative Transkriptionsunterschiede
wurden jeweils im dreifach Ansatz im Vergleich zum jeweiligen Wildtypstamm
mit Hilfe der 2 -ΔΔC T Methode berechnet. Gezeigt sind die Mittelwerte aus drei
Experimenten mit dem jeweiligen Standardfehler, aufgetragen auf einer logarithmischen
Skala. Mutanten mit Deletion des gesamten σ B Operons sind in schwarz,
Mutanten mit Inaktivierung der regulativen Kaskade rsbUVW in grau dargestellt.
Gestrichelte Linien markieren den 2,5-fachen Unterschied als Grenzwert für eine
signifikante Veränderung.
3.2.4 Transduktion in unabhängige genetische Hintergründe
In S. aureus konnte gezeigt werden, dass SarA und nicht σ B für die Biofilmbildung
essentiell ist 259 . Eine σ B -abhängige Biofilmbildung konnte nur in einem einzelnen Isolat
und unter speziellen Umweltbedingungen demonstriert werden 216 . Die in S. epidermidis
1457 beobachtete σ B -abhängige Regulation der Biofilmbildung könnte somit einen Einzelfall
darstellen. Um die Bedeutung einer σ B -abhängigen Regulation der Biofilmbildung
für S. epidermidis besser abschätzen zu können, wurden die in S. epidermidis

3 Ergebnisse 66
1457 generierten Deletionsmutationen in den unabhängigen, Oxacillin-sensiblen genetischen
Hintergrund von S. epidermidis 8400 transduziert. Die sich ergebenden
Mutanten (8400rsbU, 8400rsbV, 8400rsbW, 8400sigB, 8400rsbUVW sowie
8400rsbUVWsigB) wurden unter den zuvor aufgeführten Kulturbedingungen hinsichtlich
ihrer Biofilmbildung analysiert (Abbildung 3.17). In TSB Medium zeigten
Mutanten mit fehlender, beziehungsweise stark verminderter σ B -Aktivität, eine stark
verminderte Biofilmbildung, welche sich auch nicht durch Zugabe von 4 % NaCl induzieren
ließ. Im Gegensatz dazu zeigten Mutanten mit einer Deletion des rsbW Gens bei
intaktem sigB Gen, eine im Vergleich zum Wildtypstamm gesteigerte Biofilmbildung in
TSB Medium. In diesen Mutanten konnte, wie auch im Wildtypstamm, die Biofilmbildung
durch Zugabe von 4 % NaCl noch weiter gesteigert werden. Supplementierung
mit Ethanol führte in allen Stämmen unabhängig von der vorliegenden Deletion zur
Induktion der Biofilmbildung. Dieses Expressionsmuster der Biofilmbildung von S. epidermidis
8400 und den zugehörigen Mutanten entsprach dem in S. epidermidis 1457
und den jeweiligen Mutanten beobachteten σ B -abhängigen Expressionsverhalten.
Abbildung 3.17 Biofilmbildung von S. epidermidis 8400 mit den entsprechenden Deletionsmutanten.
Die Biofilmbildung wurde in 96-Loch-Zellkulturplatten mit Nuclon Delta Oberfläche
untersucht. Es wurden folgende Nährmedien verwendet: TSB, TSB NaCl 4% , TSB EtOH 2%
und TSB EtOH 4% . Nach Anfärbung mit Gentianaviolett wurde die Absorption bei 570 nm
gemessen (A 570 ). Es sind jeweils Ergebnisse repräsentativer Experimente dargestellt.
Da es sich bei S. epidermidis Isolaten aus Fremdkörper-assoziierten Infektionen
typischerweise um Oxacillin-resistente Stämme handelt 83, 221 , wurden die in S. epidermi-

3 Ergebnisse 67
dis 1457 generierten Deletionsmutationen außerdem in den unabhängigen, Oxacillinresistenten
genetischen Hintergrund von S. epidermidis 1057 transduziert und hinsichtlich
ihrer Biofilmbildung charakterisiert (Abbildung 3.18). Der Expressionsphänotyp
der Mutanten (1057rsbU, 1057rsbV, 1057rsbW, 1057sigB, 1057rsbUVW sowie
1057rsbUVWsigB) entsprach dem bereits in S. epidermidis 1457 und 8400 mit den
jeweiligen Mutanten beobachteten, σ B -abhängigen Verhalten unter den untersuchten
Umweltbedingungen.
Abbildung 3.18 Biofilmbildung von S. epidermidis 1057 mit den entsprechenden Deletionsmutanten.
Die Biofilmbildung wurde in 96-Loch-Zellkulturplatten mit Nuclon Delta Oberfläche
untersucht. Es wurden folgende Nährmedien verwendet: TSB, TSB NaCl 4% , TSB EtOH 2%
und TSB EtOH 4% . Nach Anfärbung mit Gentianaviolett wurde die Absorption bei 570 nm
gemessen (A 570 ). Es sind jeweils Ergebnisse repräsentativer Experimente dargestellt.
Ob die beobachteten σ B -abhängigen Unterschiede der Biofilmexpression auf einer
differentiellen PIA Synthese beruhen, wurde zunächst mittels Immunfloureszenztest mit
173, 178
Hilfe eines spezifischen Anti-PIA-Antikörpers untersucht.
Exemplarisch für
Mutanten mit verminderter σ B -Aktivität sind hier die Mutanten 8400rsbUVWsigB und
1057rsbUVWsigB gezeigt, während beispielhaft für Mutanten mit Inaktivierung von
RsbW bei intaktem sigB Gen die Mutanten 8400rsbUVW und 1057rsbUVW aufgeführt
sind (Abbildung 3.19 und Abbildung 3.20).

3 Ergebnisse 68
Abbildung 3.19 Biofilmbildung von S. epidermidis 8400, 8400rsbUVW und 8400rsbUVWsigB. Die
Anzucht erfolgte in: TSB, TSB NaCl 4% oder TSBBEtOH 3%. Die Zellen wurden mit SYTO61
rot dargestellt. PIA wurde mit Anti-PIA-Antikörpern und fluoreszenzmarkierten Zweitantikörpern
grün dargestellt. Der Wildtyp und die Mutante 8400rsbUVW bildeten in
TSB und in TSB NaCl
B
4% große, PIA-positive Zellkonglomerate (7, 8, 10, 11, 13, 14, 16,
17). Die Mutante 8400rsbUVWsigB bildete weder in TSB noch in TSB NaCl 4%
signifikante Zellkonglomerate (1, 2, 4, 5). Alle Stämme bildeten in TSB EtOH 3% große,
PIA-positive Zellhaufen (3, 6, 9, 12, 15, 18). Es sind jeweils Ergebnisse repräsentativer
Experimente dargestellt.

3 Ergebnisse 69
Abbildung 3.20 Biofilmbildung von S. epidermidis 1057, 1057rsbUVW und 1057rsbUVWsigB. Die
Anzucht erfolgte in: TSB, TSB NaCl 4% oder TSBBEtOH 3%. Die Zellen wurden mit SYTO61
rot dargestellt. PIA wurde mit Anti-PIA-Antikörpern und fluoreszenzmarkierten Zweitantikörpern
grün dargestellt. Der Wildtyp und die Mutante 1057rsbUVW bildeten in
TSB und in TSB NaCl
B
4% große, PIA-positive Zellkonglomerate (7, 8, 10, 11, 13, 14, 16,
17). Die Mutante 1057rsbUVWsigB bildete weder in TSB noch in TSB NaCl 4%
signifikante Zellkonglomerate (1, 2, 4, 5). Alle Stämme bildeten in TSB EtOH 3% große,
PIA-positive Zellhaufen (3, 6, 9, 12, 15, 18). Es sind jeweils Ergebnisse repräsentativer
Experimente dargestellt.

3 Ergebnisse 70
Analog zu den Beobachtungen in S. epidermidis 1457 bildeten die Wildtypstämme
S. epidermidis 1057 und 8400 in TSB und in TSB NaCl 4% große, PIA-positive Zellhaufen.
Deletionsmutanten mit Inaktivierung von RsbW bei intaktem sigB Gen bildeten in TSB
und in TSB NaCl 4% PIA-positive Zellkonglomerate. Im Gegensatz dazu bildeten Mutanten
mit fehlender, beziehungsweise stark verminderter σ B -Aktivität weder in TSB
noch in TSB NaCl 4% signifikante Zellkonglomerate. Mit Hilfe des spezifischen Anti-PIA-
Antikörpers ließ sich kein PIA an den isoliert liegenden Zellen nachweisen. Alle
Mutanten und Wildtypstämme bildeten in TSB EtOH 3% große, PIA-positive Zellhaufen.
Um das Transkriptionsverhalten der Mutanten zu evaluieren, wurde RNA in der exponentiellen
(7h) sowie in der stationären (17h) Phase isoliert und die Transkription
mittels der zuvor etablierten quantitativen real time PCR untersucht (Kapitel 3.2.3). Exemplarisch
für Mutanten mit verminderter σ B -Aktivität wurden die ΔrsbUVWsigB Mutanten
untersucht, während beispielhaft für Mutanten mit Inaktivierung von RsbW bei
intaktem sigB Gen die ΔrsbUVW Mutanten verwendet wurden (Abbildung 3.21 A-D).
Als Marker für die σ B -Aktivität wurde die Transkriptionsaktivität des σ B -abhängig transkribierten
Gens asp23 bestimmt. Die ΔrsbUVWsigB Mutanten wiesen zu beiden untersuchten
Zeitpunkten eine 280- bis 830-fache Reduktion der asp23 Transkription auf, so
dass eine Inaktivierung des alternativen Sigmafaktors bestätigt werden konnte. Für die
Mutanten mit einer Deletion der regulativen Kaskade bei intaktem sigB Gen
(8400rsbUVW und 1057rsbUVW), wurde eine geringe 3,9- beziehungsweise 3,1-fache
Reduktion der asp23 Transkription in der exponentiellen Phase detektiert. In der
stationären Phase zeigte, verglichen mit dem Wildtyp, lediglich die Mutante
1057rsbUVW eine 3-fache Reduktion der asp23 Transkription. Diese Daten untermauerten
die Annahme, dass σ B in ΔrsbUVW Mutanten konstitutiv exprimiert wird,
während es im Wildtypstamm zu einer Hochregulation in der exponentiellen Wachstumsphase
kommt.
In allen Mutanten mit Inaktivierung des gesamten σ B Operons wurde zu beiden untersuchten
Zeitpunkten eine signifikante Verminderung der icaA Transkription detektiert.
Jedoch variierten die relativen Transkriptionsunterschiede gegenüber dem jeweiligen
Wildtypstamm zwischen den verschiedenen Mutanten. In der Mutante
1457rsbUVWsigB konnte in der exponentiellen Phase eine 13,6-fach reduzierte, sowie
in der stationären Phase eine 18,2-fach reduzierte icaA Transkription nachgewiesen
werden (Abbildung 3.16). In den Mutanten 8400rsbUVWsigB und 1057rsbUVWsigB

3 Ergebnisse 71
hingegen konnte nur in der exponentiellen Wachstumsphase eine stark verminderte icaA
Transkription dokumentiert werden (150- und 46-fach reduziert), während in der stationären
Phase jeweils eine 2,8- bzw. 4,7-fach verminderte icaA Transkription detektiert
wurde (Abbildung 3.21 A-D).
Abbildung 3.21 Transkriptionsanalyse der Gene asp23, icaA, und icaR in den Mutanten
8400rsbUVWsigB, 8400rsbUVW (A+B) sowie 1057rsbUVWsigB, 1057rsbUVW (C+D)
mittels quantitativer real time-PCR. Die RNA wurde in drei unabhängigen Experimenten
während der exponentiellen (A+C), beziehungsweise stationären Wachstumsphase
(B+D) isoliert. Relative Transkriptionsunterschiede wurden jeweils im dreifach
Ansatz im Vergleich zum jeweiligen Wildtypstamm mit Hilfe der 2 -ΔΔC T Methode berechnet.
Gezeigt sind die Mittelwerte aus drei Experimenten mit dem jeweiligen
Standardfehler, aufgetragen auf einer logarithmischen Skala. Mutanten mit Deletion des
gesamten σ B Operons sind in schwarz, Mutanten mit Inaktivierung der regulativen
Kaskade rsbUVW in grau dargestellt. Gestrichelte Linien markieren den 2,5-fachen
Unterschied als Grenzwert für eine signifikante Veränderung.

