resolver

Aus der
Abteilung für Cytologie
der Ruhr‐Universität Bochum
Leitung: Prof. Dr. rer. nat. Carsten Theiß
Hochauflösende Lebendzellbeobachtungen des Aktinzytoskelettes im
neuronalen Wachstumskegel –
der Einfluss von VEGF und Progesteron im peripheren Nervensystem
Publikationsbasierte
Inaugural – Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr‐Universität Bochum
vorgelegt von
Laura Olbrich
aus Duisburg
2014

Dekan:
Referent:
Korreferent:
Prof. Dr. med. Klaus Überla
Prof Dr. rer. nat. Carsten Theiß
Prof. Dr. med. Matthias Vorgerd
Tag der Mündlichen Prüfung: 28.04.2015

Histochem Cell Biol. 2013 Mar; 139 (3):431–45.
Fast rearrangement of the neuronal growth cone’s actin cytoskeleton
following VEGF stimulation
Laura Olbrich, Daniel Foehring, Patrick Happel, Beate Brand‐Saberi, Carsten Theiss
Abstract The neuronal growth cone plays a crucial role in the development of the nervous
system. This highly motile structure leads the axon to its final destination by translating
guidance cues into cytoskeletal rearrangements. Recently, vascular endothelial growth factor
(VEGF), which is essential for angiogenesis and vascular sprouting, has been found to
exert a trophic activity also on neurons, leading to an increased axonal outgrowth, similar
to the well‐known nerve growth factor (NGF). The neurotrophic properties of VEGF are
likely to be promoted via the VEGF receptor 2 (VEGFR‐2) and neuropilin‐1 (NRP‐1). In the
long term, VEGF attracts and influences the growth cone velocity and leads to growth cone
enlargement. The present study focuses on immediate VEGF effects using RFP‐actin and
GFP‐NF‐M microinjected chicken dorsal root ganglia for live cell imaging of the neuronal
growth cone. We analyzed actin and neurofilament dynamics following VEGF and NGF
treatment and compared the effects. Furthermore, key signaling pathways of VEGF were
investigated by specific blocking of VEGFR‐2 or NRP‐1. With the aid of confocal laser scanning
microscopy and stimulated emission depletion microscopy, we show for the first time
that VEGF has a quick effect on the actincyto‐skeleton, since actin rearrangements were
identifiable within a few minutes, leading to a dramatically increased motion. Moreover,
these effects were strongly enhanced by adding both VEGF and NGF. Most notably, the
effects were inhibited by blocking VEGFR‐2, therefore we propose that the immediate effects
of VEGF on the actincytoskeleton are mediated through VEGFR‐2.

Endocrinology. 2013 Oct;154(10):3784‐95.
Rapid impact of progesterone on the neuronal growth cone
Olbrich L.*, Wessel L.*, Balakrishnan‐Renuka A., Böing M., Brand‐Saberi B., Theiss C.
*contributed equally
Abstract In the last two decades sensory neurons and Schwann cells in the dorsal root
ganglia (DRG) were shown to express the rate‐limiting enzyme of the steroid synthesis, cytochrome
P450 side‐chain cleavage enzyme (P450scc), as well as the key‐enzyme of the
progesterone synthesis, 3ß‐hydroxysteroid dehydrogenase (3ß‐HSD). Thus, it was well justified
to consider that DRG neurons similarly are able to synthesize progesterone de novo
from cholesterol. As direct progesterone effects on axonal outgrowth in peripheral neurons
have not been investigated up to now, the present study provides first insights into the
impact of exogenous progesterone on axonal outgrowth in DRG neurons. Our studies including
microinjection and laser scanning microscopy demonstrate morphological changes
especially in the neuronal growth cones following progesterone treatment. Furthermore
we were able to detect a distinctly enhanced motility only a few minutes after start of progesterone
treatment using time‐lapse imaging. Investigation of the cytoskeletal distribution
in the neuronal growth cone before, during and after progesterone incubation revealed
a rapid reorganization of actin filaments. To get a closer idea of the underlying receptor
mechanisms, we further studied the expression of progesterone receptors in DRG
neurons using reverse transcription PCR (RT‐PCR), and immunohistochemistry. Thus, we
could demonstrate for the first time that classical progesterone receptors A and B (PR‐A,
PR‐B) and the recently described progesterone receptor membrane component 1
(PGRMC1) are expressed in DRG neurons. Antagonization of the classical progesterone receptors
by mifepristone revealed that observed progesterone effects are transmitted
through PR‐A and PR‐B.

Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 2014 Dec;62(12):835‐45.
New aspects of progesterone interactions with the actin cytoskeleton
and neurosteroidogenesis in the cerebellum and the neuronal
growth cone.
Wessel L., Olbrich L., Brand‐Saberi B., Theiss C.
Abstract The impact of progesterone on neuronal tissues in the central (CNS) and peripheral
(PNS) nervous system is of significant scientific and therapeutic interest. Glial and neuronal
cells of vertebrates express steroidogenic enzymes, and are able to synthesize progesterone
de novo from cholesterol. Progesterone is described to have neuroprotective,
neuroreparative, anti‐degenerative, and anti‐apoptotic effects in the CNS and the PNS.
Thus, the first clinical studies promise new therapeutic options using progesterone in the
treatment of patients with traumatic brain injury. Additionally, experimental data from different
animal models suggest further positive effects of progesterone on neurological diseases
such as cerebral ischemia, peripheral nerve injury and amyothropic lateral sclerosis.
In regard to this future clinical use of progesterone, we discuss in this review the underlying
physiological principles of progesterone effects in neuronal tissues. Mechanisms leading to
morphological reorganizations of neurons in the CNS and PNS affected by progesterone are
addressed, with special focus on the actin cytoskeleton. Furthermore, new aspects of a
progesterone‐dependent regulation of neurosteroidogenesis mediated by the recently described
progesterone binding protein PGRMC1 in the nervous system are discussed.

Für meine Familie

Inhaltsverzeichnis
I
Einleitung
1.1 Der Wachstumskegel und die axonale Zielfindung
1.2 Das Aktinzytoskelett
1.3 Der Vaskuläre Endotheliale Wachstumsfaktor und seine Rezeptoren
1.4. Progesteron im Nervensystem
4
4
5
6
7
II Zielsetzung 9
III
IV
Ergebnisse
3.1 Untersuchungen zum Neuritenwachstum
3.1.1 Untersuchungen zur Wirkung von VEGF
3.1.2 Untersuchungen zur Wirkung von Progesteron
3.2 Untersuchungen zur Morphologie des Wachstumskegels
3.2.1 Ultrastrukturelle Darstellung der Verteilung zytoskelettaler Proteine
3.3.2 Direkte Einwirkung von VEGF auf den neuronalen Wachstumskegel
3.3.3 Die Wirkung von VEGF auf die Morphologie des Wachstumskegels
3.3.4 Die Wirkung von Progesteron auf die Morphologie des
Wachstumskegels
3.3 Lebendzellbeobachtungen des neuronalen Wachstumskegels
Diskussion
3.3.1 Die Wirkung von VEGF
3.3.2 Die Wirkung von Progesteron
4.1 Der Effekt von VEGF auf das Auswachsen von Neuronen und die Form des
Wachstumskegels
4.2 VEGF ist ein schnelles Stimulanz des Aktinzytoskeletts im neuronalen
Wachstumskegel
4.3 VEGFR‐2 vermittelt die Effekte auf das Aktinzytoskelett
4.4 Die Wirkung von Progesteron auf periphere Spinalganglien
4.5 Progesteron hat einen direkten und schnellen Effekt auf das Aktinzytoskelett
4.6 Die Effekte von Progesteron werden durch Mifepriston inhibiert
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25
V Literaturverzeichnis 27
VI Anhang 32
1

Abkürzungsverzeichnis
25‐Dx
25kDa dioxin‐inducible protein
3β‐HSD
3β‐Hydroxysteroid‐Dehydrogenase
ABP
Aktin bindende Proteine
ADF
actin depolymerization factor
Aqua dest.
Aqua destillata
Arp 2/3 actin‐related proteins 2/3
Cdc42 cell division control protein 42
CLSM
Confocal Laser Scanning Microscopy
G‐Aktin
globuläres Aktin
GFP
green fluorescent protein
F‐Aktin
filamentäres Aktin
FITC
fluorescein isothiocyanate
Flk1 fetal Liver Kinase 1
Hsp27 Hitzeschockprotein 27
KDR
kinase domain region
mRNA
messenger Ribonucleic Acid
NFM
Neurofilament
NGF
Nerve growth factor
nm
Nanometer
µm Mikrometer
P450scc
cytochrome P450 side chain cleavage enzyme
PI3‐K
Phosphatidylinositol 3’Kinase
PNS
peripheres Nervensystem
PGRMC1 progesterone receptor membrane component 1
PR‐A/B
Progesteronrezeptor A/B
PRE
progesterone response element
RFP
red fluorescent protein
Rho
ras homolouge
SAPK
Stress Activated Protein Kinase
SGS
Spinalganglienstück
STED
stimulated emission depletion
TRITC
Tetramethylrhodamine
VASP
Vasodilatator stimuliertes Phosphoprotein
VEGF
Vascular Endothelial Growth Factor
VEGFR‐1 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1
VEGFR‐2 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2
Vema
Ventral midline Antigen
WASP
Wiskott‐Aldrich Syndrom Protein
ZNS
zentrales Nervensystem
2

