Biochemie Praktikum I

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Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012 SDS-Elektrophorese SDS-Elektrophorese Neben der Gelfiltration wird die Polyacrylamid-Gel-Electrophorese (PAGE) in SDS (Natriumdodecylsulfat) zur Molekulargewichtsbestimmung von Proteinen benutzt. Zur Trennung von Proteinen im Polyacrylamidgel wird einerseits der Siebeffekt des Gels, zum anderen die Ladung der Proteine ausgenutzt. Für die Molekulargewichtsbestimmung in der PAGE muss die unterschiedliche individuelle Ladung (stammt von den geladenen Aminosäureseitenketten des jeweiligen Proteins) der Proteine ausgeschaltet werden, damit die elektrophoretische Trennung allein von der Größe des Moleküls abhängt. Dies wird durch Verwendung des Detergens SDS erreicht. Durch Bindung von SDS werden Proteine: 1. denaturiert, d.h. von der nativen Struktur zu einer frei beweglichen Kette entfaltet und 2. durch Anlagerung des hydrophoben Teils des SDS an hydrophobe Bereich der Proteine wird dieses mit negativen Ladungen beladen, d.h. zu Polyanionen. +SDS natives Protein SDS-beladenes entfaltetes Protein SDS (Sodiumdodecylsulfate): Na + SO 4 - -CH 2 -(CH 2 ) 10 -CH 3 Da Proteine mit Disulfidbrücken in der SDS-PAGE häufig ein anormales Verhalten zeigen, werden die Disulfidbrücken vor der Elektrophorese mit β-Mercaptoethanol reduziert. Die Vorinkubation mit SDS und Mercaptoethanol schafft die Vorrausetzung für die Molekulargewichtbestimmung im SDS-Gel, da jetzt die Beweglichkeit der Proteine nur eine Funktion der Größe des Moleküls darstellt. Für die Molekulargewichtsbestimmung wird die relative Beweglichkeit von Proteinen mit bekanntem Molekulargewicht in Bezug auf einen internen Standard (meist Bromphenolblau) verglichen und eine Eichkurve aufgestellt, indem der Logarithmus des Molekulargewichts gegen den Rf-Wert (relative Beweglichkeit) aufgetragen wird. Aus dem Rf Wert des unbekannten Proteins kann somit dessen Molekulargewicht ermittelt werden. 24
Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012 SDS-Elektrophorese Das Trennmedium Durch Polymerisation des monomeren Acrylsäureamids und eines quervernetzenden bifunktionellen Reagenzes, meist Bis-Acrylsäureamid, wird ein dreidimensionales Netzwerk aufgebaut. Stryer, Biochemistry, Fifth Edition, 2002 Die Porengröße ist in einem weiten Bereich variabel: Die Polyacrylamidkonzentration kann in einem Bereich zwischen 2% und 30% liegen. Bei zu geringer Konzentration zerfließen die Gele, bei zu hoher Konzentration werden sie brüchig. Ein 7.5%iges Gel entspricht einem Porendurchmesser von 5 nm, ein 30% iges Gel einem Porendurchmesser von 2nm. Um schärfere Protein-Banden und damit eine bessere Auflösung zu erzielen, wird eine diskontinuierliche Elektrophorese durchgeführt (SDS-DISC-PAGE). Dazu wird ein diskontinuierliches Gel, bestehend aus einem kleinporigen Trenngel und einem großporigen Sammelgel, hergestellt. Die Polymerisationsreaktion verläuft radikalisch und wird durch Zusetzen eines Radikalbildners (Ammoniumpersulfat, TEMED) gestartet. 25
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