Biochemie Praktikum I

Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012
LDH-Test / Proteinbestimmung
Bestimmung der Proteinkonzentration (Gesamtprotein) nach Bradford
Neben der Proteinbestimmung nach der Biuret-, bzw. der Lowry-Methode stellt die
Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford eine geeignete Möglichkeit dar, auch
sehr kleine Proteinkonzentrationen (10-100 µg/ml) zu ermitteln. Zur Messung der
Proteinkonzentration werden Proteinlösungen mit dem blauen Farbstoff Coomassie Brillant
Blue R250 versetzt. Die Farbstoffmoleküle binden adsorptiv an die Proteinmoleküle; dadurch
tritt eine Verschiebung des Absorptionsmaximum nach 595 nm auf (vgl. Lottspeich,
Bioanalytik). Diese wird anhand von Extinkitionsmessungen ermittelt und daraus die
Proteinkonzentration bestimmt:
SO 3 Na
H 3 C
N
HN CH 3
H 3 C
CH 3
O CH 3
N +
SO
- 3
Abb. 3: Coomassie Brillant Blue R 250
Gegenüber anderen Proteinbestimmungen hat die Bradford -Methode folgende Vorteile:
- hohe Empfindlichkeit Proteinkonzentration im Test 1-10 µg (Biuret ca 100 µg)
- kurze Reaktionszeit (ca. 2 min)
- geringe Störanfälligkeit: keine Beeinflussung des Testergebnisses durch K + -, Mg 2+ -
Ionen, EDTA, TRIS, Thiolreagentien und Kohlenhydrate
Versuchsdurchführung
Erstellen einer Eichgerade
Um die ermittelten Extinktionswerte einer Proteinkonzentration c zuweisen zu können, muß
eine Eichgerade erstellt werden. Eine Verdünnungsreihe mit Rinderserumalbumin (BSA)
ansteigender Konzentration (10 – 100 µg/ml) wird zur Verfügung gestellt.
Von den Verdünnungen werden nun jeweils 100µl zu 1 ml Bradford-Stammlösung (vorgelegt
in Küvetten) gegeben (Verdünnungsfaktor 1 : 11). Die Küvetten mit Parafilm abdichten, gut
vermischen, 10 min inkubieren und anschließend messen
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