Regulationsmechanismen von Oxacillinresistenz und Biofilmbildung ...

2 Material und Methoden 32
in 180 µl TE-Puffer pH 7,0 resuspendiert. Nach Zugabe von 5 µl Lysostaphin
(1.500 U/ml) wurde die Zellwand für 30 min bei 37 °C lysiert. Anschließend wurden
180 µl ATL-Puffer, sowie 20 µl Proteinase K hinzugefügt, durch Vortexen vermischt
und für zwei Stunden bei 56 °C inkubiert. Nach Zugabe von 200 µl AL-Puffer wurde
die Probe für 10 Minuten bei 70 °C inkubiert, anschließend mit 200 µl Ethanol (96%)
versetzt und die DNA an die im Kit enthaltene Silicatmatrix adsorbiert. Nach zwei
Waschschritten mit jeweils 500µl AW1 und AW2-Puffer wurde die DNA in 200 µl AE-
Puffer eluiert und bei -20 °C gelagert.
2.2.6 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) ist eine Standardmethode
zur Amplifikation von DNA Fragmenten 229 . Dabei dient doppelsträngige DNA
als Vorlage (template). Zwei zu den Einzelsträngen komplementäre, gegenläufige
(forward und reverse) Oligonukleotide, die sogenannten Primer, dienen der DNA-Polymerase
als Start. Durch abwechselnde Zyklen von Denaturierung der DNA, Anlagerung
der Primer (annealing) und Synthese des komplementären Stranges kommt es zur exponentiellen
Amplifikation des vorliegenden Fragments. Die Standard-PCRs wurden mit
Hilfe des DyNazyme DNA Polymerase Kits in einem Primus 96 Thermocycler durchgeführt.
In einem 50 µl Ansatz wurden ca. 25-100 ng template-DNA, je 10 pmol
forward- und reverse Primer, 5 µl Optimized-DyNAzyme-Puffer, Desoxynukleotide
(dNTPs) in einer Konzentration von je 200 µM und 1 U Polymerase eingesetzt. Initial
wurde die DNA 2 min bei 94 °C denaturiert, in den anschließenden Zyklen nur für 30 s.
Die annealing Temperatur betrug in Abhängigkeit von den verwendeten Primern
zwischen 51 und 64 °C für eine Dauer von 30 s. Der Zweitstrang wurde bei 72 °C
synthetisiert, wobei sich die Dauer nach der Länge des zu amplifizierenden DNA Fragments
richtete und mit 40 s/kb angesetzt wurde. Nach 30 Zyklen schloss sich eine
siebenminütige Synthesephase an, um eine vollständige Komplementierung aller
Einzelstränge zu gewährleisten. Abschließend wurden die Proben auf 4 °C abgekühlt
und bei dieser Temperatur bis zur weiteren Verwendung gelagert. Zur Kontrolle der
PCR fand anschließend eine Agarosegelelektrophorese (Kapitel 2.2.10) statt. Wenn die
amplifizierte DNA kloniert oder sequenziert werden sollte, so wurde die Expand High
Fidelity Polymerase, welche eine 3'-5' exonuklease proofreading Aktivität besitzt,
gemäß Herstellerangaben verwendet.