Regulationsmechanismen von Oxacillinresistenz und Biofilmbildung ...

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positiven Phänotyp wurden mit 2 ml eiskaltem, sterilem PBS überschichtet, während
Biofilm-negative Stämme mit 3 ml eiskaltem, sterilem PBS überschichtet wurden. Um
die Zellen resuspendieren zu können, wurden sie auf Eis für 10 s bei 70 % Amplitude
mit Ultraschall (Branson Sonifier 250-D mit Microtip) behandelt. Um die RNA zu
stabilisieren, wurden 1,5 ml dieser Zellsuspension zu 3 ml der RNAeasy Lösung gegeben
und für 5 - 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden anschließend
für 10 min, 4.332 x g bei Raumtemperatur pelletiert. Zur Entfernung der extrazellulären
Matrix wurden die Zellen in 10 ml PBS resuspendiert und auf Eis, mit einem zwischengeschalteten
Waschschritt (10 ml PBS), zweimalig mit Ultraschall behandelt (3 x 30 s
mit jeweils 30 s Pause). Anschließend wurden die Zellen für 5 min, 4.332 x g bei Raumtemperatur
pelletiert und der Überstand verworfen. Bei Bedarf wurden die Zellen nach
diesem Schritt bis zur RNA Extraktion bei –20 °C gelagert.
Durch Lysostaphin-Verdau wurde die Zellwand lysiert, zusätzlich wurden die Zellen in
Lysing MatrixB Röhrchen, welche 0,1 mm durchmessende Silikatkügelchen enthalten
homogenisiert. Zur Extraktion der RNA wurde das RNAeasy Protect Bacteria Mini Kit
verwendet. Das Kit basiert auf dem Prinzip, dass Nukleinsäuren in Gegenwart eines
chaotropen Salzes an die Silikatmatrix einer RNeasy-Säule binden. Verunreinigungen
werden durch Waschschritte eliminiert und abschließend wird die RNA mit H 2 O aus der
Säule eluiert.
Die Zellen wurden hierfür in 180 µl TE-Puffer resuspendiert, mit 20 µl Lysostaphinstammlösung
(1.500 U/ml) versetzt und für 10 min bei 37 °C unter Schütteln auf einem
Heizblock inkubiert. Der Probe wurde 700 µl RLT-Puffer mit Mercaptoethanol (1 ml
RLT-Puffer versetzt mit 10 µl Mercaptoethanol) zugegeben und für 15 s gevortext. Der
Ansatz wurde in ein 2 ml Lysing MatrixB Röhrchen überführt und dreimalig für je 20 s
bei maximaler Geschwindigkeit mit dem FastPrep FP120 Gerät homogenisiert. Das
Lysing MatrixB Röhrchen wurde anschließend für 2 min, 16.000 x g bei Raumtemperatur
zentrifugiert und der Überstand in ein neues Eppendorfröhrchen überführt.
Nach Zugabe von 470 µl Ethanol absolut und gründlichem Mischen, wurde die Probe
auf eine RNeasy Spin Säule gegeben und für 15 s, 8.000 x g, Raumtemperatur
zentrifugiert. Die Säule wurde einmal mit 700 µl RW1-Puffer und zweimal mit je
500 µl RPE-Puffer gewaschen. Die RNA wurde mit 50 µl RNase freiem Wasser aus der
Säule eluiert und die Menge der Gesamt-RNA durch Messung der Absorption bei
260 nm bestimmt. Die RNA konnte bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert
werden.