Regulationsmechanismen von Oxacillinresistenz und Biofilmbildung ...

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werden (Abbildung 1.3) 148 . Eine Charakterisierung der flankierenden Genabschnitte in
S. epidermidis zeigte drei weitere offene Leserahmen unterhalb der Tn917 Insertion,
welche ebenfalls eine hohe Homologie zu den Genen des σ B Operons in S. aureus und
B. Subtilis, sowie eine identische Anordnung und Orientierung aufwiesen (Abbildung
1.3).
In B. subtilis und S. aureus wird die σ B -Aktivität auf posttranskriptioneller Ebene reguliert
(Abbildung 1.4). Obwohl das zentrale Regulationsmotiv zwischen S. aureus und
B. subtilis konserviert ist, stellt sich die Regulation der σ B -Aktivität in B. subtilis weitaus
komplexer dar (Kapitel 1.4). Somit war zu Beginn dieser Arbeit unklar, inwieweit
sich die in B. subtilis und S. aureus dokumentierten Regulationsmechanismen auf
S. epidermidis übertragen lassen.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Regulation der σ B -Aktivität in S. epidermidis
und insbesondere ihr Einfluss auf die Biofilmbildung weitergehend untersucht. Um
Deletionsmutanten der einzelnen Gene des σ B Operons zu generieren, wurden die notwendigen
Konstrukte für einen homologen Genaustausch in E. coli kloniert (Abbildung
2.1 und 2.2). Im Folgenden wurde ein Elektroporationsverfahren etabliert, um einen
effizienten Transfer von genetischem Material in Staphylokokken zu ermöglichen
(Kapitel 2.2.14). Nach einer Zwischenpassage in dem restriktionsdefizienten S. aureus
Stamm RN4220 konnten die Plasmide in die Mutante M15 transformiert werden. Von
dort konnten sie mittels Phagentransduktion in den eigentlichen Zielstamm S. epidermidis
1457 transduziert werden. Es wurden zunächst Mutanten generiert, bei welchen gezielt
die einzelnen regulativen Gene rsbU, rsbV und rsbW sowie die komplette Regulationskaskade
rsbUVW deletiert wurden. Ebenso konnten Deletionsmutanten des sigB
Genes sowie des gesamten σ B Operons erzeugt werden (Abbildung 3.1, Tabelle 2.8).
Mittels PCR-Analysen wurde die korrekte Insertion der für den homologen Genaustausch
verwendeten Resistenzkassette (erm) überprüft (Abbildung 2.3). Die Größe der
jeweiligen Amplifikate entsprach der zu erwartenden Größe bei einer korrekten Insertion
(Abbildung 3.2, Tabelle 3.1). Durch eine Sequenzierung der flankierenden chromosomalen
Bereiche konnten zusätzliche, unerwünschte genetische Veränderungen ausgeschlossen
werden.
Unter Standard Kulturbedingungen in TSB Medium konnte für die Mutanten 1457rsbU,
1457rsbV, 1457sigB und 1457rsbUVWsigB ein Biofilm-negativer Phänotyp beobachtet
werden (Abbildung 3.9). Die Biofilmbildung der Mutanten konnte durch Ethanol,