Regulationsmechanismen von Oxacillinresistenz und Biofilmbildung ...

2 Material und Methoden 30
suchenden Stammes von einer frisch über Nacht kultivierten Blutagar-Platte beimpft
und für 18 bis 24 h bei 37 °C im Schüttelinkubator kultiviert. Die Vorkultur wurde im
Verhältnis 1:100 in 2 ml des Mediums, welches für die Hauptkultur verwendet wurde
verdünnt. Das Medium der Hauptkultur wurde je nach Bedarf mit unterschiedlichen
Konzentrationen von NaCl und Ethanol supplementiert. Pro zu untersuchendem Stamm
wurden jeweils vier Näpfe der Zellkulturplatte (Nuclon Delta Oberfläche, Nunc) mit
200 µl der Hauptkultur beimpft und mit Folie abgeklebt, um ein Verdunsten des
supplementierten Ethanols zu vermeiden. Nach einer Inkubationsperiode von 20 bis
22 h bei 37 °C im Brutschrank wurde die Platte kräftig ausgeschlagen, jede Vertiefung
viermal mit je 200 µl PBS gespült und erneut kräftig ausgeschlagen. Die Platte wurde
anschließend über Nacht bei Raumtemperatur oder für vier Stunden bei 37 °C
getrocknet, und der adhärente Biofilm wurde für 5 min mit je 50 µl Gentianaviolettlösung
angefärbt. Die Platte wurde unter fließendem Wasser gründlich gespült, erneut
kräftig ausgeschlagen und bei Raumtemperatur getrocknet. Zur Quantifizierung des
gebildeten Biofilms wurde die Intensität der Färbung durch Messung der Absorption bei
570 nm (A 570 ) in einem BEPII-Photometer im evaluation mode 3 bestimmt. Die
Ergebnisse von vier parallelen Messungen wurde gemittelt und eine A 570 von größer
oder gleich 0,1 wurde als Biofilm-positiv gewertet. Bei Versuchen zur Induzierbarkeit
der Biofilmbildung wurden die Stämme als induzierbar gewertet, deren gemittelte A 570
sich mindestens verdoppelte, beziehungsweise die ausgehend von einem ursprünglich
Biofilm-negativen Phänotyp den Grenzwert der A 570 von 0,1 nach Induktion
überschritten.
2.2.3 Immunfluoreszenztest zur Identifikation von PIA
Um PIA an Zellen und Zellclustern direkt nachzuweisen, wurde ein Immunfluoreszenztest
mit Hilfe eines spezifischen Anti-PIA-Antiserums 173, 178 und eines fluoreszenzmarkierten
Zweitantikörpers durchgeführt. Zur besseren Darstellung wurden die Zellen
abschließend mit einem nukleinsäurebindenden Farbstoff gegengefärbt (SYTO 61).
Eine Vorkultur in 2 ml TSB∅ wurde für 18 bis 24 h bei 37 °C im Schüttelinkubator
kultiviert und im Verhältnis 1:100 in 10 ml des jeweiligen Mediums der Hauptkultur
verdünnt. Das Medium der Hauptkultur wurde je nach Bedarf mit unterschiedlichen
Konzentrationen von NaCl und Ethanol supplementiert. Die Hauptkultur wurde in eine
Zellkulturschale überführt (∅ 9 cm, Nuclon Delta Oberfläche, Nunc) und für 20 bis
22 h bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Mit Hilfe eines Zellschabers (Nunc) konnten