Biochemie Praktikum I
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<strong>Praktikum</strong>sskript <strong>Biochemie</strong> für Biologen-Bachelor SS2012<br />
Elektrophorese / CPY-Synthese<br />
Biosynthese von CPY<br />
Carboxypeptidase yscY (CPY) ist eine Exopeptidase, die in der Vakuole (entspricht dem<br />
Lysosom) der Hefe Saccharomyces cerevisiae lokalisiert ist. Es handelt sich um eine<br />
unspezifisch agierende Peptidase, welche ihre natürlichen Substrate, d.h. in die Vakuole<br />
eingeschleuste Proteine, vom Carboxy-Terminus her durch Spaltung von Peptidbindungen<br />
abbaut. Dabei spaltet sie bevorzugt hinter hydrophoben Aminosäuren.<br />
So lässt sich ihre Aktivität mit Hilfe synthetischer Peptidsubstrate, in denen z.B. an ein<br />
Phenylalanin oder ein Tyrosin carboxyterminal ein Chromophor gekoppelt ist, durch die<br />
Freisetzung dieser gefärbten Komponente verfolgen. Für die Spaltung des Substrats ist u. a.<br />
ein Serin-Rest im aktiven Zentrum des Enzyms erforderlich, die CPY wird deshalb zu den<br />
Serin-Peptidasen gerechnet.<br />
Die Carboxypeptidase yscY durchläuft nach ihrer Synthese einen Teil des sekretorischen<br />
Weges der Zelle (Endoplasmatisches Retikulum; Golgi-Apparat) und wird von dort in die<br />
Vakuole sortiert. Sie wird als ein höher-molekulares Vorläufermolekül (61 kDa) hergestellt,<br />
das nach seiner Modifizierung mit 4 Kohlenhydratketten im ER ein Molekulargewicht von 67<br />
kDa erreicht (p1-Form) und später durch weitere „outer-chain“-Mannosylierung im Golgi als<br />
69 kDa (p2)-Form vorliegt. In der Vakuole erfolgt die proteolytische Reifung zur aktiven<br />
Carboxypeptidase yscY mit einem Molekulargewicht von 61 kDa.<br />
Die proteolytische Reifung des Enzyms wird durch zwei weitere vakuoläre Peptidasen,<br />
Proteinase yscA und Proteinase yscB, katalysiert. Eine mutierte Form des Proteins, CPY*,<br />
wird im ER als falsch gefaltet erkannt und durch retrograden Transport aus dem ER hinaus<br />
dem Abbau durch das Proteasomen zugeführt. Für den Ablauf dieses Prozesses wird u. a. das<br />
Der3 Protein benötigt.<br />
In diesem Versuch sollen die verschiedenen Reifestadien der CPY mit Hilfe eines Immuno-<br />
Blots visualisert werden. Dazu werden Proteinextrakte von mutierten Hefestämmen<br />
verwendet.<br />
YWO 342 (WT); YWO 1527 (prc1-1 Δder3 Δdoa10); YWO 664 (Δpep4); YWO 636<br />
(Δprc1)<br />
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