Regulationsmechanismen von Oxacillinresistenz und Biofilmbildung ...

2 Material und Methoden 37
2.2.14 Elektroporation von Staphylokokken
9, 151
Für die Präparation elektrokompetenter Staphylokokken wurden
die Stämme
zunächst als Vorkultur in 5 ml B2-Brühe bei 37 °C für 16 h im Schüttelinkubator
kultiviert. 24 ml B2-Brühe wurden mit 1 ml der Vorkultur inokuliert und bei 37 °C im
Schüttelinkubator bis zu dem Erreichen einer OD 570 von 0,6 bis 0,8 kultiviert. Die im
Folgenden benutzten sterilen Gefäße, Lösungen und Zentrifugen waren alle vorgekühlt
und die Zentrifugationsschritte wurden bei 4 °C durchgeführt. Die Zellen wurden in
einem 50 ml Falcon-Tube für 15 min bei 4.332 x g zentrifugiert und dreimal mit je
25 ml destilliertem Wasser gewaschen. Das Zellpellet wurde anschließend in 5 ml
sterilem 10 % Glycerin resuspendiert, in ein 14 ml Falcon-Röhrchen überführt und
erneut durch Zentrifugation für 15 Minuten bei 4.332 x g pelletiert. Das Pellet wurde
nochmals mit 2,5 ml sterilem 10 % Glycerin gewaschen. Das gewaschene Pellet wurde
abhängig von der Ausgangs-OD 570 in 600 bis 800 µl sterilem 10 % Glycerin resuspendiert
(circa 10 9 Zellen pro ml). Die elektrokompetenten Zellen wurden für die anschließende
Elektroporation in 70 µl Portionen in Eppendorfröhrchen aliquotiert.
Elektrokompetente Zellen von S. aureus RN4220 wurden ohne entscheidende
Verringerung der Transformationseffizienz bei –80 °C gelagert, während elektrokompetente
Zellen von S. epidermidis M15 in der Regel frisch verwendet wurden.
Für die Elektroporation der Zellen wurde einem Aliquot elektrokompetenter Zellen 1
bis 2 µl einer Plasmidpräparation zugegeben und das Gemisch circa 30 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Anschließend wurden die Zellen in eine 0,1 cm Elektroporationsküvette
überführt und unter folgenden Bedingungen bei Raumtemperatur elektroporiert:
100 Ω Widerstand, 2,0 bis 2,3 kV Spannung, 25 µF Kapazität. Nach Zugabe von 390 µl
B2-Brühe wurde die Suspension in ein Reagenzglas überführt und bei 37 °C im
Schüttelinkubator für 1 h inkubiert. Je 100 µl wurden auf NYE-Agar mit entsprechender
Antibiotikaselektion ausplattiert und für 24 bis 48 h bei lediglich 30 °C inkubiert, um
eine Eliminierung des temperatursensitiven E. coli/Staphylococcus Shuttlevektors
pBT2 34 zu vermeiden.
2.2.15 Herstellung von Phagenlysaten
Für die Herstellung der Phagenlysate 170 aus S. epidermidis wurden Vorkulturen der
jeweiligen Stämme in 5 ml NB2+ Brühe über Nacht im Schüttelinkubator (150 Upm)
inkubiert. Stämme mit dem temperatursensitiven Shuttlevektor pBT2 wurden bei 30 °C
unter Chloramphenicol Selektion (10 µg/ml) kultiviert, während Deletionsmutanten bei