Biochemie Praktikum I

Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012
Elektrophorese / TCA-Fällung
TCA Fällung/ Herstellung eines Proteinrohextrakts
Im folgenden Versuch soll ein Proteinextrakt von Hefezellen für die spätere Auftrennung in
einer SDS-Elektrophorese (PAGE) hergestellt werden.
Versuchsdurchführung
Ca. 1,5 ml einer über Nacht gewachsenen Hefekultur werden in 1,5 ml Reaktionsgefäßen
(Eppendorf Tubes) geerntet. Dazu wird die Flüssigkultur in das Tube überführt, 1min bei
4000 rpm in der Tischzentrifuge zentrifugiert und der Überstand anschließend verworfen.
Das Zellpellet wird nun in 300µl Kaliumphoshatpuffer (50mM K 2 PO 4 , pH 7,5) resuspendiert.
Anschließend werden der Suspension 100µl 50%ige TCA (Trichloressigsäure) zugegeben und
die Probe nochmals im Vortexer geschüttelt 1 .
Durch die Zugabe von TCA wird den Proteinen u.a. die Wasserhülle entzogen: dies führt zur
Denaturierung und Ausfällung der Proteine führt.
Die Proben werden nun > 30 min bei -80°C inkubiert.
Dieser Schritt wird benötigt um die Zellen aufzubrechen und die ausgefallenen Proteine
freizusetzen,
Nach der Inkubation werden die Proben bei 37°C im Thermoblock aufgetaut und die
ausgefallenen Proteine in der Tischzentrifuge präzipitiert (8 min, 13 000 rpm).
Der Überstand wird verworfen und das Pellet mit 500µl eiskaltem 80%igem Aceton
gewaschen. Bei diesem Schritt ist es besonders wichtig jede Probe gut zu vortexen, damit das
Pellet resuspendiert wird und ihm die verbliebene TCA und die Membranfette entzogen
werden.
Durch erneute Zentrifugation (8 min, 13 000 rpm) werden die ausgefallenen Proteine erneut
pelletiert. Der Überstand wird vollständig mit der Vakuumpumpe abgenommen (! Mit der
Spitze nicht zu nah an das Pellet kommen, da dieses sonst mit eingesaugt wird und die Probe
verloren geht!).
Das Pellet wird nun an der Luft getrocknet, bis kein Acetongeruch mehr vorhanden ist.
Bei unvollständigem Trocknen löst sich das Pellet nur schlecht oder gar nicht.
Das getrocknete Pellet wird in 80µl 1% SDS 0,1N NaOH aufgenommen. Nach 5 min
Inkubation bei Raumtemperatur wird das Pellet durch vortexen resuspendiert.
Der Lösung werden 20µl 5fach SDS-Probenpuffer zugesetzt und die Probe anschließend für
5min bei 95°C inkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt (1 min, 13 000 rpm) ist die Probe
für den Auftrag auf das SDS-Gel bereit. Alternativ kann sie bei -20°C gelagert werden. Vor
dem Auftrag muss sie dann nochmals gekocht und nicht gelöste Anteile durch Zentrifugation
abgetrennt werden.
1 Laborjargon: Vortexen
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