Biosynthese von 4-Hydroxy-2 5-dimethyl-3 - Bina

iv
Zusammenfassung
ren Milieu (pH 3,5-5) wurde hingegen eine nur langsam ablaufende Racemisierung beobachtet.
In Inkubationsversuchen mit Erdbeerproteinextrakt bei pH 5 konnte die Bildung
von enantiomerenangereichertem HDMF (32 %ee) demonstriert werden. Der spezifische
Drehwert der HDMF-Enantiomere wurde mittels Polarimetrie einer über Chiralphasen
HPLC enantiomerenangereicherten HDMF-Lösung zu [α] t D = ±96° bestimmt. Das links-
drehende Isomer (-) zeigte unter den eingesetzten HPLC- wie auch cKZE-Bedingungen die
höhere Mobilität im Vergleich zum rechtsdrehenden (+).
Die so nachgewiesene enzymatische Aktivität konnte mittels Ultrafiltration, Gelpermeationschromatographie
(GPC) und Ionenaustauschchromatographie (IEC) partiell aufgereinigt
werden. Der Aktivitätsnachweis erfolgte dabei mit Hilfe des etablierten Inkubationsverfahrens.
Aktive Fraktionen von GPC und IEC wurden mittels SDS-PAGE analysiert.
Der beobachtete Aktivitätsverlauf korrelierte dabei mit dem Auftreten einer einzelnen Proteinbande
mit einem Molekulargewicht von ca. 37 kDa. Die N-terminale Blockierung des
Proteins machte die selektive Spaltung mittels Bromcyan an Methioninresten zur Sequenzanalyse
erforderlich. Die Spaltung des unter reduzierenden Bedingungen aufgereinigten
Proteins verlief jedoch unvollständig und lieferte nur wenige Peptidfragmente, entstanden
durch säurekatalysierte Hydrolyse. Die Sequenzanalyse zweier Fragmente mittels automatisiertem
Edman-Abbau lieferte zwei Peptidsequenzen, die vollständige Identität mit Teilsequenzen
einer stark reifeinduzierten vermuteten Chinon-Oxidoreduktase aus Erdbeeren
zeigte. Das aus der korrespondierenden Proteinsequenz der in der Datenbank angegebenen
Chinon-Oxidoreduktase cDNA errechnete Molekulargewicht von 34.3 kDa liefert unter
Berücksichtigung möglicher Derivatisierungen der Aminosäurereste eine gute Übereinstimmung
mit dem mittels SDS-PAGE bestimmten Molekulargewichtes des nativen Proteins.
Innerhalb der Proteinsequenz findet sich lediglich ein Methioninrest am N-Terminus
was die beobachteten Schwierigkeiten bei der Spaltung mit Bromcyan erklärt.
In weiterführenden Arbeiten gelang unserer Arbeitsgruppe (Daten unveröffentlicht) die
heterologe Expression der Chinon-Oxidoreduktase. Die Bildung von HDMF unter Einsatz
des exprimierten Proteins im etablierten Inkubationsverfahren lieferte den endgültigen
Identitätsnachweis des im Rahmen dieser Arbeit aufgereinigten Enzyms als Chinon-
Oxidoreduktase aus Erdbeerfrüchten. Von einer Beteiligung an der HDMF-Biogenese
muss ausgegangen werden.