3 Ergebnisse 72
Für die Mutante 1057rsbUVWsigB wurde lediglich in der exponentiellen Wachstumsphase
eine signifikant erhöhte (3,4-fache) icaR Transkriptionsaktivität detektiert,
während in der stationären Phase nur eine 2,3-fach erhöhte Transkriptionsaktivität
gemessen wurde. In der Mutante 8400rsbUVWsigB wurde ebenfalls lediglich eine 1,9-
sowie 2,3-fach erhöhte icaR Transkriptionsaktivität in der exponentiellen, beziehungsweise
stationären Wachstumsphase detektiert. Jedoch wurde in keiner der 18 durchgeführten
Transkriptionsanalysen eine Verminderung der icaR Transkriptionsaktivität
beobachtet, so dass eine leicht gesteigerte icaR Transkription als eine kennzeichnende
Eigenschaft der Mutanten mit Inaktivierung von σ B bestätigt werden konnte (Abbildung
3.21 A-D).
Mutanten mit Inaktivierung der regulativen Kaskade rsbUVW wiesen in einzelnen Isolaten
unterschiedliche Transkriptionsprofile auf. Während in der Mutante 1457rsbUVW
nur in der exponentiellen Phase eine gesteigerte icaA Transkriptionsaktivität beobachtet
wurde und die Regulation von icaR zu keinem Zeitpunkt signifikante Unterschiede im
Vergleich zum Wildtyp aufwies (Abbildung 3.16), wurde für die Mutante 8400rsbUVW
analog zu der stark gesteigerten Biofilmbildung, eine gegenüber dem Wildtypstamm
signifikant verstärkte icaA Transkription detektiert (in der exponentiellen Phase 5,5-
fach, in der stationären Phase 19-fach). Die Transkriptionsaktivität von icaR war zu
diesen Zeitpunkten 3,4- beziehungsweise 2,2-fach vermindert. In der Mutante
1057rsbUVW wurde icaA während der exponentiellen Phase leicht vermindert (3,9-
fach) und in der stationären Phase geringfügig verstärkt (3,1-fach) transkribiert. Eine
signifikante Regulation von icaR wurde für 1057rsbUVW nur in der stationären Phase
in Form einer leicht verminderten (2,9-fach) Transkription detektiert (Abbildung 3.21).
3.2.5 Evaluation der sarA Transkription in den Deletionsmutanten
In S. aureus konnte SarA als zentraler Regulator der Biofilmsynthese identifiziert
werden 259 . Die Arbeitsgruppe von Conlon et al. hatte auch in S. epidermidis einen positiven
regulativen Einfluss des sarA Gens auf die icaADBC Transkription nachweisen
können 46 . Interessanterweise wird sarA auch in S. epidermidis von einem σ B -abhängigen
und zwei σ A -abhängigen Promotoren transkribiert (Abbildung 3.7 B) 80 . Es
wurde daher zusätzlich die sarA Transkription der Deletionsmutanten in der der exponentiellen
(7h) sowie der stationären (17h) Wachstumsphase mittels real time PCR
untersucht und mit den jeweiligen Wildtyp Stämmen verglichen (Abbildung 3.22).

3 Ergebnisse 73
Exemplarisch für Mutanten mit verminderter σ B -Aktivität wurden die ΔrsbUVWsigB
Mutanten untersucht, während beispielhaft für Mutanten mit Inaktivierung von RsbW
bei intaktem sigB Gen die ΔrsbUVW Mutanten verwendet wurden.
Abbildung 3.22 Transkriptionsanalyse von sarA in den Mutanten 1457rsbUVWsigB, 1457rsbUVW,
8400rsbUVWsigB, 8400rsbUVW sowie 1057rsbUVWsigB, 1057rsbUVW mittels quantitativer
real time-PCR. Die RNA wurde in drei unabhängigen Experimenten während
der exponentiellen (A), beziehungsweise stationären Wachstumsphase (B) isoliert.
Relative Transkriptionsunterschiede wurden jeweils im dreifach Ansatz im Vergleich
zum jeweiligen Wildtypstamm mit Hilfe der 2 -ΔΔC T Methode berechnet. Gezeigt sind die
Mittelwerte aus drei Experimenten mit dem jeweiligen Standardfehler, aufgetragen auf
einer logarithmischen Skala. Mutanten mit Deletion des gesamten σ B Operons sind in
schwarz, Mutanten mit Inaktivierung der regulativen Kaskade rsbUVW in grau
dargestellt. Gestrichelte Linien markieren den 2,5-fachen Unterschied als Grenzwert für
eine signifikante Veränderung.
Eine Analyse der Transkriptionsaktivität von sarA zeigte eine signifikante Veränderung
lediglich für die Mutanten 8400rsbUVWsigB und 8400rsbUVW in Form einer 5,8-
fachen, beziehungsweise 3,7-fachen Reduktion in der exponentiellen Wachstumsphase.
In der stationären Wachstumsphase boten diese Mutanten, ebenso wie alle anderen
untersuchten Mutanten keine signifikante Veränderung der sarA Transkription.

3 Ergebnisse 74
3.2.6 Transkriptionsanalyse unter Induktion mit Ethanol
Um die zugrunde liegenden Mechanismen der beobachteten Induktion der Biofilmbildung
durch Ethanol bei den Mutanten mit fehlender, beziehungsweise stark verminderter
σ B -Aktivität weiter zu untersuchen, wurde eine Transkriptionsanalyse von S. epidermidis
1457, sowie den Mutanten 1457rsbU, 1457sigB und 1457rsbUVWsigB durchgeführt.
Hierfür wurden die Stämme in TSB oder TSB EtOH 3% in Zellkulturschalen mit
Nuclon Delta Oberfläche unter statischen Bedingungen angezüchtet und die RNA
während der exponentiellen Wachstumsphase aus den Zellen isoliert. Mittels Northern
Blot Hybridisierung mit Digoxigenin markierten, icaA-, icaR- oder asp23-spezifischen
Sonden wurde die Transkriptionsaktivität der einzelnen Gene evaluiert (Abbildung
3.23). Im Vergleich zu den nicht induzierten Mutanten führte eine Supplementierung
des TSB Mediums mit Ethanol zu einer verminderten icaR Transkription. Analog zu der
beobachteten Induktion der Biofilmbildung wurde in den induzierten Mutanten eine gesteigerte
icaA Transkription detektiert.
Abbildung 3.23 Differentielle Transkription von icaADBC, icaR und asp23 unter dem Einfluss von
Ethanol in S. epidermidis 1457 und den Deletionsmutanten 1457rsbU, 1457sigB sowie
1457rsbUVWsigB. Transkriptionsanalyse mittels Northern Blot Technik mit Digoxigenin
markierten icaA-, icaR- beziehungsweise asp23-spezifischen Sonden. Es wurden
folgende Nährmedien verwendet: TSB und TSB EtOH 3% . Die gesteigerte icaR Transkriptionsaktivität
in Mutanten mit fehlender, beziehungsweise stark verminderter σ B -
Aktivität wurde durch Zugabe von Ethanol zum Nährmedium supprimiert. Gleichzeitig
wurde unter diesen Wachstumsbedingungen die icaA Transkription auf Wildtypniveau
rekonstituiert. Eine Transkription von asp23, als Marker der σ B -Aktivität, wurde in
keiner Mutante detektiert, weder in TSB noch in TSB EtOH 3% . Interessanterweise bot der
Wildtyp in TSB EtOH 3% eine leicht verminderte icaA und asp23 Transkription. Es sind
jeweils Ergebnisse repräsentativer Experimente gezeigt.

3 Ergebnisse 75
Interessanterweise wurde trotz der beobachteten Induktion der Biofilmbildung durch
Ethanol, im Wildtypstamm S. epidermidis 1457 im Vergleich zum nicht induzierten
Stamm, neben einer geringfügig verminderten icaR Transkription, ebenfalls eine leicht
verminderte icaA und asp23 Transkription festgestellt. Mittels Hybridisierung mit einer
asp23-spezifischen Sonde konnte in keiner der untersuchten Mutanten, weder in TSB
noch TSB EtOH 3% eine σ B -Aktivität detektiert werden (Abbildung 3.23). Daher ist
anzunehmen, dass die Induktion der Biofilmbildung durch Ethanol über einen σ B -unabhängigen
Regulationsweg vermittelt wird. Die Induktion der Transkription des PIA
Syntheseoperons icaADBC erfolgt hierbei durch Repression des negativen Regulators
IcaR.
3.3 Regulation der Biofilmbildung in S. epidermidis M12
Knobloch et al. konnten mittels eines arbitrary PCR Verfahrens zeigen, dass die Transposoninsertionsstelle
der Klasse II Mutante S. epidermidis M12 an Position 792 eines
822 Basen umfassenden offenen Leserahmens mit hoher Homologie zu den purR Genen
von B. subtilis, S. aureus und Lactococcus lactis lokalisiert ist (Abbildung 1.2) 153 .
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die purR flankierenden Gene yabJ und spoVG
zwischen S. epidermidis, S. aureus und B. subtilis konserviert sind 147 . Die Transposoninsertion
führte zur Inaktivierung eines purR und drei weitere Gene umfassenden, circa
2,6 kb großen Transkriptes. Weiterhin kam es zur Inaktivierung eines circa 1 kb großen
Transkriptes, welches lediglich die purR flankierenden yabJ- und spoVG- homologen
Gene umfasste 18 . Das größere der beiden Transkripte konnte im Wildtyp nur in geringer
Menge während der exponentiellen Wachstumsphase detektiert werden, wohingegen
das kleinere Transkript sowohl in der exponentiellen Wachstumsphase als auch in der
stationären Phase in großen Mengen exprimiert wurde 18 .
Aufgrund der von K. Bartscht durchgeführten Komplementierungsexperimente konnte
gezeigt werden, dass die yabJ- und spoVG-Homologen gemeinsam für die
Rekonstitution der Biofilmbildung notwendig sind, während purR nicht essentiell ist 18 .
Da für die ebenfalls in S. aureus zu findenden homologen Gene in Staphylokokken
bisher keine Funktion bekannt ist, wurden sie entsprechend ihrer in S. epidermidis
nachgewiesenen Funktion als biofilm accumulation regulator A und B (barAB)
bezeichnet 147 .
Mittels Konsensussequenzsuche konnte innerhalb der kodierenden Sequenz des purR
Gens ein putativ σ B -abhängiger Promotor identifiziert werden 147 . Daher wurde im

