Biochemie Praktikum I

Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012
LDH-Test / Proteinbestimmung
Enzymmenge und wir in der Enzymologie deshalb auch als Volumenaktivität (A V)
bezeichnet.
Durch Auflösen von (1) nach c erhält man
E
c = –––––
ε ⋅ d
daraus folgt für die Reaktionsgeschwindigkeit (dc/dt)
∆c ∆E
v = A V = ––– = –––––– (2)
∆t ∆t ⋅ ε ⋅ d
v : Reaktionsgeschwindigkeit
Av: Enzymaktivität (in der Küvette [1 µmol Substratumsatz / (min ⋅ ml) = U (unit) / ml]
∆E : Extinktionsänderung (2 cm = 0,1 bei 100mV, 2 cm = 0,01 bei 10mV)
∆t : Zeitänderung [min]
ε 366nm : 3,3 ml / (µmol ⋅ cm)
d : Lichtweg durch Küvette (1 cm)
Da uns eigentlich die Enzymaktivität in der Probe (nicht in der Messküvette interessiert) muss
die Verdünnung mit einberechnet werden. Gleichung (2) erweitert sich zu:
∆E V T
A V = –––––––
∆t ε ⋅ d
––––
V P
V T : Testvolumen (1000 µl)
V P : Probenvolumen (20 µl)
Quotient entspricht dem Verdünnungsfaktor
Durchführung des LDH-Aktivitätstests
Das Spektrometer wird im abs-Modus (absorbance (engl)= Extinktion 9 ) betrieben. Vor
Beginn der Messung wird das Spektrometer und der angeschlossene Schreiber mit dem
Nullwert geeicht (set reference am Photometer + Schreiber auf Nulllinie; Eingangsspannung
10 mV: Papierbreite entspricht einer Extinktionseinheit). Der Maximalausschlag des
Schreibers (Startposition zu Beginn der Reaktion) wird mit dem Maximalwert festgelegt.
Zur Messung wird folgender Testansatz verwendet:
67 mM Phosphatpuffer pH 7.2 940 µl
Pyruvatlösg. (2,75 mg / ml)
20 µl
NADH-Lösg. (11 mg / ml)
20 µl
Probenlösung (LDH) 20 µl
Zur Herstellung der Pyruvatlösung ca. 1 mg einwiegen und mit der zum Erreichen der
geforderten Konzentration notwendigen Menge Puffer auffüllen.
Zur Herstellung der NADH-Lösung ca. 4 mg einwiegen und mit der zum Erreichen der
geforderten Konzentration notwendigen Menge Puffer auffüllen.
9 unterscheide dazu: absorption (engl) = Absorption
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