Biochemie Praktikum I

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Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012 LDH-Test / Proteinbestimmung Umgebung existieren (zum Beispiel thermophile Bakterien) sind aber durchaus in der Lage Proteine zu synthetisieren, die auch unter solch extremen Bedingungen ihre Struktur und damit biologische Aktivität bewahren. Viele Proteine, so genannte Enzyme 1 , wirken in der Zelle als hocheffiziente Biokatalysatoren. Diese beschleunigen (bio)-chemische Reaktionen 2 und ermöglichen so die Umsetzung von Stoffen unter den milden Temperaturbedingungen des Lebens. Enzyme enthalten zusätzlich zur Pepidkette oft Cofaktoren. Diese sind für den Katalysemechanismus wichtig. Cofaktoren sind oft komplexe organische Moleküle oder Metallionen (z.B. Mg 2+ , Ca 2+ , Mn 2+ , Fe 2+ , Zn 2+ , Co 2+ ). Sind Cofaktoren fest an das Enzym gebunden spricht man von prostethischen Gruppen, transient bindende Cofaktoren nennt man Coenzyme. Enzyme sind wichtig für den chemischen Stoffwechsel der Zelle (Metabolismus), haben aber auch eine zentrale Bedeutung in der Regulation zellulärer Prozesse. Im vorliegenden Versuch sollen Enzymreaktionen am Beispiel der Lactatdehydrogenase (LDH) untersucht werden. Biowissen: Physiologische Bedeutung der Lactatdehydrogenase Lactatdehydrogenase (LDH) ist ein wichtiges Enzym des Energiestoffwechsels der Zelle. Die Zelle gewinnt Energie 3 durch Spaltung von Glucose 4 zu Pyruvat 5 , der sogenannten Glykolyse (siehe Abb. 2). In einem Zwischenschritt dieses metabolischen Weges wird Gycerinaldehyd- 3-Phosphat oxidiert. Dazu werden Reduktionsäquivalente (in Form von negativ geladenem Wasserstoff H - (Proton + 2 Elektronen) auf das Coenzym NAD + übertragen und dieses zu NADH reduziert. Unter aeroben Bedingungen (Vorhandensein von O 2 ) werden diese Redoxäquivalente im Citratzyklus und der Atmungskette regeneriert. Unter anaeroben Bedingungen ist dies so nicht möglich. Um dennoch ein Zusammenbrechen der Reaktion durch vollständigen Verbrauch der in der Zelle nur begrenzt vorhandenen NAD + -Moleküle zu verhindern, wird NAD + durch Oxidation regeneriert. Die Reduktionsäquivalente werden dazu durch das Enzym LDH auf Pyruvat übertragen und dieses zu Lactat 6 reduziert. Dieser Fall tritt beim Menschen bei kurzzeitiger Überlastung der Skelettmuskeln zum Beispiel beim Sport ein. Bei Sauerstoffmangel gewinnen die Muskelzellen weiter ATP durch Glykolyse und produzieren über den oben beschriebenen Mechanismus als Endprodukt Lactat. Der Milchsäurespiegel steigt an (der Athlet übersäuert). Die Bildung von Milchsäure in Reaktion auf Muskelbeanspruchung dient deshalb in der Sportmedizin als Maß der Belastung bzw. Belastbarkeit. In der Regenerationsphase wird Lactat mit Hilfe der LDH in der Leber zu Pyruvat oxidiert, welches dann in den aeroben Energiestoffwechsel eingeschleust und "verbrannt" werden kann 7 . Bestimmte (fakultativ anaerobe) Mikroorganismen, z.B. Milchsäurebakterien setzen die LDH-Reaktion zur ständigen Energiegewinnung unter Sauerstoffmangel ein; diesen Prozess nennt man Milchsäuregärung. Hefen haben eine alternativen Weg entwickelt: Sie reduzieren Pyruvat unter Abspaltung von CO 2 zu Ethanol (alkoholische Gärung) 8 . 1 εν ζψµe (en zyme): in Hefe (Wilhelm Kühne,1876) 2 um mindestens den Faktor 10 6 3 gespeichert in Form von ATP-Molekülen 4 Traubenzucker 5 Brenztraubensäure 6 Milchsäure 7 vollständiger Abbau zu CO 2 und Reduktionsäquivalenten, letztere werden in der Atmungskette der Mitochondrien unter Reduktion von O 2 zu H 2 O zur Synthese von ATP-Molekülen verwendet. 8 Beide Mechanismen sind von zentraler Bedeutung in bestimmten "biotechnologischen" Prozessen der Nahrungsmittelbereitung: Milchsäuregärung: Joghurt, Sauermilch, Käse, Sauerkraut, Alkoholische Gärung: Wein, Bier, Spirituosen, Backen 8
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