Abbildungsverzeichnis
Abb. 1
Abb. 2
Abb. 3
Abb. 4
Abb. 5
Abb. 6
Abb. 7
Effekte von VEGF im Nervensystem
Effekte von Progesteron im Nervensystem
Einflussnahme auf das Auswachsen von Neuriten
Darstellung des Zytoskeletts neuronaler Wachstumskegel
Direkte Einwirkung von VEGF auf den neuronalen Wachstumskegel
Einflussnahme auf die Morphologie des Wachstumskegels
Stimulationen mit VEGF und Progesteron führen zu Alterationen in der Dynamik
7
8
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15
17
3

I
Einleitung
1.1 Der Wachstumskegel und die axonale Zielfindung
Die Funktion des Nervensystems wird maßgeblich von den Verschaltungen der Neurone bestimmt.
Diese werden vornehmlich während der Entwicklungsphasen des zentralen (ZNS) und peripheren
(PNS) Nervensystems angelegt, doch auch zu späteren Zeitpunkten sind Neuverknüpfungen
möglich. Grundlage dieser Verschaltungen sind hochkomplexe Mechanismen, welche die richtige
Zielführung und –findung gewährleisten. Um hierbei die korrekten Anknüpfungsstellen zu finden,
ist das spezialisierte Vorderende aussprossender Neurone, der Wachstumskegel (growth
cone), von essenzieller Bedeutung. Erstmals 1890 von Santiago Ramón y Cajal (1890) beschrieben
[12], empfängt der Wachstumskegel spezifische und unspezifische Signale, verarbeitet diese und
wandelt sie in gerichtete Umstrukturierungen und Bewegungen um. Mit Hilfe seiner großen rezeptiven
Oberfläche verbindet der Wachstumskegel somit sensorische, motorische, integrative und
adaptive Funktionen.
Die neuronale Migration und axonale Zielfindung wird geleitet von Signalen, welche zum einen in
gebundener und zum anderen in löslicher Form auf den Wachstumskegel einwirken. Adhäsive Moleküle
auf Zelloberflächen (transmembrane Zelladhäsionsmoleküle (CAM)) oder in der extrazellulären
Matrix (Laminin und Fibronektin) beeinflussen durch direkte Bindungen an Rezeptoren auf Zellmembranausstülpungen
des Wachstumskegels und über dadurch ausgelöste intrazelluläre Signalkaskaden
die Führung des Axons. Zusätzlich sind auch anti‐adhäsive oberflächengebundene Moleküle
bekannt, wie etwa Slit und Ephrin [15]. Hinzu kommen die gelösten Stoffe, welche über Konzentrationsgradienten
im Sinne der Chemotaxis sowohl anziehend als auch abstoßend wirken.
Hierzu gehören u.a. Morphogene, Transkriptionsfaktoren, neurotrophische Faktoren und Neurotransmitter.
Wie die Signalmoleküle auf den Wachstumskegel wirken, hängt dabei von der intrazellulären
Verarbeitung der umgebungsbedingten Signale ab [18, 41].
Die Dynamik des Wachstumskegels ist hauptsächlich durch tastende Bewegungen gekennzeichnet;
findet dieser anziehende Signale, lässt sich ein Längenwachstum in Richtung des Gradienten feststellen.
Bei abstoßenden Signalen wiederum wird entweder ein Umlenken oder ein Wachstumsstopp
beobachtet. Das Auswachsen manifestiert sich als Verlängerung des Axons, wobei der
Wachstumskegel sowohl im PNS als auch im ZNS proximal zum Axon reift. Das Vorschieben (protrusion)
kennzeichnet eine Elongation von Filopodia und Lamellipodia, es folgt eine Verdichtung
(engorgement), wobei ein gerichteter Transport von Vesikeln und Organellen in die Schleier der
Lamellipodia stattfindet. In der anschließenden Festigungsphase (consolidation) nimmt der proximale
Teil des Wachstumskegels eine zylindrische Form an, und ein reger bidirektionaler Organellen‐Transport
ist zu beobachten. Diese Mechanismen führen insgesamt zu einer Addition eines
neuen distalen Segmentes am Axon [15, 16, 28, 41].
4

