Regulationsmechanismen von Oxacillinresistenz und Biofilmbildung ...

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Bedingungen analysiert (Abbildung 3.15 B). Dabei konnte für alle Mutanten und den
Wildtypstamm ein circa 900 bp großes Transkript detektiert werden. Jedoch zeigten die
Mutanten 1457rsbU, 1457rsbV, 1457sigB und 1457rsbUVWsigB eine erheblich gesteigerte
Transkriptionsaktivität im Vergleich zum Wildtyp. Für die Mutanten 1457rsbW
und 1457rsbUVW wurde kein signifikanter Unterschied in Bezug auf die icaR Transkription
im Vergleich zum Wildtyp festgestellt.
Um die relativen Transkriptionsunterschiede schneller und genauer quantifizieren zu
können, wurde eine quantitative real time PCR etabliert. Exemplarisch für Mutanten mit
verminderter σ B -Aktivität wurde die Mutante 1457rsbUVWsigB untersucht, während
beispielhaft für Mutanten mit Inaktivierung von RsbW bei intaktem sigB Gen die
Mutante 1457rsbUVW verwendet wurde. Die Bakterien wurden unter statischen Bedingungen
in Zellkulturplatten mit Nuclon Delta Oberfläche kultiviert und die RNA
nach 7 h (exponentielle Phase), beziehungsweise 17 h (stationäre Phase) isoliert. Nach
einem DNase-Verdau wurde die RNA in komplementäre DNA (cDNA) mittels reverser
Transkriptase und random Primern umgeschrieben. Die Bestimmung der relativen
Transkriptionsunterschiede erfolgte jeweils im Dreifachansatz aus mindestens drei unabhängigen
RNA-Präparationen mittels 2 -ΔΔC T Methode, wobei Mittelwerte aus drei Experimenten
berechnet wurden. Als signifikant wurden Unterschiede der relativen Transkriptionsaktivität
gewertet, wenn eine mindestens 2,5-fache Veränderung detektiert
werden konnte.
Die Transkriptionsaktivität von asp23, welches von zwei σ B -abhängigen Promotoren
transkribiert wird, wurde als Marker für die σ B -Aktivität verwendet (Abbildung 3.16 A
und B). Die Mutante mit Deletion des gesamten σ B Operons wies zu den beiden
untersuchten Zeitpunkten eine 560- beziehungsweise 420-fache Reduktion der asp23
Transkription auf, so dass die Inaktivierung des alternativen Sigma Faktors bestätigt
werden konnte. Die Mutante 1457rsbUVW zeigte zu keinem Zeitpunkt eine signifikante
Veränderung der asp23 Transkription gegenüber dem Wildtyp.
In der Mutante 1457rsbUVWsigB mit Inaktivierung des gesamten σ B Operons, wurde in
der exponentiellen Phase eine 13,6-fach reduzierte, sowie in der stationären Phase eine
18,2-fach reduzierte icaA Transkription nachgewiesen. Somit stellte sich zu beiden
untersuchten Zeitpunkten analog zu den gezeigten Northern Blot Ergebnissen, eine stark
verminderte icaA Transkription dar. Ebenfalls analog zu den zuvor gezeigten Northern
Blot Untersuchungen konnte in der exponentiellen Phase eine 5,1-fach gesteigerte,