Regulationsmechanismen von Oxacillinresistenz und Biofilmbildung ...

2 Material und Methoden 45
2.2.22 Transkriptionsanalyse mittels Northern Blot
Die Übertragung der RNA aus dem Formaldehyd-Agarosegel auf eine Nylonmembran
erfolgte mittels kapillaren Transfers 5 in einem hochosmolaren Puffer. Hierfür wurde
zwischen zwei mit 20 x SSC gefüllten Plastikschalen eine Glasscheibe gelegt, auf die
überlappend Filterpapiere aufgelegt wurden. Das Formaldehyd-Agarosegel wurde
blasenfrei auf die Filterpapiere aufgelegt und eine Zeta-probe Membran wurde
vorsichtig blasenfrei mit einer Glaspipette angepresst. Das Gel wurde mit Seranfolie
umsäumt, um einen seitlichen Übertritt des Puffers zu vermeiden. Die Membran wurde
mehrlagig mit in 2 x SSC getränktem Filterpapier sowie trockenem Zellstoff bedeckt
und mit einer Glasscheibe beschwert. Nach einer Transferzeit von 18 h wurde die
Membran kurz in 2 x SSC gewaschen und die RNA durch Backen für 2 Stunden bei
80 °C fixiert.
Für die Hybridisierung wurde die Membran in einen Plastikbeutel eingeschweißt und
zunächst für 30 min im Schüttelwasserbad bei 50 °C in 10 ml/100 cm 2 DIG easy HYB
Lösung prähybridisiert. Die DIG markierte Sonde aus der PCR labeling Reaktion
(Kapitel 2.2.20) wurde in 50 µl H 2 O verdünnt und in einem kochendem Wasserbad für
5 min denaturiert. Anschließend wurde der Ansatz kurz auf Eis abgekühlt und mit auf
50 °C vorgewärmter DIG Easy Hyb Lösung zusammengeführt (2 µl PCR Produkt/ml
Hybridisierungslösung). Die Membran wurde über Nacht im Schüttelwasserbad bei
50 °C in 3,5 ml Hybridisierungslösung pro 100 cm 2 Membran hybridisiert. Die Sonde
wurde anschließend bei -20 °C eingefroren und konnte nach erneuter Denaturierung bis
zu fünf mal wieder verwendet werden. Nicht gebundene, bzw. unspezifisch gebundene
Sonden wurden zweimalig in 2 x SSC / 0,1 % SDS bei Raumtemperatur, zweimalig in
0,1 x SSC / 0,1 % SDS bei 50 °C und abschließend in DIG washing buffer bei Raumtemperatur
von der Membran gewaschen. Die Membran wurde gemäß den Herstellerangaben
mit blocking solution präadsorbiert, um eine unspezifische Bindung des Antikörpers
an die Membran zu vermeiden. Im Folgenden wurde die Membran für 30 min
mit Anti-Digoxigenin-AP Fab Fragmenten inkubiert, welche als Fab Fragmente eines
Anti-Digoxigenin-Antikörpers vom Schaf, konjugiert mit alkalischer Phosphatase an
das Digoxigenin der Sonden binden. Ungebundene Antikörper wurden 2 x 15 min mit
washing solution abgespült, die Membran 5 min in Detektionspuffer äquilibriert und auf
einer Klarsichtfolie ausgelegt. Für die Detektion der hybridisierten Sonden wurde CDP-
Star, ein Chlor substituiertes 1,2-Dioxethan Chemilumineszenz-Substrat der alkalischen
Phosphatase, luftblasenfrei auf der Membran verteilt. Die Membran wurde 5 min in-