Grundlage dieser Prozesse ist das Zytoskelett, bestehend aus verschiedenen Strukturproteinen,
welche wiederum für die morphologische Gliederung des Wachstumskegels genutzt werden. Dabei
wird zwischen P (peripher)‐, T (transition)‐ und C (central)‐Region unterschieden. Letztere beinhaltet
eine Vielzahl von Organellen und Vesikeln, und die hier verankerten Neurofilamente und Mikrotubuli
reichen durch die C‐Zone und den angrenzenden Actomyosin‐Bogen der Transitzone. Kennzeichnend
für die P‐Zone ist hingegen der Aufbau aus Aktinfilamenten [7, 24, 68]. Organisiert wird
diese periphere Domäne zum einen durch fingerartige Filopodien – schmale zylindrische Ausstülpungen,
welche sich weit und fein ausstrecken können – und zum anderen durch fächerartige, flache
Lamellipodien [15]. Diese Strukturen bilden durch eine Vergrößerung der Zellmembran eine
enorme sensorische Oberfläche. Verschiedene Studien zeigen, dass es eine direkte Korrelation zwischen
der Form des Wachstumskegels und dem neuritischen Auswachsen gibt. Da diese Form maßgeblich
durch Lamellipodien und Filopodien bestimmt wird, ist ein unmittelbarer Zusammenhang
zwischen der Größe und Dynamik dieser Strukturen und dem neuronalen Aussprossen gegeben.
Dies ist sowohl in sympathischen Neuronen [1] als auch Spinalganglien [6] beschrieben worden.
Eine Einflussnahme auf das hochkomplexe Gebilde des Wachstumskegels ist schon lange von Interesse,
da hier möglicherweise neue Ansätze zur Behandlung von Verletzungen oder Erkrankungen
des ZNS und PNS liegen. Verschiedene Substanzen wurden in diesem Zusammenhang beschrieben,
wie beispielsweise auch der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF), welcher wachstumsfördernd
auf den Wachstumskegel wirkt [23, 61]. Doch auch das Hormon Progesteron scheint
einen fördernden Effekt sowohl auf zentrale [8] als auch periphere Neurone zu haben [63].
1.2 Das Aktinzytoskelett
Innerhalb des Zytoskeletts spielt besonders Aktin im Rahmen der Dynamiken eine grundlegende
Rolle. So stellt es in den Signalwegen der Bewegung und Führung des Wachstumskegels einen der
beiden Endpunkte dar. Desweiteren sind die Mikrotubuli zentrale Effektoren, welche essenziell für
die Struktur und die Elongation des Axons sind. Doch insbesondere Aktinfilamente (F‐Aktin) ist wesentlich
für die Erhaltung der Form des Wachstumskegels und das gerichtete Auswachsen des Neurons
und kontrolliert damit die morphologischen und mechanischen Antworten auf die
Umgebung
[15].
Es handelt sich um ein abundant vorkommendes Strukturmolekül, welches durch seine schnellen
Adaptations‐ und Umformungsfähigkeiten charakterisiert ist. Aktinfilamente sind helikale Polymere,
die aus Aktinmonomeren, dem globulärem Aktin (G‐Aktin), aufgebaut sind. F‐Aktin findet
sich schließlich zu verschieden großen Gebilden zusammen, welche eine strikte Polarität aufweisen;
während am „barbed end“, dem Plusende, ein schnelles Wachstum durch Addition von G‐Aktin
nachzuweisen ist, wächst das „pointed end“, das Minusende, langsam [55].
5

