Regulationsmechanismen von Oxacillinresistenz und Biofilmbildung ...

2 Material und Methoden 38
37 °C unter Selektion von Erythromycin (50µg/ml) und Wildtyp Stämme ohne antibiotische
Selektion bei 37 °C angezüchtet wurden. Für die Hauptkultur wurde NB2+
Brühe im Verhältnis 50:1 mit der Vorkultur inokuliert und unter Selektion von Chloramphenicol
(1 µg/ml), beziehungsweise Erythromycin (2,5 µg/ml) in einem Schüttelinkubator
(150 Upm) bis zu einer OD 570 von 0,1 bis 0,2 inkubiert. Diese OD 570
entsprach einer Zellkonzentration von circa 5 x 10 7 KBE/ml.
STA-Softagar wurde in einer Mikrowelle aufgekocht und im Wasserbad auf 46 °C abgekühlt.
3 ml STA-Softagar wurden mit 500 µl der Bakteriensuspension, 2 x 10 5 Plaque
bildenden Einheiten (PBE) des S. epidermidis Phagen 71 (Φ71) vermischt und auf einer
STA-Agarplatte ausplattiert. Pro Stamm wurden 3 STA-Agarplatten vorbereitet und
nach dem Aushärten bei 30 °C für 24 h im Brutschrank inkubiert.
Es wurden je 5 ml NB2+ Brühe auf die Platten gegeben, der Softagar mit Hilfe eines
sterilen Glasspatels von der STA-Agarplatte abgelöst und zerkleinert. Der Softagar von
jeweils 3 Platten wurde zusammen mit der NB2+ Brühe mit einer Glaspipette aufgenommen
und in ein 50 ml Falcon Tube überführt. Durch kräftiges Schütteln der
NB2+/Softagarsuspension konnten die Phagen aus dem Softagar extrahiert werden.
Durch Zentrifugation für 15 min bei 4.332 x g, 4 °C wurden der Agar und die Bakterien
von der Phagensuspension getrennt. Der geklärte Überstand wurde in ein frisches
Röhrchen überführt und erneut für 15 min bei 4.332 x g, 4 °C zentrifugiert. Der Überstand
wurde steril-filtriert (Sterilfilter Porengröße 0,2 µm) und zur baldigen Verwendung
bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahrt oder bei -80 °C gelagert.
Um den erreichten Phagentiter bestimmen zu können, wurde das Phagenlysat zehnerlogarithmisch
von 10 -6 bis 10 -9 in NB2+ verdünnt. Je 1 ml der Phagenverdünnung
wurde mit 3 ml STA-Softagar (46 °C) und 0,5 ml einer Suspension von S. epidermidis
1457 mit einer OD 570 von 0,1 bis 0,2 vermischt und auf einer STA-Agarplatte ausplattiert.
Nach einer Inkubation von 24 h bei 30 °C konnte durch Auszählen der
entstandenen Plaques unter Berücksichtigung der Vorverdünnung der Phagentiter
berechnet werden.
2.2.16 Phagentransduktion
Für die Phagentransduktion 170 wurden 3 Blutagar-Platten mit dem Empfängerstamm inokuliert
und über Nacht bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Mit einem sterilen Wattetupfer
wurde der Bakterienrasen von der Agarplatte aufgenommen und bis zu einer
OD 570 von 11 (0,5 bis 1 x 10 10 KBE/ml) in NB2+ Brühe suspendiert. Zu 1 ml dieser