Biochemie Praktikum I

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Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012 LDH-Test / Proteinbestimmung Gemessen wird bei 595 nm. Vor Beginn der Messung wird das Spektrometer mit 1 ml Bradford-Stammlösung + 100 µl H 2 O auf Null gestellt (Extinktion der Negativkontrolle entspricht dem Nullwert). Durch Auftragen der bekannten Proteinkonzentrationen gegen die zugehörigen Extinktionswerte erhält man eine Eichgerade. Proteinverdünnungen zur Ermittlung der Eichgerade (2 mal unabhängig voneinander ansetzen und messen): Konz. c [µg/ml] Eichlösungen Extinktion 1. Messung Extinktion 2. Messung 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Auswertung: Erstellen der Eichgeraden auf Millimeterpapier: Extinktion Konzentration [ µg / ml ] Messung der Proteinkonzentration der LDH-Lösung / spezifische Aktivität Messung der Proteinkonzentratoin der LDH-Lösung mit Hilfe der Bradford-Methode. LDH- Probe so vorverdünnen, dass die Extinktion im Bereich der Eichkurve liegt. Extinktion bestimmen; Konzentration aus der Eichgerade ablesen. Aus der Volumenaktivität (VA; [U/ml]) und Proteinkonzentration (PK [mg/ml]) kann die spezifische Aktivität der Enzymlösung ermittelt werden. VA : PK = SA [U/mg] 12 diese kann ein Maß für den Reinheitsgrad des Enzyms sein Bei bekanntem MW 13 kann die Proteinkonzentration in µmol/ml umgerechnet werden. Bei Bildung des Quotienten erhält man die Umsatzzahl: K cat = VA[µmol/(ml • s) : PK [µmol/ml]; [µmol • ml / µmol • ml • s] = [1/s] K cat gibt an wie viele Substratmoleküle ein Enzymmoleküle in der Sekunde umsetzt 12 entsprechende Rechnungen wurden in den Übungen zur Biochemie I Vorlesung durchgeführt 13 LDH: 135 000 Da 14
Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012 LDH-Test / Proteinbestimmung Fragen zur Überprüfung ihres Wissensstandes / zum Nachdenken Wie sind Proteine aufgebaut? Was ist wichtig für die biologische Funktion von Proteinen? Was ist ein Enzym? Welche Bedingungen sind von Bedeutung für die Stabilität eines Proteins? Wie kann man die Änderung der Konzentration eines Substratmoleküls und damit die Reaktionsgeschwindigkeit messen? Welche Geräte werden dafür benötigt? Ist K cat ein Maß für die Effektivität eines Enzyms? 15
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Seite 3 und 4: Praktikumsskript Biochemie für Bio
Seite 7 und 8: Enzyme: Aktivität und Stabilität
Seite 13: Praktikumsskript Biochemie für Bio
Seite 33: Praktikumsskript Biochemie für Bio

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