3 Ergebnisse 76
Rahmen dieser Arbeit eine Transkriptionsanalyse der Deletionsmutanten des σ B
Operons in S. epidermidis 1457 mit einer barA-spezifischen Sonde durchgeführt. Es
zeigte sich, dass jenes in der Mutante M 12 inaktivierte barAB Transkript tatsächlich
σ B -abhängig transkribiert wird (Abbildung 3.24).
Abbildung 3.24 Transkriptionsanalyse in Northern Blot Technik mittels Hybridisierung mit einer barAspezifischen,
Digoxigenin markierten Sonde. In Mutanten mit fehlender, beziehungsweise
stark verminderter σ B -Aktivität konnte, wie auch für die Mutante M12 kein
barAB Transkript nachgewiesen werden, während im Wildtyp S. epidermidis 1457
sowie den Mutanten mit Inaktivierung von RsbW barAB weiterhin transkribiert wird.
Es ist das Ergebnis eines repräsentativen Experimentes gezeigt.
Mittels Northern Blot Hybridisierung mit Digoxigenin markierten, icaA- und icaRspezifischen
Sonden konnte für die Mutante M12 eine mit der in Mutante
1457rsbUVWsigB vergleichbare Repression der icaADBC Transkription beobachtet
werden (Abbildung 3.25).
Abbildung 3.25 Transkriptionsanalyse der Mutante M12 im Vergleich zu dem Wildtyp S. epidermidis
1457 und den Mutanten 1457rsbUVW und 1457rsbUVWsigB, in Northern Blot Technik
mittels Hybridisierung mit einer icaA-, beziehungsweise icaR- spezifischen Digoxigenin
markierten Sonde. Für die Mutante M12 wird eine Repression der icaADBC Transkription
detektiert, jedoch wird im Gegensatz zu 1457rsbUVWsigB keine gesteigerte
Transkription von icaR beobachtet. Es sind jeweils die Ergebnisse repräsentativer Experimente
gezeigt.
Interessanterweise konnte für die Mutante M 12, im Vergleich zum Wildtyp und der
Mutante 1457rsbUVW keine signifikante Erhöhung der icaR Transkription detektiert
werden, während für die Mutante 1457rsbUVWsigB eine gesteigerte Transkriptionsakti-

3 Ergebnisse 77
vität von icaR beobachtet wurde (Abbildung 3.25). Diese Daten weisen darauf hin, dass
die Regulation der Biofilmbildung durch die in der Mutante M12 inaktivierten Gene
barA und barB über eine positive Regulation der Transkription von icaADBC erfolgt,
welche jedoch von der Regulation durch den negativen Regulator IcaR unabhängig ist.
3.4 Expression der Oxacillinresistenz in den Deletionsmutanten
Die Arbeitsgruppe von Professor Mack hatte in den Vorarbeiten bereits eine Transduktante
der Mutante M15 in dem heterogen Oxacillin-resistenten S. epidermidis Isolat
1057 (1057 M15) etablieren können. Es konnte gezeigt werden, dass innerhalb der
Population dieser Transduktante eine im Vergleich zum Wildtyp kleinere Subpopulation
zur Expression der Oxacillinresistenz befähigt war 177 . Um zu untersuchen, ob das in der
Mutante M15 inaktivierte RsbU als selbständiger Regulator der Oxacillinresistenz
fungiert, wurde der Einfluss der Deletionen im σ B Operon auf die Expression der
Oxacillinresistenz evaluiert. Hierfür wurde der Expressionsphänotyp der einzelnen
Deletionsmutanten mittels Populationsanalyse mit dem Wildtyp S. epidermidis 1057
verglichen 122, 152 . Für den Wildtypstamm wurde die bereits bekannte heterogene
Expression der Oxacillinresistenz beobachtet, wobei bereits eine Oxacillinkonzentration
von 3 µg/ml zu einer mehr als hundertfachen Reduktion der kultivierbaren Bakterien
führte, während eine sehr kleine Subpopulation (circa 1:100.000) noch bei einer
Oxacillinkonzentration von 200 µg/ml wachsen konnte (Abbildung 3.26). Bei Mutanten
mit inaktivierter, beziehungsweise stark verminderter σ B -Aktivität konnte ebenfalls ein
heterogener Expressionsphänotyp beobachtet werden. Jedoch war die resistente Subpopulation
bei geringen Oxacillinkonzentrationen (3 – 50 µg/ml Oxacillin) gegenüber
dem Wildtyp circa um den Faktor fünf bis zehn verringert, während die gegenüber
200 µg/ml Oxacillin resistente Subpopulation wiederum mit dem Wildtyp vergleichbar
war. Interessanterweise konnte bei Mutanten mit Inaktivierung von RsbW bei intaktem
sigB Gen ein Wechsel des Expressionsmusters von einer heterogenen zu einer homogenen
Expression der Oxacillinresistenz detektiert werden. Hierbei waren circa 90 %
der Gesamtpopulation resistent gegenüber Oxacillinkonzentrationen von mindestens
50 µg/ml. Somit konnte gezeigt werden, dass der alternative Sigmafaktor σ B einen maßgeblichen
Einfluss auf die Expression der Oxacillinresistenz in S. epidermidis 1057
ausübt.

3 Ergebnisse 78
Abbildung 3.26 Populationsanalyse von S. epidermidis 1057 und den entsprechenden Deletionsmutanten
unter verschiedenen Oxacillinkonzentrationen. Der Wildtypstamm S. epidermidis
1057 wies eine heterogene Expression auf, wobei Oxacillinkonzentrationen von
3 µg/ml zu einer mehr als hundertfachen Reduktion der überlebenden Subpopulation
führte. Mutanten mit inaktivierter, beziehungsweise stark verminderter σ B -Aktivität
wiesen für die niedrigen Konzentrationsbereiche eine zusätzliche circa fünf bis zehnfache
Reduktion der resistenten Subpopulation auf. Die Mutanten 1057rsbW und
1057rsbUVW hingegen wiesen einen Wechsel zu einem homogenen Expressionsphänotyp
auf, wobei mindestens 90 % der Gesamtpopulation Oxacillinkonzentrationen von
50 µg/ml überlebten. Es sind Ergebnisse eins repräsentativen Experimentes dargestellt.

4 Diskussion 79
4 Diskussion
Der entscheidende Pathogenitätsfaktor von S. epidermidis ist die Fähigkeit zur
Anheftung an Polymeroberflächen und zur Bildung mehrlagiger Biofilme 226-228 . Bio-
108, 204, 273, 274
filmbildung vermittelt einen Schutz vor dem wirtseigenen Immunsystem
und führt außerdem zu einer verminderten Antibiotikaempfindlichkeit der angehefteten
Bakterien 61, 69, 71, 86, 99, 154, 242 . Erschwerend kommt hinzu, dass in den vergangenen
Jahren vermehrt Stämme mit multiplen Antibiotika-Resistenzen, insbesondere gegen β-
Lactam-Antibiotika isoliert wurden 13, 83, 100 . Da Fremdkörper-assoziierte und nosokomiale
Infektionen zu einer gesteigerten Morbidität und Mortalität der betroffenen
Patienten führen 180, 225, 254 , ist die Erforschung von Therapieoptionen und Präventionsstrategien
von erheblichem medizinischem Interesse.
Die Biofilmbildung weist eine Zweiphasenkinetik mit einer primären Bindungsphase
und anschließender Akkumulation der Zellen als vielschichtiger Biofilm auf
(Kapitel 1.3, Abbildung 1.1). Dieses wurde in einer Vielzahl von Studien belegt und in
mehreren Übersichtsarbeiten ausführlich dargestellt 97, 169, 176 . Für die Akkumulation ist
das interzelluläre Polysaccharidadhäsin PIA von immanenter Bedeutung. In mehreren
Tiermodellen konnte PIA als Virulenzfaktor für Fremdkörper-assoziierte Infektionen
identifiziert werden 227, 228 . Außerdem konnten Struktur, Funktion und Synthese aufgeklärt
werden 28, 88, 106, 171, 172, 174 , wohingegen die Regulation der PIA Synthese zu Beginn
dieser Arbeit weitgehend unverstanden war.
Die Arbeitsgruppe von Mack et al. hatte mittels Transposonmutagenese in dem
klinischen Isolat S. epidermidis 1457 unter anderem die Biofilm-negativen Mutanten
M12 und M15 generiert 175 . Es konnte gezeigt werden, dass es sich bei den inaktivierten
Genorten um regulative Elemente der Biofilmbildung handelte, während die für die PIA
Synthese verantwortlichen Gene intakt waren (Kapitel 1.4, Abbildung 1.2 und 1.3) 88, 175 .
4.1 Etablierung der Deletionsmutanten des σ B Operons
Die Arbeitsgruppe von Knobloch et al. hatte den PIA- und Biofilm-negativen Phänotyp
der Klasse III Mutante M15 weitergehend analysiert. Die Tn917 Insertion konnte 19
Basen unterhalb des Translationsstarts eines offenen Leserahmens mit hoher Homologie
zu dem ersten Gen rsbU, des σ B Operons von S. aureus und B. subtilis, lokalisiert

