Regulationsmechanismen von Oxacillinresistenz und Biofilmbildung ...

2 Material und Methoden 34
durch Zentrifugation in einem Eppendorfreaktionsgefäß pelletiert und in 250 µl P1-
Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von 250 µl P2 und 350 µl N3-Puffer wurde die
Probe für 10 Minuten (16.000 x g, Raumtemperatur) zentrifugiert und der Überstand auf
die im Kit enthaltene Silicatmatrix gegeben. Nach zwei Waschschritten mit 500 µl PB
und 750 µl PE-Puffer konnte die Plasmid DNA in 50 µl EB-Puffer eluiert werden.
Zur Plasmidpräparation aus Staphylokokken wurde das Protokoll modifiziert, da sich
ihre Zellwand durch das oben beschriebene Verfahren nicht ohne weiteres aufschließen
ließ. Die Stämme wurden in 2 ml BHI, gegebenenfalls unter entsprechender Antibiotikaselektion
bei 37 °C für 16 bis 20 h im Schüttelinkubator kultiviert. Durch
Zentrifugation (1 min, 16.000 x g, Raumtemperatur) wurden 1000 µl der Bakterienkultur
geerntet. Anschließend wurde das entstandene Pellet in 250 µl P1-Puffer
resuspendiert und 5 µl Lysostaphin (1.500 U/ml) hinzugefügt. Nach einer Inkubationsphase
von 30 min bei 37 °C wurde gemäß dem oben beschriebenen Protokoll fortgefahren.
2.2.9 Restriktionsverdau von Plasmid DNA
Restriktionsendonukleasen erkennen spezifische Basensequenzen in einem DNA-
Doppelstrang und schneiden beide Stränge an definierten Stellen (Restriktionsverdau)
230 . Zur Restriktionsspaltung von präparativen Ansätzen wurden 10 bis 20 µg
Plasmid DNA und je 1 µl der entsprechenden Restriktionsenzyme in einem Gesamtreaktionsvolumen
von 50 µl eingesetzt. Für alle in dieser Arbeit verwendeten Kombinationen
von Restriktionsenzymen wurde die einfache Konzentration des One-Phor-All
Buffer PLUS verwendet. Der Ansatz wurde 22 h bei 37 °C inkubiert, anschließend
wurde die vollständige Spaltung durch Gelelektrophorese in 0,7 % Agarosegel
kontrolliert (Kapitel 2.2.10). Analytische Restriktionsverdaue wurden mit 0,5 bis 1 µg
Plasmid DNA in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 µl mit je 0,5 µl Restriktionsenzym
angesetzt und eine Stunde bei 37 °C inkubiert.
2.2.10 Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA
Mittels horizontaler Gelelektrophorese wurden Fragmente gespaltener Plasmide oder
Amplifikate aus PCR Reaktionen nach ihrer Ladung, Größe und Konformation in einem
elektrischen Feld aufgetrennt 230 . Je nach Größe der zu separierenden Fragmente wurden
0,7 bis 2 %ige [w/v] Agarosegele verwendet. SeaKem ME Agarose wurde in 100 ml
0,5 x TBE-Puffer aufgekocht, abgekühlt, mit 3,3 µl 1 %iger Ethidiumbromid-Lösung