Wie auch die Mikrotubuli befinden sich Aktinfilamente in einem ständigen Auf‐ und Abbau. Dieser
findet parallel statt, da die Zelle diese Polymere sowohl in stabiler, als auch dynamischer Form benötigt.
Um der Notwendigkeit einer sicheren Elongation des Axons und der Dendriten nachzukommen,
werden diese Abläufe durch die intrinsische Polarität sowie von verschiedenen Aktin bindenden
Proteinen (ABP) reguliert. Es lassen sich unterschiedliche Klassen unterscheiden, welche (1)
Aktinmonomere binden bzw. schneiden, (2) Filamente verzweigen, (3) sowohl das barbed‐ als auch
das pointed‐end bedecken (Capping‐Proteine) bzw. genau davor schützen, (4) die Filamente bündeln
oder anderweitig stabilisieren oder (5) das F‐Aktin in der Membran oder anderen Zellregionen
verankern. Bisher sind mehr als 20 ABP identifiziert worden, welche F‐ und/oder G‐Aktin
binden und bereits immunhistochemisch im Wachstumskegel lokalisiert wurden [15].
Die Fülle der ABP wirkt abhängig vom Zustand des Wachstumskegels, der Lokalisation des jeweiligen
ABPs sowie dem Phosphorylierungszustand. Diese Regulation geschieht oft durch Mitglieder
der Rho‐Familie. So interagieren Rac und Cdc42 beispielsweise mit der WASP/WAVE‐Familie, welche
wiederum den Phosphorylierungszustand von Arp2/3 beeinflussen. Die Gruppe der Rho‐GTPasen
wirken so als zentrale Regulatoren für Protrusion und kontrollieren die Formation der Lamellipodien
und Filopodien [56]. Dieser hochdynamische Prozess ist die Grundlage für jede Zellbewegung
und somit häufiger Angriffspunkt von Signalmolekülen. Bisher sind verschiedene ABP identifiziert
worden, welche von diesen Signalmolekülen aktiviert bzw. deaktiviert werden. Dazu gehören
etwa Ena/VASP, welche sowohl dem Netrin/DCC als auch dem Slit/Robo Signalweg nachgeschaltet
sind, und Cofilin, welches über den Semaphorin3A/Neuropilin‐Weg koordiniert wird [15].
Die so empfangenen Signale verwandelt das zugrundeliegende dynamische Aktinzytoskelett direkt
in Bewegungsänderungen [51, 52]. Die Signalstoffe binden an die entsprechenden Rezeptoren, welche
mit dem dynamischen Zytoskelett interagieren und so eine schnelle und unmittelbare Reaktion
gewährleisten.
1.3 Der Vaskuläre Endotheliale Wachstumsfaktor und seine Rezeptoren
VEGF wurde in den frühen 80er Jahren des letzten Jahrhunderts im Zusammenhang mit endothelialem
Wachstum beschrieben [66]. Unter den verschiedenen Mitgliedern der VEGF‐Familie ist besonders
VEGF‐A von Interesse. Mittlerweile sind zahlreiche Wirkungen dokumentiert wie eine gesteigerte
vaskuläre Permeabilität oder die maßgebliche Rolle in der Regulation der Angiogenese
[22]. Auch im klinischen Kontext hat VEGF eine große Bedeutung, vor allem bei Tumorerkrankungen,
Herz‐Kreislauf‐Erkrankungen, Schlaganfall, amyotropher Lateralsklerose, diabetische Retinopathie
oder altersbedingter Makula‐Degeneration [21]. Mittlerweile wird VEGF als Angriffspunkt in
verschiedenen pharmakologischen Therapien genutzt, so etwa in Form des ersten humanen anti‐
6

VEGF‐A Antikörpers „Bevacizumab“. Dieser ist in der Therapie von fortgeschrittenen malignen Neoplasien
des Kolons, der Lunge, der Brust, der Nieren und der Ovarien zugelassen. In verschiedenen
klinischen Studien reduziert dieser monoklonale Antikörper die VEGF‐getriggerte Tumorvaskularisierung
signifikant und ist so zudem in der Studienphase 2 bei der Behandlung der Glioblastoma
multiforme in der Erprobung [30, 54].
Strukturell gesehen ist VEGF A ein dimeres Polypeptid, welches in verschiedenen Isoformen mit
jeweils unterschiedlichen Eigenschaften zu finden ist. Insgesamt sind vier Isoformen bekannt
(VEGF‐A‐121, ‐165, ‐189 und ‐206), wobei VEGF‐A‐165 als die biologisch aktivste Form beschrieben
wird [22]. Seine Wirkungen vermittelt VEGF‐A‐165 über verschiedene Rezeptoren. Neben dem regulierend
wirkenden VEGF‐Rezeptor 1 spielt insbesondere der VEGF‐Rezeptor 2 eine
wichtige
Rolle. Über diese „Rezeptor‐assoziierte Tyrosinkinase“, in der Literatur auch „kinase domain region“
(KDR) oder Flk‐1 genannt, werden die meisten bekannten Effekte von VEGF
vermittelt, wie
etwa die Proliferation, die Migration, das Überleben von Endothelzellen und die Angiogenese. Aufgebaut
ist der VEGFR‐2 aus sieben extrazellulären, Immunglobulin‐ähnlichen Domänen, einer transmembranären
Region und der erwähnten intrazellulären Tyrosinkinase‐Sequenz [22]. Im Nervensystem
fungiert zudem Neuropilin‐1, ein nicht‐Tyrosinkinase Rezeptor, als Co‐Rezeptor für VEGF‐A
[22, 77].
Effekte von VEGF im Nervensystem
• axonales Auswachsen zervikaler und lumbaler Spinalganglien [5, 23, 31,
32, 35,51, 59, 70, 71, 77]
•anti‐apoptotische Effekte bei Hypoxie kortikaler Neurone [32]
• Förderung der Neurogenese in vivo und in vitro [32]
• Förderung der Proliferation und Protektion von Astrozyten [67, 76],
Schwannzellen [64, 70, 71], Mikroglia [25] und kortikalen Neuronen [32]
• wachstumsfördernden Einfluss auf den neuronalen Wachstumskegel
[23, 51, 61]
Abb. 1 Effekte von VEGF im Nervensystem
Auch die trophischen Effekte von VEGF im Nervensystem werden über diese Rezeptoren vermittelt,
hierzu gehören u.a. eine Steigerung des axonalen Auswachsen von zervikalen und lumbalen Spinalganglien
[23, 51, 70, 71], anti‐apoptotische Effekte bei Hypoxie kortikaler Neurone [32], eine Förderung
der Proliferation, Zellkommunikation und Zellbewegung in kultivierten Gliazellen [76] und
Förderung der Neurogenese in vivo und in vitro [32]. VEGF und seine Rezeptoren sind jedoch insbesondere
während der Entwicklung des Nervensystems nachzuweisen, im Adulten jedoch lediglich
in hoch vaskularisierten Regionen, wie etwa dem Plexus choroideus [69, 77].
7