4 Diskussion 80
werden (Abbildung 1.3) 148 . Eine Charakterisierung der flankierenden Genabschnitte in
S. epidermidis zeigte drei weitere offene Leserahmen unterhalb der Tn917 Insertion,
welche ebenfalls eine hohe Homologie zu den Genen des σ B Operons in S. aureus und
B. Subtilis, sowie eine identische Anordnung und Orientierung aufwiesen (Abbildung
1.3).
In B. subtilis und S. aureus wird die σ B -Aktivität auf posttranskriptioneller Ebene reguliert
(Abbildung 1.4). Obwohl das zentrale Regulationsmotiv zwischen S. aureus und
B. subtilis konserviert ist, stellt sich die Regulation der σ B -Aktivität in B. subtilis weitaus
komplexer dar (Kapitel 1.4). Somit war zu Beginn dieser Arbeit unklar, inwieweit
sich die in B. subtilis und S. aureus dokumentierten Regulationsmechanismen auf
S. epidermidis übertragen lassen.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Regulation der σ B -Aktivität in S. epidermidis
und insbesondere ihr Einfluss auf die Biofilmbildung weitergehend untersucht. Um
Deletionsmutanten der einzelnen Gene des σ B Operons zu generieren, wurden die notwendigen
Konstrukte für einen homologen Genaustausch in E. coli kloniert (Abbildung
2.1 und 2.2). Im Folgenden wurde ein Elektroporationsverfahren etabliert, um einen
effizienten Transfer von genetischem Material in Staphylokokken zu ermöglichen
(Kapitel 2.2.14). Nach einer Zwischenpassage in dem restriktionsdefizienten S. aureus
Stamm RN4220 konnten die Plasmide in die Mutante M15 transformiert werden. Von
dort konnten sie mittels Phagentransduktion in den eigentlichen Zielstamm S. epidermidis
1457 transduziert werden. Es wurden zunächst Mutanten generiert, bei welchen gezielt
die einzelnen regulativen Gene rsbU, rsbV und rsbW sowie die komplette Regulationskaskade
rsbUVW deletiert wurden. Ebenso konnten Deletionsmutanten des sigB
Genes sowie des gesamten σ B Operons erzeugt werden (Abbildung 3.1, Tabelle 2.8).
Mittels PCR-Analysen wurde die korrekte Insertion der für den homologen Genaustausch
verwendeten Resistenzkassette (erm) überprüft (Abbildung 2.3). Die Größe der
jeweiligen Amplifikate entsprach der zu erwartenden Größe bei einer korrekten Insertion
(Abbildung 3.2, Tabelle 3.1). Durch eine Sequenzierung der flankierenden chromosomalen
Bereiche konnten zusätzliche, unerwünschte genetische Veränderungen ausgeschlossen
werden.
Unter Standard Kulturbedingungen in TSB Medium konnte für die Mutanten 1457rsbU,
1457rsbV, 1457sigB und 1457rsbUVWsigB ein Biofilm-negativer Phänotyp beobachtet
werden (Abbildung 3.9). Die Biofilmbildung der Mutanten konnte durch Ethanol,

4 Diskussion 81
jedoch nicht durch NaCl Supplementierung des Kulturmediums rekonstituiert werden.
Die Mutanten 1457rsbW und 1457rsbUVW zeigten in TSB Medium eine gegenüber
dem Wildtyp gesteigerte Biofilmbildung, welche durch Zugabe von Ethanol und NaCl
noch weiter gesteigert werden konnte (Abbildung 3.9).
Mittels Phagentransduktion wurden alle Deletionen zurück in den Ausgangsstamm
S. epidermidis 1457 transduziert. Da alle Transduktanten im Vergleich zu den primär
generierten Mutanten einen nahezu identischen Phänotyp boten, konnte die Koppelung
von Genotyp und Phänotyp bestätigt werden (Abbildung 3.9 und 3.11). Alle Mutanten
erreichten unter statischen Kulturbedingungen Zellzahlen, welche mit dem Wildtypstamm
vergleichbar waren, so dass die Unterschiede der Biofilmexpression nicht auf
unterschiedliche Wachstumsraten zurückzuführen sind (Abbildung 3.10).
Das Transkriptionsverhalten der Mutanten wurde mittels Northern Blot Analysen und
real time PCR Untersuchungen überprüft. Eine Transkription von dem putativen σ A -abhängigen
Promotor vor rsbU konnte mittels Hybridisierung mit einer rsbU-spezifischen
Sonde in Northern Blot Technik weder im Wildtyp, noch in den Mutanten nachgewiesen
werden. Mit Hilfe der real time PCR konnte jedoch gezeigt werden, dass zwischen
Wildtyp und Mutanten mit intaktem rsbU keine signifikanten Transkriptionsunterschiede
für rsbU bestanden (Abbildung 3.5, Tabelle 3.2).
Hybridisierungen mit einer sigB-spezifischen Sonde wiesen in den Mutanten 1457rsbU,
1457rsbV, 1457rsbW und 1457rsbUVW Transkripte nach, deren Größe einen Transkriptionsstart
von dem σ A -abhängigen Promotor des erm Gens vermuten ließen (Abbildung
3.3 A und 3.4). Mittels Hybridisierung mit einer erm-spezifischen Sonde konnten in
diesen Mutanten Transkripte identischer Größe detektiert werden (Abbildung 3.3 B). Da
im Northern Blot keine Transkription von dem vor rsbU gelegenen Promotor detektiert
werden konnte, spricht die beobachtete identische Größe der mit den beiden Sonden
hybridisierten Transkripte dafür, dass die Transkription von dem stärkeren σ A -abhängigen
erm Promotor erfolgte. Auch in den Mutanten 1457sigB und
1457rsbUVWsigB konnten mittels Hybridisierung mit einer erm-spezifischen Sonde
Transkripte detektiert werden, deren Größen dieser Hypothese entsprachen (Abbildung
3.3 B). Weiterhin wurde mittels einer erm-spezifischen Sonde in allen Mutanten ein schwaches,
circa 1,2 kb großes Transkript detektiert, dessen Größe der Erythromycin Resistenzkassette
entsprach. Somit konnte gezeigt werden, dass dem erm Gen ein
schwacher Transkriptionsterminator nachgeschaltet ist, welcher jedoch die Transkripti-

4 Diskussion 82
on der in 3´ Richtung gelegenen Gene nicht signifikant inhibierte. Ein Großteil der
Transkripte wurde über diesen Terminator hinweg bis zu einem weiteren, unmittelbar
hinter sigB lokalisierten Transkriptionsterminator gelesen, so dass durch Hybridisierung
mit einer erm-spezifischen Sonde zwei Transkripte unterschiedlicher Größe und Intensität
nachgewiesen werden konnten (Abbildung 3.3 B und 3.4).
In B. subtilis und S. aureus konnte bereits ein σ B -abhängiger Promotor im σ B Operon
unmittelbar vor dem Gen rsbV identifiziert werden (Abbildung 1.3) 206, 240 . Im Wildtyp
S. epidermidis 1457 konnte durch Hybridisierung mit einer sigB-spezifischen Sonde ein
circa 1,7 kb großes Transkript detektiert werden (Abbildung 3.3 A und 3.4). Diese
Größe entsprach der zu erwartenden Größe bei einem Transkriptionsstart von dem
putativ σ B -abhängigen Promotor vor rsbV (Abbildung 3.4), so dass dieser Promotor
mittels real time PCR weiter untersucht wurde. Hierbei bot die Mutante S. epidermidis
1457sigB eine gegenüber dem Wildtypstamm um den Faktor 8,6 verringerte Transkription
von rsbV (Abbildung 3.5). Wie bereits ausgeführt wurde, konnte bezüglich der
Transkription von dem vor rsbU gelegenen σ A -abhängigen Promotor kein Transkriptionsunterschied
im Vergleich zum Wildtyp detektiert werden (Tabelle 3.2). Somit
konnte der weiter stromabwärts beobachtete σ B -abhängige Transkriptionsunterschied
auf den vor rsbV gelegenen Promotor zurückgeführt und seine σ B -abhängige Transkription
bestätigt werden.
4.2 Regulation der Biofilmbildung durch σ B
4.2.1 Untersuchung der σ B -Aktivität in S. epidermidis 1457
Aufgrund der posttranskriptionellen Regulation der σ B -Aktivität in Staphylokokken ließ
eine Transkriptionsanalyse des sigB Gens keine Aussage über die Menge des freien σ B -
Proteins zu (Abbildung 1.4). Um diesbezüglich eine Aussage zu treffen, musste ein
direkt σ B -abhängig transkribiertes Gen untersucht werden. Mittels primer extension
Analysen konnten Fluckiger et al. beweisen, dass der P 1 Promotor des sarA Gens in
S. epidermidis σ B -abhängig transkribiert wird 80 , so dass dieses Gen im Folgenden als
Indikator für die σ B -Aktivität verwendet wurde (Abbildung 3.7 B und 3.8 B). In S. epidermidis
wird sarA von zwei weiteren σ A -abhängigen Promotoren transkribiert 80 , deren
Transkripte in Northern Blot Experimenten als Kontrolle zum Vergleich unterschied-

4 Diskussion 83
licher RNA Präparationen verwendet werden konnten. Allerdings stellte sich sarA somit
ungeeignet für eine Analyse der σ B -Aktivität mittels real time PCR dar (Abbildung
3.22). In S. aureus ist das von drei σ B -abhängigen Promotoren transkribierte Gen asp23
regelmäßig als Marker für die σ B -Aktivität verwendet worden 89, 91, 161 . Daher wurde für
das homologe Gen in S. epidermidis eine Promotorsuche mit der Konsensussequenz für
σ B -abhängige Promotoren durchgeführt 101, 206 . Es konnten insgesamt drei putative σ B -
abhängige Promotoren identifiziert werden, wobei zwei dieser Promotoren (P 1 und P 2 )
im Vergleich zu S. aureus konserviert waren (Abbildung 3.6). Mittels Hybridisierung
mit einer asp23-spezifischen Sonde konnten für den Wildtyp S. epidermidis 1457 zwei
Transkripte von circa 1,5 und 0,6 kb Größe detektiert werden (Abbildung 3.7 A und
3.8 A). Dieses entsprach den zu erwartenden Größen bei einem Transkriptionsstart von
den Promotoren P 1 und P 2 . Aufgrund des geringen Abstandes zwischen dem Promotor
P 2 und P 3 kann nicht sicher ausgeschlossen werden, dass das größere Transkript ebenfalls,
beziehungsweise ausschließlich von dem direkt benachbarten Promotor P 3 transkribiert
wird.
Eine Untersuchung der σ B -Aktivität von S. epidermidis 1457 zeigte zu verschiedenen
Zeitpunkten die höchste Aktivität nach 7 h in der exponentiellen Wachstumsphase
(Abbildung 3.7), so dass die Transkriptionsanalysen zunächst zu diesem Zeitpunkt
durchgeführt wurden. In den Mutanten 1457rsbV, 1457sigB und 1457rsbUVWsigB
konnten keine σ B -abhängigen Transkripte von asp23 oder sarA detektiert werden
(Abbildung 3.8). Lediglich für die Mutante 1457rsbU konnte in einzelnen Experimenten
eine extrem schwache, σ B -abhängige Transkription beobachtet werden. Somit
konnte analog zum Biofilm-negativen Phänotyp unter Standard Kulturbedingungen in
TSB Medium (Abbildung 3.9) eine fehlende, beziehungsweise stark verminderte σ B -
Aktivität in diesen Mutanten nachgewiesen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden,
dass die Gene rsbU und rsbV in S. epidermidis für positive Regulatoren der σ B -Aktivität
kodieren. Eine schwache, σ B -abhängige Transkription in der Mutante 1457rsbU belegt,
dass RsbU für eine vollständige σ B -Aktivierung notwendig ist, wobei jedoch auch bei
fehlendem RsbU geringe Mengen von freiem σ B in den Zellen vorliegen können.
Die Mutanten 1457rsbW und 1457rsbUVW boten unter den untersuchten Bedingungen
eine im Vergleich zum Wildtyp gesteigerte Biofilmexpression (Abbildung 3.9), es
wurde jedoch ein mit dem Wildtyp vergleichbares Transkriptionsniveau der σ B -
abhängigen asp23 und sarA Transkripte beobachtet (Abbildung 3.8). Diese Befunde

