Regulationsmechanismen von Oxacillinresistenz und Biofilmbildung ...

2 Material und Methoden 47
der 2 -ΔΔC T Methode 166 berechnet. Als Referenzgen wurde gyrB ausgewählt, da es als
essentielles Gen (housekeeping gene) einer möglichst geringen Regulation unterliegt.
Im ersten Schritt wurde der C T Wert des Referenzgenes (gyrB) vom C T Wert des zu
untersuchenden Gens abgezogen (ΔC T = C T Zielgen – C T Referenzgen). Nach dieser
Normierung wurde vom ΔC T Wert der Deletionsmutante der ΔC T Wert der Wildtypkontrolle
subtrahiert (ΔΔC T = ΔC T Deletionsmutante - ΔC T Wildtypkontrolle). Der
relative Expressionsunterschied zwischen dem Gen der entsprechenden Mutante und
dem Wildtyp ergab sich somit aus 2 -ΔΔC T.
Die real time-PCR wurde mit den iQ SYBR Green Supermix Reagenzien in einem
iCycler iQ Thermocycler durchgeführt. Geeignete Primerpaare für die real time-PCR
wurden mit Hilfe des Programms Beacon Designer 2 ausgewählt (Tabelle 2.5). Mittels
Verdünnungsreihen einer bekannten cDNA wurde in Probemessungen überprüft, ob die
ausgewählten Primer für eine Quantifizierung geeignet sind.
Der cDNA Ansatz (Kapitel 2.2.23) wurde nochmals 1:4 verdünnt und 3 µl dieser
Lösung wurden zusammen mit jeweils 10 pmol Primern und 25 µl iQ SYBR Green
Supermix in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 µl eingesetzt. Die quantitative real
time-PCR wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 1. 95 °C, 3 min; 2.
35 x [94 °C, 30 s; 55 °C, 30 s; 72 °C, 30 s]; 3. 4 °C. Alle real time-PCR Analysen
erfolgten jeweils im Dreifachansatz mit mindestens drei unabhängigen RNA
Präparationen.