1.4 Progesteron im Nervensystem
Auch das vorwiegend für seine Wirkungen als Sexualhormon bekannte Progesteron weckt seit zwei
Dekaden immer mehr Interesse für seine Wirkungen im Nervensystem. Der Familie der Steroidhormone
zugehörig ist es zugleich wichtigster Vertreter der Gestagene und wirkt vornehmlich während
des weiblichen Zyklus und der Schwangerschaft. Doch es wurden auch verschiedene non‐reproduktive,
neuroprotektive und neuroregenerative Effekte beschrieben [3, 26, 29, 65]. Sowohl im
PNS [63] als auch im ZNS [47] werden die essenziellen Enzyme der Steroidsynthese exprimiert.
Diese ermöglichen es den Zellen, u.a. Progesteron de novo aus Cholesterol über die Bildung von
Pregnenolon zu synthetisieren. Hierbei sind besonders die Schlüsselenzyme
„cytochrome
P450 side chain cleavage enzyme“ (P450scc) und „3β‐Hydroxysteroid‐Dehydrogenase“ (3β‐HSD)
von Interesse. Dies weist darauf hin, dass sowohl im zentralen als auch im peripheren Nervensystem
endogenes Progesteron gebildet wird.
Viele Wirkungen des Progesterons werden über genomische Mechanismen vermittelt. Hierbei fungieren
die klassischen Progesteronrezeptoren A (PR‐A) und B (PR‐B) als Transkriptionsfaktoren, welche
ihre Konformation nach Bindung von Progesteron ändern und anschließend als Komplex an die
DNA binden. Zunehmend werden jedoch auch andere, non‐genomische Signalwege
beschrieben
[27]. Hier scheint vornehmlich der Vema‐Rezeptor, auch bekannt als „progesterone receptor
membrane component 1“ (PGRMC1), von Bedeutung zu sein. Ihm wird eine wichtige Rolle in der
Regulation der axonalen Zielfindung zugesprochen, besonders, da es eine alters‐abhängige Expression
im Rückenmark zu geben scheint, insbesondere während embryonaler Entwicklungsphasen
[62]. Bisher fehlen jedoch Studien zur Wirkung von Progesteron auf den neuronalen Wachstumskegel
peripherer Neurone.
Effekte von Progesteron im Nervensystem
• Förderung der Neurogenese und neuronale Entwicklung [3]
• Posttraumatische und anti‐degenerative Neuroprotektion [3, 26, 29]
• Regulation der Myelinisierung und axonale Regeneration im PNS [3, 63,
65]
• wachstumsfördernden Einfluss auf den neuronalen Wachstumskegel
[52]
• positiver Einfluss bei peripherem neuropathischen Schmerz [53]
Abb. 2 Effekte von Progesteron im Nervensystem
8