4 Diskussion 84
lassen eine Aussage über die putative negative Regulationsfunktion von RsbW nicht zu.
Ein positiv regulierender Einfluss konnte allerdings sicher ausgeschlossen werden.
Möglicherweise führt die fehlende Regulation der σ B -Aktivität in den Mutanten
während des Wachstums zu einer konstitutiven Expression von sigB und somit zu einer
Überexpression von PIA.
Die mittels Northern Blot Hybridisierung gewonnenen Daten bezüglich der σ B -Aktivität
sollten auch mittels real time PCR überprüft werden. Da in Mutanten mit fehlender σ B -
Aktivität keines der beiden asp23 Transkripte nachgewiesen wurde (Abbildung 3.8 A),
konnte belegt werden, dass asp23 auch in S. epidermidis ausschließlich σ B -abhängig
transkribiert wird. Somit konnte asp23 als Indikator für die σ B -Aktivität in real time
PCR Untersuchungen verwendet werden. Mittels asp23-spezifischen Primern konnten
die in den Northern Blot Analysen erhobenen Daten ebenfalls mittels real time PCR
bestätigt werden (Abbildung 3.16). Zusammenfassend konnte somit für S. epidermidis
eine mit S. aureus und der zentralen Regulationskaskade von B. subtilis vergleichbare
Regulation der σ B -Aktivität dokumentiert und eine σ B -abhängige Regulation der
Biofilmbildung in S. epidermidis 1457 belegt werden (Abbildung 1.4).
4.2.2 Transduktion in unabhängige genetische Hintergründe
Für S. aureus bestehen widersprüchliche Daten bezüglich der Bedeutung einer σ B -abhängigen
Biofilmbildung 216, 259 . Eine σ B -abhängige Biofilmbildung konnte nur in einem
einzigen S. aureus Isolat unter speziellen Umweltbedingungen demonstriert werden 216 .
Vielmehr konnte gezeigt werden, dass SarA und nicht σ B für die Biofilmbildung
essentiell ist 259 . Somit stellt sich die Frage, ob es sich bei der in S. epidermidis 1457
beobachteten σ B -abhängigen Regulation der Biofilmbildung um einen Einzelfall oder
um ein generelles regulatives Prinzip in S. epidermidis handelt 121, 123 .
Um eine umfassendere Aussage über die Bedeutung einer σ B -abhängigen Biofilmbildung
in S. epidermidis treffen zu können, wurden die in S. epidermidis 1457
generierten Deletionsmutationen in den unabhängigen, Oxacillin-sensiblen genetischen
Hintergrund des klinischen Isolates S. epidermidis 8400 transduziert. Zusätzlich wurden
die in S. epidermidis 1457 generierten Deletionsmutationen in den unabhängigen,
Oxacillin-resistenten genetischen Hintergrund des klinischen Isolates S. epidermi-

4 Diskussion 85
dis 1057 transduziert, da typische S. epidermidis Isolate aus Fremdkörper-assoziierten
Infektionen Oxacillin-resistent sind 83, 157, 221, 295 .
In diesen neu generierten Mutanten wurde ebenfalls ein differentieller Phänotyp der
Biofilmbildung beobachtet. Dieser war vergleichbar mit der Biofilmexpression von
S. epidermidis 1457 und den jeweiligen Mutanten (Abbildung 3.17 und 3.18). Eine
Messung der asp23 Transkription in den ΔrsbUVWsigB Mutanten zeigte eine 280- bis
830-fache Reduktion der σ B -Aktivität, so dass eine Inaktivierung des alternativen
Sigmafaktors in diesen Mutanten bestätigt werden konnte (Abbildung 3.22). Die
ΔrsbUVW Mutanten der Stämme 8400 und 1057 zeigten ebenfalls eine leicht verminderte
σ B -Aktivität in der exponentiellen Wachstumsphase. In der stationären Phase bot
lediglich die Mutante 1057rsbUVW eine gering reduzierte σ B -Aktivität (Abbildung
3.22). Diese Beobachtung unterstützt die Annahme, dass σ B in ΔrsbUVW Mutanten
konstitutiv exprimiert wird, während es im Wildtypstamm zu einer Hochregulation in
der exponentiellen Wachstumsphase kommt.
Die phänotypische Charakterisierung der Mutanten mit Inaktivierung von rsbU
(1457rsbU, 8400rsbU, 1057rsbU) zeigte eine extrem verminderte PIA Synthese und
Biofilmbildung unter den Standard-Anzuchtbedingungen in TSB Medium. Supplementierung
des Mediums mit NaCl führte weder zu einer Rekonstitution der PIA Synthese
noch der Biofilmbildung, wohingegen die Beimengung von Ethanol einen PIAund
Biofilm-positiven Phänotyp induzierte (Abbildung 3.9, 3.12 bis 3.14 und 3.17 bis
3.20). Dieser Phänotyp korrespondierte mit dem von Knobloch et al. dokumentierten
Verhalten der Transponsoninsertions-Mutanten M15 und 8400-M15 148 . Gleichzeitig imponierte
die bereits für die Mutanten M15 und 8400-M15 beobachtete verminderte Pigmentierung
der Kolonien. Somit konnte untermauert werden, dass die in den M15
Mutanten beobachteten phänotypischen Veränderungen auf einer Inaktivierung von
rsbU beruhen und nicht durch polare Effekte der Transposoninsertion bedingt sind.
Der unter Standard Kulturbedingungen beobachtete PIA- und Biofilm-negative Phänotyp
der Mutanten 1457rsbV, 8400rsbV und 1057rsbV belegte die Annahme, dass die
RsbU-abhängige Modulation der σ B -Aktivität über RsbV erfolgt, wobei RsbV als
positiver Regulator der σ B -Aktivität fungiert (Abbildung 3.9, 3.13 bis 3.14 und 3.17 bis
3.20). Eine direkte, σ B -unabhängige Regulation der Biofilmexpression durch RsbU und
RsbV konnte aufgrund des PIA- und Biofilm-negativen Phänotyps der sigB Mutanten
mit intaktem rsbU und rsbV (1457sigB, 8400sigB, 1057sigB) ausgeschlossen werden.

4 Diskussion 86
In S. aureus konnte SarA als zentraler Regulator der Biofilmsynthese identifiziert
werden 259 . In S. epidermidis konnte ein positiver regulativer Einfluss des sarA Gens auf
die icaADBC Transkription nachgewiesen werden 46 . Allerdings führte die Zugabe von
NaCl und Ethanol zum Medium, bei einer Mutante mit inaktiviertem sarA, zur
icaADBC Transkription, ohne dass es zur Rekonstitution der Biofilmbildung kam 46, 56 .
Somit muss postuliert werden, dass die regulative Funktion von SarA zusätzlich auf
einer posttranskriptionellen Stufe der PIA Synthese ansetzt. Bemerkenswerterweise
wird sarA von einem σ B -abhängigen und zwei σ A -abhängigen Promotoren transkribiert
(Abbildung 3.7 B) 80 . Eine Analyse der Transkriptionsaktivität von sarA zeigte lediglich
für die Mutanten 8400rsbUVWsigB und 8400rsbUVW eine signifikante Veränderung in
Form einer 5,8-fachen, beziehungsweise 3,7-fachen Reduktion in der exponentiellen
Wachstumsphase (Abbildung 3.22). In der stationären Wachstumsphase boten diese
Mutanten, ebenso wie alle anderen untersuchten Mutanten, keine signifikanten
Unterschiede der sarA Transkription. Die beobachteten Transkriptionsunterschiede
korrelierten nicht mit dem beobachteten Phänotyp der Biofilmexpression in diesen
Mutanten. Hieraus ergibt sich, dass sarA trotz seiner teilweise σ B -abhängigen Transkription
als σ B -unabhängiger Regulator der Biofilmsynthese fungiert. Außerdem
scheint der Wegfall des σ B -abhängigen sarA Transkriptes zumindest teilweise durch die
beiden σ A -abhängigen Transkripte kompensiert zu werden.
Insgesamt muss gefolgert werden, dass die in S. aureus erhobenen Daten zur Regulation
der Biofilmbildung nicht verwendet werden können, um direkte Rückschlüsse auf eine
Regulation in S. epidermidis zu ziehen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die in
S. epidermidis 1457 dokumentierte σ B -abhängige Regulation der Biofilmbildung keinen
Einzelfall darstellt. Der Nachweis einer σ B -abhängigen Biofilmexpression in drei unabhängigen
klinischen Isolaten weist darauf hin, dass im Gegensatz zu S. aureus 259 , der
alternative Sigmafaktor σ B in S. epidermidis von genereller Bedeutung für die Regulation
der Biofilmbildung ist.
4.2.3 Einfluss von σ B auf die icaADBC Transkription
Die Transkriptionsanalysen der Mutanten mit Inaktivierung von sigB zeigten, dass der
PIA- und Biofilm-negative Phänotyp dieser Mutanten mit einer supprimierten
Transkription des icaADBC Operons einhergeht (Abbildung 3.15, 3.16 und 3.21). Je

