Regulationsmechanismen von Oxacillinresistenz und Biofilmbildung ...

2 Material und Methoden 39
Suspension wurde eine geeignete Verdünnung des Phagenlysates hinzugegeben, so dass
sich ein Phagen-Bakterien-Verhältnis (multiplicity of infection, MOI) von 0,1 bis 1
ergab. Die Suspension wurde für 30 min bei 37 °C im Schüttelinkubator (150 Upm) inkubiert,
anschließend wurde die Absorption der Phagen durch Zugabe von 40 µl 1 M
Natriumcitrat gestoppt und die Bakterien für 15 min bei 4.332 x g, 4 °C zentrifugiert.
Das Pellet wurde zweimalig in 2 ml BHI mit 20 mM Natriumcitrat gewaschen, anschließend
in 3 ml des gleichen Mediums resuspendiert und für 1 h bei 37 °C in einem
Schüttelinkubator (150 Upm) inkubiert. BHI-Softagar mit 20 mM Natriumcitrat wurde
aufgekocht, im Wasserbad auf 46 °C abgekühlt, mit der Suspension vermischt und auf
einer BHI-Agarplatte ausplattiert. Zur Selektion des pBT2 Vektors wurden Softagar und
Agarplatten mit 10 µg/ml Chloramphenicol versetzt und für bis zu 72 h bei 30 °C
bebrütet, während zur Selektion von Deletionsmutanten Softagar und Agarplatten mit
10 µg Erythromycin verwendet und für bis zu 48 h bei 37 °C inkubiert wurden.
2.2.17 Homologer Genaustausch in S. epidermidis
Homologer Genaustausch 161 wurde verwendet, um einzelne Gene gezielt zu inaktivieren.
Die dafür erforderlichen Klonierungsschritte wurden in dem Plasmid pCR2.1
und dem E. coli/Staphylokokken Shuttlevektor pBT2 in E. coli TOP10 durchgeführt.
Zunächst wurden die chromosomalen DNA Abschnitte, welche die zu inaktivierenden
Gene flankieren, amplifiziert und in dem Plasmid pCR2.1 subkloniert (Abbildung 2.1).
Abbildung 2.1
Schematische Darstellung der für den homologen Genaustausch amplifizierten Fragmente.
Schwarze Pfeile stellen die Gene des σ B Operons, graue Pfeile stellen die
amplifizierten flankierenden Genabschnitte dar (Tabelle 2.6). Vertikale Linien
markieren die Lage der jeweils verwendeten Primer (Tabelle 2.5) im σ B Operon.