II
Zielsetzung
Die vorliegende Promotionsarbeit befasst sich mit dem Wachstumskegel als Grundlage neuronaler
Regeneration. Wie wichtig eine funktionierende Kommunikation und somit die grundlegende, korrekte
Verschaltung der neuronalen Netzwerke ist, zeigen die Einschränkungen von Betroffenen,
welche unter Fehlbildungen, Erkrankungen oder Verletzungen des PNS und ZNS leiden. Ziel dieser
Studie ist dabei, genauere Einblicke in den Vorgang der axonalen Wegfindung und der Dynamik
des Wachstumskegels zu gewinnen, um Grundlage für neue therapeutische Möglichkeiten zu schaffen.
Daher befasst sich diese Dissertationsarbeit mit der Wirkung von VEGF und
peripheren Nervensystem.
Progesteron im
Beide Substanzen haben sich in jüngerer Vergangenheit als wirkungsvoll im Nervensystem erwiesen.
Für beide sind neuroprotektive und anti‐apoptotische Eigenschaften auf verschiedene neuronale
Zelltypen beschrieben. Während für VEGF bereits Effekte auf das neuronale Auswachsen
und den Wachstumskegel beschrieben sind [23, 61], fehlt es jedoch bislang an detaillierteren Studien
zur Morphologie und Dynamik. Für Progesteron hingegen sind zwar Effekte im zentralen Nervensystem
nachgewiesen [3, 26, 29, 65], zur Wirkung an Wachstumskegeln gibt es jedoch bisher
wenige Daten. In dieser Studie liegt daher nicht nur ein besonderer Schwerpunkt auf der Analyse
des axonalen Auswachsens, sondern besonders auf der morphologischen Untersuchung der
Wachstumskegel und des Aktinzytoskeletts. Da ein Zusammenhang zwischen der Form und der Dynamik
beschrieben ist [1], stellen Lebendzellbeobachtungen des Wachstumskegels einen weiteren
Schwerpunkt dieser Arbeit dar. Mit Hilfe der Untersuchungen der zugrundeliegenden essenziellen
Signalkaskaden sollen somit weitere Einblicke in die axonalen Wegfindung sowie mögliche Therapieansätze
gewonnen werden.
Hierfür wurden primäre Spinalganglien aus Hühnerembryonen mit 0,1 µg/ml VEGF bzw. 10 nM Progesteron
für 72 Stunden inkubiert, morphometrisch vermessen und mit unbehandelten Kontrollen
verglichen. Zur Studie der Dynamiken wurden Lebendzellbeobachtungen durchgeführt. So
konnten mit Hilfe von Mikroinjektionen, immunhistochemischen Markierungen und morphologischen
Untersuchungen am CLSM neue Einblicke in die zytoskelettalen Umstrukturierungen nach
Behandlung mit VEGF und Progesteron gewonnen werden. Es wurden die zugrundeliegenden essenziellen
Signalkaskaden identifiziert, indem die Proben mit den Inhibitoren Axitinib – welches den
VEGFR‐2 blockiert – und Mifepriston – als Progesteronrezeptor‐Antagonist – behandelt wurden.
9

III
Ergebnisse
3.1 Untersuchungen zum Neuritenwachstum
Zur Quantifizierung des Neuritenwachstums wurden primäre Spinalganglienstücke aus Hühnerembryonen
gewonnen und unter verschiedenen Bedingungen drei Tage lang kultiviert. Nach anschließender
Fixierung und immunhistochemischer Markierung der Neurofilamente ließen sich deren
Verteilung in den Neuronen über mehrere hundert µm verfolgen. Die morphometrische Auswertung
erfolgte am CLSM (Zeiss LSM 510), wobei die Neuritenlänge in µm bestimmt wurde (Abb.
1).
Abb. 3 Einflussnahme auf das Auswachsen von Neuriten
Darstellung des Neuritenwachstums mit Hilfe immunhistochemischer Markierung von NFM‐FITC und
Auswertung am CLSM. Nach Kultivierung über 72h in (a) Nährmedium ohne jegliche stimulierende Faktoren,
(b) nach Addition von 50 ng/ml NGF, (c) 0,1 µg/ml VEGF, (d) VEGF + NGF, (e) 10 nM Progesteron
und (f) Progesteron + NGF sind deutliche Alterationen in der (g) quantitativen Auswertung festzustellen.
(** p

3.1.1 Untersuchungen zur Wirkung von VEGF
In diesem Versuchsaufbau wurden die Wirkungen von NGF [50 ng/ml], VEGF [0,1 µg/ml] und VEGF
+ NGF sowie nach Blockade des VEGFR‐2 (durch Axitinib [58 µmol/ml]) mit Kontrollen verglichen.
Rein deskriptiv ließen sich große Unterschiede feststellen. Während bei allen Proben ein radiäres
Auswachsen nachzuweisen war, zeigte die alleinige Inkubation mit NGF (Abb. 1b) ein deutlich dichteres
Neuritengeflecht und ein gesteigertes Auswachsen. Bereits nach alleiniger Inkubation mit
VEGF waren diese Effekte nochmals sichtbar gesteigert (Abb. 1c). Bei einer kombinierten Applikation
von VEGF + NGF (Abb. 1d) wuchsen die Neuriten noch weiter aus, und auch das Neuritengeflecht
präsentierte sich dichter. Durch die Hinzugabe des VEGFR‐2‐Inhibitors Axitinib konnten die
durch VEGF hervorgerufenen Wirkungen blockiert werden, so dass die so behandelten Proben mit
den Kontrollen vergleichbare morphologische Eigenschaften aufwiesen, wobei toxische Wirkungen
auf die Nervenzellen ausgeschlossen wurden.
Für die morphometrischen Analysen wurden pro Bedingung 8 Spinalganglienstücke an jeweils 8
Punkten vermessen (n=8, 64 Neuriten pro Bedingung; Gesamtzahl 320). Die Ergebnisse bestätigten
den ersten Eindruck (Abb. 1g), denn während die durchschnittliche Neuritenlänge in den Kontrollen
1271 ± 342 µm betrug, war eine Steigerung um 37% nach NGF‐ (1 721 ± 226 µm, p