4 Diskussion 87
nach untersuchtem Stamm konnte eine 13,6- bis 150-fache Suppression in der exponentiellen
Wachstumsphase, beziehungsweise 2,8 bis 18,2-fache Suppression in der stationären
Wachstumsphase detektiert werden.
Die Arbeitsgruppe von Knobloch et al. hatte jedoch zeigen können, dass das icaADBC
Operon keinen σ B -abhängigen Promotor besitzt 148 , somit muss die σ B -abhängige Regulation
der Biofilmbildung über mindestens einen weiteren regulativen Zwischenschritt
erfolgen. Für das Genprodukt des Gens icaR, welches direkt oberhalb des icaADBC
Operons in entgegengesetzter Orientierung lokalisiert ist, konnte die Arbeitsgruppe von
Conlon et al. bereits einen negativen regulativen Einfluss auf die Transkription des
icaADBC Operons demonstrieren 44, 45 .
In Mutanten von S. epidermidis 1457 mit verminderter σ B -Aktivität (1457rsbU,
1457rsbV, 1457sigB und 1457rsbUVWsigB) imponierte eine im Vergleich zum Wildtyp
deutlich gesteigerte Transkription von icaR, bei gleichzeitig verminderter Transkription
von icaA (Abbildung 3.15 und 3.16). Für die ΔrsbUVWsigB Mutanten der Stämme
S. epidermidis 8400 und 1057 konnte, passend zum Biofilm-negativen Phänotyp, ebenfalls
eine verminderte icaA Transkription sowohl in der stationären, als auch in der exponentiellen
Wachstumsphase dokumentiert werden (Abbildung 3.21 A-D). Allerdings
konnte nur in der exponentiellen Wachstumsphase und nur für die Mutante
1057rsbUVWsigB eine signifikant erhöhte (3,4-fache) icaR Transkriptionsaktivität
detektiert werden. Die in der stationären Phase gemessene Veränderung und die Transkriptionsunterschiede
in der Mutante 8400rsbUVWsigB erreichten kein signifikantes
Niveau. Eine Verminderung der icaR Transkriptionsaktivität wurde jedoch in keiner der
Transkriptionsanalysen beobachtet, so dass zumindest eine leicht gesteigerte icaR Transkription
als eine kennzeichnende Eigenschaft der Mutanten mit Inaktivierung von σ B
bestätigt werden konnte.
Eine Inaktivierung der regulativen Kaskade rsbUVW führte in allen Mutanten zu einer
gegenüber dem Wildtyp gesteigerten Biofilmbildung. Jedoch wurden in den jeweiligen
Isolaten unterschiedliche Transkriptionsprofile beobachtet. Die Mutante 1457rsbUVW
bot nur in der exponentiellen Phase eine gesteigerte icaA Transkription, wobei die Regulation
von icaR zu keinem Zeitpunkt ein signifikantes Niveau erreichte (Abbildung
3.16). Für die Mutante 8400rsbUVW wurde, analog zu der stark gesteigerten Biofilmbildung,
eine signifikant verstärkte icaA-Transkription in der exponentiellen und in der
stationären Phase detektiert. Die Transkriptionsaktivität von icaR war zu diesen Zeit-

4 Diskussion 88
punkten 3,4- beziehungsweise 2,2-fach vermindert (Abbildung 3.21). In der Mutante
1057rsbUVW wurde icaA während der exponentiellen Phase leicht vermindert und in
der stationären Phase geringfügig verstärkt transkribiert. In der stationären Phase wurde
außerdem eine leicht verringerte icaR Transkription detektiert. Diese Unterschiede sind
möglicherweise in einer konstitutiven sigB Expression dieser Mutanten begründet,
wohingegen das σ B Operon in den Wildtypstämmen einer Autoregulation unterliegt.
Somit konnte belegt werden, dass die σ B -abhängige Regulation der Biofilmbildung über
eine Regulation der icaADBC Transkription durch den negativen Regulator IcaR
vermittelt wird. Da σ B als Transkriptionsfaktor nur einen aktivierenden Einfluss ausüben
kann, muss die Regulation von IcaR folglich über ein weiteres, bisher unbekanntes
Intermediat erfolgen. Die von den Arbeitsgruppen Kies et al. 137 und Mack et al. 175 demonstrierte
Rekonstitution der Biofilmbildung durch Expression des icaADBC Operons
in trans in Mutanten mit Inaktivierung von sigB, ist somit am ehesten auf eine Überexpression
von icaADBC zurückzuführen, da die verwendeten Plasmide nicht das Gen für
den negativen Regulator IcaR enthielten.
Aufgrund des differentiellen Phänotyps der Mutante M15 hatten Knobloch et al. die
Vermutung postuliert, dass die Ethanol Induktion der Biofilmbildung möglicherweise
über eine RsbU unabhängige σ B -Aktivierung erfolgt, wie sie in B. subtilis beobachtet
wird 148 . Da jedoch auch die Mutanten mit Deletion des sigB Gens einen vergleichbaren
Phänotyp aufwiesen, konnte diese These widerlegt werden (Abbildung 3.9, 3.11, 3.13,
3.14, 3.17 bis 3.20). Als direkte Zielstruktur einer therapeutischen Intervention im
Rahmen Fremdkörper-assoziierter Infektionen erscheint der alternative Sigmafaktor σ B
somit nicht geeignet, da die aufgezeigte σ B -unabhängige Aktivierung der Biofilmbildung
einen solchen Therapieansatz umgehen könnte.
Conlon et al. konnten zeigen, dass Ethanol in der Lage ist, die Transkription von icaR
zu reprimieren 44 . Daher wurde diese Eigenschaft in den Deletionsmutanten weiter untersucht.
Wie bereits ausgeführt wurde, konnte in den Mutanten 1457rsbU, 1457sigB und
1457rsbUVWsigB, eine im Vergleich zum Wildtyp deutlich verstärkte icaR Transkription
bei gleichzeitiger Repression von icaA dokumentiert werden. Supplementierung des
Mediums mit Ethanol führte analog zu der rekonstituierten Biofilmbildung zu einer
Repression von icaR, sowie einer konsekutiv gesteigerten Transkription von icaA
(Abbildung 3.23). Somit kann neben der bereits gezeigten σ B -abhängigen Repression
von IcaR, eine σ B -unabhägige Repression von IcaR durch Ethanol postuliert werden.

4 Diskussion 89
Die Arbeitsgruppe von Knobloch et al. hatte zeigen können, dass subinhibitorische
Konzentrationen verschiedener Alkohole, welche zur Hautdesinfektion verwendet
werden, eine Biofilmbildung induzieren können 149 . Möglicherweise könnte eine
therapeutische Beeinflussung von IcaR das Risiko der Entstehung einer Fremdkörperassoziierten
Infektion bei unsachgemäßem Gebrauch von alkoholischen Desinfektionsmitteln
verringern. Allerdings konnten Conlon et al. bereits in einer icaR Insertionsmutante
eine Biofilmbildung durch erhöhte Osmolarität induzieren 45 . Somit erscheint
dieser Regulationsweg als Zielstruktur einer therapeutischen Intervention im Rahmen
Fremdkörper-assoziierter Infektionen aufgrund dieses potentiellen Umgehungsweges
ebenfalls nur bedingt geeignet.
Obwohl sich die Biofilmbildung des Wildtyps S. epidermidis 1457 durch Ethanol induzieren
ließ, wurde in TSB EtOH 3% eine verminderte asp23 und icaADBC Transkription
beobachtet (Abbildung 3.23). Somit kann ein inhibitorischer Effekt von Ethanol auf die
σ B -Aktivität angenommen werden. Aufgrund der beobachteten Dissoziation zwischen
icaADBC Transkription und Biofilmbildung muss jedoch mindestens ein weiterer
Faktor involviert sein, welcher posttranskriptionell von icaADBC in die Biofilmsynthese
eingreift. Eine Glukose-abhängige Dissoziation zwischen Biofilmbildung und
icaADBC Transkription wurde bereits für S. epidermidis 1457 unter Nährstoff
Limitation beschrieben 56 . Die Arbeitsgruppe von Vuong et al. hatte vor kurzem die
Hypothese aufgestellt, dass diese Beobachtung möglicherweise auf eine veränderte
Aktivität im Krebs-Zyklus zurückzuführen ist 158, 272 . Weiterhin konnte in einer S. epidermidis
Mutante mit inaktiviertem sarA durch erhöhte Osmolarität und Supplementierung
des Mediums mit Ethanol die icaADBC Transkription rekonstituiert werden,
ohne dass die Mutante einen Biofilm exprimierte 46 . Um diese Beobachtungen zu
erklären, muss mindestens ein weiterer Glukose- beziehungsweise sarA-abhängiger
posttranskriptioneller Regulator der PIA Synthese postuliert werden, welcher
möglicherweise auch für die hier beobachtete Dissoziation verantwortlich ist.
4.3 Regulation der Biofilmbildung durch barAB
Neben den bereits beschriebenen Klasse III Mutanten konnte die Arbeitsgruppe von
Mack et al. weitere Biofilm-negative Mutanten in S. epidermidis 1457 generieren 175 .
Für die Klasse II Mutante M12 konnten Knobloch et al. mittels arbitrary PCR zeigen,
dass Tn917 am distalen Ende eines offenen Leserahmens mit Homologie zu den purR

4 Diskussion 90
Genen von B. subtilis, S. aureus und Lactococcus lactis inseriert ist (Abbildung 1.2) 153 .
Zu der Funktion von purR liegen in unterschiedlichen Spezies widersprüchliche Daten
vor. So kodiert purR in B. subtilis für einen negativen Regulator der Purinsynthese 281,
282 , wohingegen PurR in L. lactis für die Synthese von Purinen essentiell ist 138 . In
S. aureus und S. epidermidis konnte für das PurR Homolog bisher keine Funktion
nachgewiesen werden, jedoch lässt die hoch-konservierte Aminosäurensequenz eine mit
B. subtilis vergleichbare Funktion vermuten. Auch die purR flankierenden Gene yabJ
und spoVG sind zwischen S. epidermidis, S. aureus und B. subtilis konserviert 147 .
Die Transposoninsertion in der Mutante M12 führt zur Inaktivierung eines purR und
drei weitere Gene umfassenden, circa 2,6 kb großen Transkriptes, sowie eines circa
1 kb großen, lediglich die flankierenden yabJ- und spoVG- homologen Gene umfassenden
Transkriptes 18 . Komplementierungsversuche mit den jeweiligen Einzelgenen
konnten zeigen, dass die yabJ- und spoVG- homologen Gene gemeinsam für die Expression
eines Biofilms notwendig sind, wohingegen purR nicht für die Biofilmbildung
erforderlich ist 18 . Da den beiden homologen Genen in S. epidermidis bisher keine
Funktion zugeordnet werden konnte, wurden sie gemäß ihrer Funktion als biofilm
accumulation regulator A und B (barAB) bezeichnet 147 .
Die Promotorsuche für barAB identifizierte innerhalb der kodierenden Sequenz des
purR Gens einen putativ σ B -abhängigen Promotor. Mittels Transkriptionsanalysen der
Mutanten von S. epidermidis 1457 mit verminderter σ B -Aktivität, konnte in dieser
Arbeit die σ B -abhängige Transkription von barAB belegt werden (Abbildung 3.24). Die
Transkriptionsanalyse von icaADBC und icaR zeigte für die Mutante M12 eine icaR-unabhängige
Repression der icaADBC Transkription (Abbildung 3.25). Somit lässt sich
die Hypothese aufstellen, dass barAB einen direkten, übergeordneten, positiv regulativen
Einfluss auf die icaADBC Transkription haben (Abbildung 4.1). Da Ethanol auch in
Mutanten mit fehlender, beziehungsweise stark verminderter σ B -Aktivität zur
Rekonstitution der PIA Synthese und Biofilmbildung führt, konnte belegt werden, dass
die Transkription von barAB von dem deutlich schwächeren, σ B -unabhägigen Promotor
oberhalb von purR für eine Biofilmbildung ausreichend ist.

