Regulationsmechanismen von Oxacillinresistenz und Biofilmbildung ...

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In den Vorarbeiten der Arbeitsgruppe von Professor Knobloch wurden die Einflüsse
von erhöhter Osmolarität und Alkoholen auf die Biofilmbildung untersucht. Die
phänotypische Charakterisierung der Mutante M15 konnte nicht die Frage beantworten,
ob die Regulation der Biofilmbildung über eine Regulation des alternativen Sigmafaktors
σ B erfolgt, oder ob RsbU selbst als Regulator der Biofilmbildung fungiert 146, 148 .
Außerdem konnte nicht beurteilt werden, ob die beobachteten Veränderungen lediglich
auf polare Effekte der Transposoninsertion zurück zu führen sind. Zur Klärung dieser
Fragen sollten im Rahmen dieser Doktorarbeit Mutanten generiert werden, bei denen
gezielt die Einzelgene des σ B Operons (rsbU, rsbV, rsbW und sigB), die regulative
Kaskade (rsbUVW), sowie das gesamte Operon (rsbUVWsigB) inaktiviert sind.
3.1 Etablierung der Deletionsmutanten in S. epidermidis
3.1.1 Generierung definierter Mutanten im σ B Operon
Um definierte Gene selektiv inaktivieren zu können, wurde die Methode des homologen
Genaustausches 151 gewählt. Hierfür wurden 540 – 798 bp große Fragmente amplifiziert,
welche das jeweilige zu deletierende Gen flankieren (Abbildung 2.1). Zwischen zwei
solcher Fragmente wurde als Selektionsmarker für eine erfolgreiche homologe Rekombination
eine Erythromycin (erm) Resistenzkassette in den temperatursensitiven
E. coli/Staphylokokken Shuttlevektor pBT2 kloniert (Abbildung 2.2). Um eine Transkription
der in Richtung 3´ Ende liegenden Gene zu ermöglichen und die Bildung von
antisense-RNA zu vermeiden, wurde die erm Kassette in positiver Orientierung in
Bezug zu dem σ B Operon kloniert. Die in E. coli klonierten Plasmide wurden zunächst
mittels Elektroporation in den restriktionsdefizienten S. aureus Stamm RN4220 transformiert.
Nach der Passage in diesem Zwischenwirt konnten die Plasmide durch Elektroporation
in S. epidermidis M15 transformiert und aus diesem Stamm durch Phagentransduktion
mit Φ71 in den eigentlichen Zielstamm S. epidermidis 1457 transduziert
werden. Durch Kultivierung bei für den temperatursensitiven Shuttlevektor nicht
permissiven Temperaturen, konnten durch entsprechende Antibiotikasupplementierung,
Mutanten mit einem erfolgreichen homologen Genaustausch selektioniert werden
(Tabelle 2.8, Abbildung 3.1).