4 Diskussion 91
Abbildung 4.1
Regulationsmodell der Biofilmbildung in S. epidermidis. Der wichtigste Virulenzfaktor
von S. epidermidis ist das interzelluläre Polysaccharidadhäsin PIA. Es wird durch die
Genprodukte des icaADBC Operons synthetisiert. Die Transkription von icaADBC steht
unter dem negativen regulativen Einfluss von IcaR. Über ein oder mehrere, bisher unbekannte
Intermediate wird icaR in Abhängigkeit des alternativen Sigmafaktors σ B und
durch Ethanol inhibiert. Außerdem wird der positive Regulator der icaADBC Synthese
barAB maßgeblich σ B -abhängig transkribiert. Der alternative Sigmafaktor σ B wird
negativ durch den Anti-Sigmafaktor RsbW reguliert, welcher gleichzeitig als RsbVspezifische
Kinase fungiert. Die Aktivität des Anti-Anti-Sigmafaktors RsbV ist abhängig
vom Phosphorilierungsgrad, wobei inaktives phosphoriliertes RsbV durch die
spezifische Phosphatase RsbU aktiviert werden kann. Ein unmittelbar vor rsbV
gelegener, σ B -abhängiger Promotor vermittelt eine Autoinduktion das σ B Operons.
Interessanterweise hat der alternative Sigmafaktor σ B ebenfalls Einfluss auf die Oxacillinresistenz,
einen weiteren Virulenzfaktor von S. epidermidis. Die Gene asp23 und

4 Diskussion 92
sarA werden exklusiv, beziehungsweise teilweise σ B -abhängig transkribiert, wobei
SarA einen positiven regulativen Einfluss auf die icaADBC Transkription besitzt.
Außerdem wird für SarA auch ein posttranskriptioneller Einfluss auf die PIA Synthese
angenommen. Die Bedeutung von SarA für die Virulenz von S. epidermidis konnte
bisher nicht abschließend geklärt werden. Ovale stellen Proteine, Rechtecke Gene dar.
Geknickte Pfeile repräsentieren σ A - beziehungsweise σ B -abhängige Promotoren (P A
und P B ). B Negative Einflüsse sind rot, positive Einflüsse grün dargestellt.
Die erhobenen Daten erlauben es, ein umfassenderes Modell der transkriptionellen und
posttranskriptionellen Regulation der Biofilmbildung in S. epidermidis aufzustellen
(Abbildung 4.1). Als ein möglicher Angriffspunkt einer therapeutischen Intervention im
Rahmen Fremdkörper-assoziierter Infektionen konnte barAB als übergeordneter, für die
Biofilmbildung essentieller Regulator identifiziert werden.
4.4 Einfluss von σ B auf die Oxacillinresistenz
Infektions-assoziierte S. epidermidis Isolate besitzen, im Vergleich zu kommensalen
Isolaten, neben dem icaADBC Operon signifikant häufiger das mecA Gen, welches eine
Resistenz gegenüber allen β-Laktamantibiotika vermittelt und somit einen weiteren
Virulenzfaktor darstellt 83 . Die Arbeitsgruppe von Mack et al. konnte zeigen, dass in
dem heterogen Oxacillin-resistenten Stamm S. epidermidis 1057 eine Transposoninsertion
in rsbU zu einer Abnahme der Oxacillin-resistenten Subpopulation führte 177 . Eine
Inaktivierung von σ B in einem homogen Oxacillin-resistenten S. aureus Isolat führte zu
einer erheblich verminderten Resistenz gegenüber Oxacillin 289 .
Mit Hilfe der Transduktanten in S. epidermidis 1057 sollte der Einfluss des alternativen
Sigmafaktors σ B auf die Expression der Oxacillinresistenz in S. epidermidis weiter
untersucht werden. Mutanten mit fehlender, beziehungsweise stark verminderter σ B -
Aktivität besaßen eine im Vergleich zum Wildtyp kleinere Oxacillin-resistente Subpopulation
(Abbildung 3.26). Diese Daten belegen die Annahme, dass die Verminderung
der Oxacillinresistenz durch eine σ B -abhängige Regulation und nicht über eine
Regulation durch RsbU, beziehungsweise RsbV vermittelt wird. Mutanten mit einer
Inaktivierung des Anti-Sigmafaktors RsbW bei intaktem sigB Gen boten im Gegensatz
zum Wildtyp, interessanterweise eine homogene Expression der Oxacillinresistenz.
Somit konnte erstmalig in Staphylokokken gezeigt werden, dass die Inaktivierung von

4 Diskussion 93
RsbW zu einer deutlich gesteigerten Oxacillinresistenz führt, wobei der größte Anteil
der Population noch auf Agarplatten mit bis zu 50 µg/ml Oxacillin angezüchtet werden
konnte. Für ein genaues Verständnis der σ B -abhängigen Expression der Oxacillinresistenz
müssen die regulativen Mechanismen der Oxacillinresistenz in S. epidermidis
noch detaillierter untersucht werden.

5 Zusammenfassung 94
5 Zusammenfassung
Im Rahmen von Fremdkörper-assoziierten Infektionen ist die Fähigkeit zur Etablierung
mehrlagiger Biofilme auf Polymeroberflächen der entscheidende Pathogenitätsfaktor
von S. epidermidis. Das interzelluläre Polysaccharidadhäsin PIA, welches die Akkumulation
der Zellen vermittelt, wird durch die Genprodukte des icaADBC Genlokus
synthetisiert. Interessanterweise wird in klinisch relevanten Isolaten eine signifikant
höhere Prävalenz von icaADBC, sowie des für die Oxacillinresistenz verantwortlichen
Gens mecA beobachtet. Vor Beginn dieser Arbeit konnte eine differentielle Biofilmexpression
der Mutante M15, verursacht durch Insertion von Tn917 in das erste Gen rsbU
des σ B Operons beobachtet werden. Die genauen Mechanismen der Regulation der PIA
Synthese in S. epidermidis waren zu Beginn der Arbeit nahezu unbekannt und sollten
weitergehend charakterisiert werden. In S. epidermidis umfasst das σ B Operon die Gene
rsbU, rsbV, rsbW und sigB. Die jeweiligen Einzelgene, ebenso wie die Regulationskaskade
rsbUVW und das gesamte σ B Operon konnten im Rahmen dieser Arbeit durch
homologen Genaustausch inaktiviert werden. Transkriptionsanalysen der zumindest
teilweise σ B -abhängig transkribierten Gene sarA und asp23 konnten nachweisen, dass
rsbU und rsbV für positive Regulatoren der σ B -Aktivität kodieren.
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Regulation der Biofilmbildung durch RsbU
über den alternativen Sigmafaktor σ B vermittelt wird. Diese σ B -abhängige Regulation
konnte in drei unabhängigen, klinisch relevanten Isolaten nachgewiesen werden, so dass
der alternative Sigmafaktor von essentieller Bedeutung für die Regulation der Biofilmbildung
in S. epidermidis zu sein scheint.
Transkriptionsanalysen des icaADBC Operons und seines negativen Regulators icaR
ergaben, dass icaR über ein bisher unbekanntes Intermediat σ B -abhängig inhibiert wird.
Für eine Induktion von icaADBC unter Ethanoleinfluss konnte hingegen eine σ B -
unabhängige Repression der icaR Transkription demonstriert werden. Als mögliche
Angriffspunkte einer therapeutischen Intervention erscheinen σ B und icaR aufgrund der
gezeigten σ B -unabhängigen Induktion der Biofilmbildung durch Ethanol, sowie der von
Conlon et al. beschriebenen IcaR-unabhängigen Induktion durch NaCl allerdings
ungeeignet.
Bereits vor Beginn der Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Biofilm-negative
Phänotyp der Mutante M12 durch Inaktivierung der biofilm accumulation regulator A

5 Zusammenfassung 95
und B (barAB) verursacht wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnte belegt werden, dass
barAB direkt σ B -abhängig transkribiert werden. Als übergeordneter Regulator der Biofilmbildung
stellen sie einen möglichen Angriffspunkt für zukünftige therapeutische
Interventionen dar.
Die Bedeutung des alternativen Sigmafaktors in S. epidermidis als globaler Regulator
konnte durch die beobachtete σ B -abhängige Expression der Oxacillinresistenz unterstrichen
werden. Inaktivierung des Anti-Sigmafaktors RsbW führte zu einer dramatisch
gesteigerten Oxacillinresistenz, während bei fehlender, beziehungsweise stark
geminderter σ B -Aktivität die Resistenz gegenüber Oxacillin vermindert wurde.
Die im Rahmen dieser Arbeit erhobenen Daten erlauben es, das bestehende Modell der
Regulation der Biofilmbildung um entscheidende Punkte zu erweitern und mögliche
Angriffspunkte für therapeutische Interventionen zu identifizieren. Um mögliche
therapeutische Strategien zur Prävention, beziehungsweise Therapie Fremdkörperassoziierter
Infektionen zu verwirklichen, werden auch in Zukunft Untersuchungen
notwendig sein, um das Regulationsmodell der Biofilmbildung weiter zu präzisieren.

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7 Abkürzungsverzeichnis 121
7 Abkürzungsverzeichnis
Für die im Text verwendeten Gewichts-, Volumen- und Zeiteinheiten wurden die
Bezeichnungen nach dem internationalen SI System verwendet und werden im
Abkürzungsverzeichnis nicht gesondert angegeben. Abkürzungen für Nährmedien
sowie deren Zusammensetzungen finden sich in Kapitel 2.1.4.
A 570
BLAST
bp
DIG
DNA
EDTA
EMBL
EtOH
FITC
HUSAR
IFT
IS
kb
KBE
MOI
MOPS
NCBI
OD 570
orf
PBE
PBS
PCR
PIA
PIAv
PNAG
PNSG
PS/A
RT
RNA
SDS
TIGR
Tn
U
Upm
V
VE
vol/vol
wt/vol
Absorption bei 570 nm
basic local alignment search tool
basepair (Basenpaar[e])
Digoxigenin
desoxiribonucleid acid (Desoxiribonukleinsäure)
Äthylendiamintetraessigsäure
European Molecular Biology Laboratory
Ethanol
Fluoresceinisothiocyanat
Heidelberg Unix Sequence Analysis Resources
Immunfluoreszenztest
Insertionselement
kilobase (Kilobase[n])
Koloniebildende Einheit(en)
multiplicity of infection
Morpholinopropansulfonsäure
National Center for Biotechnology Information
Optische Dichte bei 570 nm
open reading frame (offener Leserahmen)
Plaque-bildende Einheit
phosphate buffered saline
polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion)
polysaccharide intercellular adhesin
(interzelluläres Polysaccharidadhäsin)
antigene Variante von PIA
Poly-N-Acetylglukosamin
Poly-N-Succinylglukosamin
capsular polysaccharide adhesin (kapsuläres Polysaccharidadhäsin)
Reverse Transkriptase
ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
Natriumdodecylsulfat
The Institute of Genomic Research
Transposon
unit (enzymatische Einheit)
Umdrehungen pro Minute
Volt
voll entionisiert
Volumen pro Volumen
Gewicht pro Volumen

8 Danksagung 122
8 Danksagung
Zunächst möchte ich mich bei Herrn Professor Dr. D. Mack für die Überlassung des
spannenden und vielversprechenden Themas bedanken. Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn
Professor Dr. J. K.-M. Knobloch für seine kontinuierliche Betreuung und Hilfe, seine
umfassende Unterstützung in allen Phasen der Arbeit und vor allem für seine ständige und
freundschaftliche Mühe um mein Fortkommen.
Weiterhin möchte ich mich bei Herrn Professor Dr. R. Laufs bedanken, dessen exzellente
Vorlesung meine Begeisterung für die Mikrobiologie geweckt hat und an dessen Institut ich die
experimentellen Arbeiten durchführen durfte. Außerdem danke ich Herrn Professor. Dr. W.
Solbach an dessen Institut ich den theoretischen Anteil der Arbeit fertig stellen konnte.
Für die freundliche Stimmung im Labor und unvergessliche Kongressreisen danke ich Herrn Dr.
H. Rohde, Frau H. von Osten, Frau A. Kühn, Herrn Dr. M. A. Horstkotte, Frau Dr. G. Franke,
Frau Dr. S. Dobinsky, Herrn Dr. E. Stürenburg und Herrn PD Dr. I. Sobottka. Herrn Professor
Dr. H. Feucht danke ich für die Hilfe bei der Sequenzierung der Mutanten. Bei allen andern
Ärzten, MTA’s und Sekretärinnen des Institutes für medizinische Mikrobiologie möchte ich
mich für die stets hilfsbereite Atmosphäre bedanken.
Juliane danke ich für die fortwährende Motivation, die liebevolle Unterstützung während der
gesamten Promotion und die unglaubliche Geduld bei der Korrektur der Arbeit. Ich möchte
mich ganz besonders herzlich bei meinen Eltern und meinem Bruder bedanken, die mir jederzeit
mit Rat und Tat bei Seite standen.
Für die finanzielle Unterstützung während der Promotion danke ich der Werner Otto Stiftung.

9 Lebenslauf und Publikationsverzeichnis 123
9 Lebenslauf und Publikationsverzeichnis
Name:
Sebastian Jäger
Geburtsdatum/-ort: 28.03.1977 in Hamburg
Schulbildung:
Zivildienst:
Hochschulbildung:
Dissertation:
Berufliche
Laufbahn:
Stipendien und
Preise:
1983 - 1987 Grundschulbesuch in Hamburg
1993 - 1994 U.S.A. Schulbesuch, High School-
Abschluss mit Auszeichnung
1997 Abitur Corvey Gymnasium Hamburg, Note 1,1
1997 - 1998 OP-Springer im Krankenhaus beim Andreasbrunnen
Ab 10/1998 Studium der Humanmedizin an der Universität
Hamburg
09/2000 Ärztliche Vorprüfung, Note -gut-
09/2001 Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung, Note -gut-
04/2004 Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung, Note -gut-
04/2005 Dritter Abschnitt der ärztlichen Prüfung, Note -sehr gut-
11/2001 - 01/2005 Durchführung der experimentellen Arbeiten
am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Immunologie
der Universität Hamburg (Direktor: Professor Dr. med. R.
Laufs).
Ab 2006 Fortführung der theoretischen Arbeiten am Institut für
Medizinische Mikrobiologie und Hygiene am
Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Lübeck
(Direktor: Professor Dr. med. W. Solbach).
Seit 06/2005 Assistenzarzt in der Medizinischen Klinik II,
Kardiologie und Pulmologie, Charité Campus Benjamin
Franklin, (Direktor: Professor Dr. med. H. P. Schultheiss).
„Werner Otto Stipendium zur Förderung des medizinischwissenschaftlichen
Nachwuchses an der Universität
Hamburg“ 2002 – 2004.
Posterpreis der „Deutsche Gesellschaft für Hygiene und
Mikrobiologie“ (55. Jahrestagung in Dresden 2003) für das
Poster: „Differential expression of methicillin resistance
phenotype in Staphylococcus epidermidis mediated by the
alternative sigma factor σ B .
Sprachkenntnisse:
Englisch, fließend in Wort und Schrift. „Certificate of
Proficiency in English” der University of Cambridge.
Berlin, 29. Oktober 2006

9 Lebenslauf und Publikationsverzeichnis 124
Publikationsverzeichnis (2003-2006)
Originalarbeiten:
1. Knobloch, J. K.-M., S. Jäger, H. Rohde, M. A. Horstkotte, S. Dobinsky, and D.
Mack. 2004. RsbU dependent regulation of Staphylococcus epidermidis biofilm
formation is mediated via the alternative sigma factor σ B by repression of the
negative regulator gene icaR. Inf. Immun. 72:3838-3848.
2. Knobloch, J. K.-M., S. Jäger, J. Huck, M. A. Horstkotte, H. Rohde, and D. Mack.
2005. mecA is not involved in the σ B dependent switch of the expression
phenotype of methicillin resistance in Staphylococcus epidermidis. Antimicrob.
Agents Chemother. 49(3):1216-19.
3. Jäger, S., D. Mack, H. Rohde, M. A. Horstkotte, and J. K.-M. Knobloch. 2005.
Disintegration of Staphylococcus epidermidis biofilms under glucose limitation
depends on the activity of the alternative sigma factor σ B . Appl. Environ.
Microbiol. 2005 Sep;71(9):5577-81.
4. Jäger, S., D. Mack, H. Rohde, M. A. Horstkotte, and J. K.-M. Knobloch.
Regulation of biofilm formation by σ B is a common mechanism in
Staphylococcus epidermidis and is not mediated by the σ B dependent sarA
transcript. (Zur Veröffentlichung eingereicht)
5. Westermann, D., S. Rutschow, S. Jäger, A. Linderer, A. Riad, H.-P. Schultheiss,
M. Pauschinger, and C. Tschöpe. Contribution of inflammation and cardiac matrix
metalloproteinase activity to cardiac failure in diabetic cardiomyopathy: The role
of AT1 receptor antagonism. (Zur Veröffentlichung eingereicht).
Publizierte Letter und Abstracts:
1. Jäger, S, D. Mack, H. Rohde, M. A. Horstkotte, and J. K.-M. Knobloch. 2003.
Differential expression of methicillin resistance phenotype in Staphylococcus
epidermidis mediated by the alternative sigma factor σ B . Int. J. Med. Microbiol.
293, Suppl. 36:287.
2. Huck, J., S. Jäger, M. A. Horstkotte, D. Mack, J. K.-M. Knobloch. 2004.
Influence of the alternative sigma factor σ B on the oxacillin resistance in
Staphylococcus epidermidis. Int. J. Med. Microbiol. 294 Suppl. 39:107.
3. Jäger, S., D. Mack, H. Rohde, M. A. Horstkotte, J. K.-M. Knobloch. 2004.
Regulation of biofilm formation by the alternative sigma factor σ B : A common
mechanism in Staphylococcus epidermidis? Int. J. Med. Microbiol. 294 Suppl.
39:126.
4. Knobloch, J. K.-M., K. Bartscht, S. Jäger, H. Rohde, M. A. Horstkotte, D. Mack.
2004. Characterization of a new regulatory gene locus of Staphylococcus
epidermidis biofilm formation: The biofilm accumulation regulators A and B
(barAB). Int. J. Med. Microbiol. 294 Suppl. 39:190.
5. Knobloch, J. K.-M., J. Huck, S. Jäger, M. A. Horstkotte, and Dietrich Mack.
2004. σ B dependent expression of oxacillin resistance in Staphylococcus

9 Lebenslauf und Publikationsverzeichnis 125
epidermidis: Transcriptional analysis of mecA and other factors required for
resistance expression. Clin. Microbiol. Inf. 10, Suppl. 1:273.
6. Knobloch, J. K.-M., S. Jäger, M. A. Horstkotte, D. Mack. 2004. Stability of
Staphylococcus epidermidis biofilms under energy limitation depends on the
activity of the alternative sigma factor σ B . Int. J. Med. Microbiol. 294 Suppl.
39:126.
7. Jäger, S., D. Mack, M.A. Horstkotte, H. Rohde, J.K.-M. Knobloch. 2005.
Regulation of biofilm formation by SigmaB is a common mechanism in
Staphylococcus epidermidis and is not mediated by the SigmaB dependent sarA
transcript. Clin. Microbiol. Inf. 11, Suppl. 2:1642.
8. Kneschke, J., S. Jäger, M. A. Horstkotte, H. Rohde, D. Mack, J. K.-M. Knobloch.
2005. Regulation of extracellular proteins involved in S. epidermidis virulence by
the alternative sigma factor σ B . BIOSpektrum Suppl.:170.
9. Knobloch, J. K.-M., K. Bartscht, S. Jäger, H. Rohde, M.A. Horstkotte, D. Mack.
2005. barAB a new regulatory gene locus mediating NaCl induction of
Staphylococcus epidermidis biofilm formation. Clin. Microbiol. Inf. 11, Suppl.
2:1644.
10. Kneschke, J., S. Jäger, D. Mack, J. K.-M. Knobloch. 2006. Regulation of putative
extra cellular virulence factors in Staphylococcus epidermidis by the alternative
sigma factor σ B . Clin. Microbiol. Infect. 12 Supp. 4: O370.
Weitere Kongressbeiträge:
1. Knobloch, J. K.-M., S. Jäger, K. Bartscht, H. Rohde, M. A. Horstkotte, and D.
Mack. Regulation of S. epidermidis biofilm-formation: mediators of rsbU
dependent regulation and differential role of stress factors. Gordon Research
Conference „Staphylococcal Diseases“, 07.-12.09.2003, Oxford, England.
2. Knobloch, J. K.-M., S. Jäger, H. Rohde, M. A. Horstkotte, and D. Mack.
Disintegration of Staphylococcus epidermidis biofilms under glucose limitation
depends on the activity of the alternative sigma factor sigmaB. Gordon Research
Conference „Applied and Environmental Microbiology“, 17.07.-01.08.2003, New
London, Connecticut, USA.
3. Knobloch, J. K.-M., S. Jäger, M. A. Horstkotte, H. Rohde, and D. Mack. Hierarchy
within the regulatory cascade of S. epidermidis biofilm-formation. 1 st European
Conference on: Biofilm – prevention of microbial adhesion, 31.03-02.04.2004,
Osnabrück.
4. Knobloch, J. K.-M., J. Huck, S. Jäger, M. A. Horstkotte, and D. Mack. Influence
of the alternative sigma factor σ B on the oxacillin resistance in Staphylococcus
epidermidis. Gordon Research Conference „Microbial Stress Response“,
11.-16.07.2004, South Hadley, Massachusetts, USA.
5. Rutschow, S., C. Kampf, A. Kawellis-Opara, D. Westermann, S. Jäger, W. Rother,
C. Tschöpe, M. Pauschinger. 2006. IL-4 suppresses intramyocardial inflammation
and improves the imbalance in the matrix degradation system in a murine chronic
myocarditis. Heart Failure 2006, 17.7.2006 – 20.7.2006, Helsinki, Finland.