µm, p

oskopie am RUBION untersucht. Dieses Verfahren erlaubt eine Auflösung im ultrastrukturellen Bereich,
da hierbei die Fluoreszenzsignale nicht beugungsbegrenzt sind. Durch verschiedene Filter
wird ein Teil der Fluoreszenzsignale gezielt abgeregt. Auf diese Weise werden die Emissionen
im Außenbereich des Anregungsfokus ausgeschaltet, so dass an dem vorhandenen STED Aufnahmen
mit einer Auflösung von circa 70 nm (lateral) möglich waren.
Auch mit dieser Technik ließ sich die typische Anordnung der Aktinfilamente in sehr großer Detailgenauigkeit
darstellen. Wie in der Literatur beschrieben, werden die Filopodien aus zylindrisch
angeordneten Bündeln geformt, während die Lamellipodien aus netz‐ oder maschendrahtförmigen
Aktinfilamenten gebildet werden (Abb. 2c).
3.2.2 Direkte Einwirkungen von VEGF auf den neuronalen Wachstumskegel
Um festzustellen, ob es sich bei VEGF um einen direkten Lockstoff für den Wachstumskegel handelt,
wurden 3‐9 Tage alte Zellkulturen im Phasenkontrastmikroskop beobachtetet. Hierfür wurde
eine feine Glaskapillare mit einem VEGF‐Aqua dest.‐Gemisch [0,1 µg/ml] befüllt und so platziert,
dass etwa 7‐10 µm vor dem Wachstumskegel ein konstanter VEGF‐Gradient entstand. Schon nach
etwa 10 Minuten zeigte sich ein deutlich gerichtetes Wachstum auf die Glaskapillare zu, und selbst
nach dem Replatzieren der Nadel folgten die Wachstumskegel dem Gradienten und änderten ihre
Wachstumsrichtung (Abb. 3). Kontrollen mit reinem Aqua dest. führten nicht zu einer Alteration
des Wachstums.
Abb. 5 Direkte Einwirkung von VEGF auf den neuronalen Wachstumskegel
VEGF wirkt als direkter Lockstoff auf den Wachstumskegel, welcher direkt in Richtung der VEGF gefüllten
Kapillare (10μg/ml) wächst und ihrer Bewegung folgt. Maßstab 100 µm
3.2.3 Die Wirkung von VEGF auf die Morphologie des Wachstumskegels
Wie in den Untersuchungen zum Neuritenwachstum wurden auch hier die Wirkungen von NGF [50
ng/ml], VEGF [0,1 µg/ml], VEGF + NGF und Axitinib [58 µmol/ml] mit Kontrollen verglichen (Inkubationen
über 72 Stunden). Die mit NGF behandelten Proben zeigten eine deutliche Größenzunahme
(Abb. 4 a+b), ähnlich verhielten sich auch die mit VEGF inkubierten Spinalganglienstücke (SGS). Interessanterweise
waren sowohl die Lamellipodien als auch die Filopodien zwar ähnlich in ihrer
Form, jedoch nach VEGF‐Stimulation in ihrer Anzahl deutlich gesteigert (Abb. 4c). Zudem schien die
Dichte des Aktinzytoskeletts zugenommen zu haben. Die Behandlung mit der Kombination VEGF +
13

NGF führte zu einer weiteren Vergrößerung beider Parameter, charakterisiert durch noch längere
Filopodien und weitere Lamellipodien. Auch hier führte eine Blockade von VEGFR‐2 zu einer Inhibition
dieser Effekte.
Die morphometrischen Analysen bestätigten den deskriptiven Eindruck (Abb. 4g). Gemessen wurden
Umfang und Fläche, ausgehend von der Basis des Wachstumskegels, welche mit einem axonalen
Durchmesser von 2 µm definiert ist. Pro Bedingung wurden 20 Wachstumskegel von mindestens
9 verschiedenen SGS (n = 9 SGS, 20 Wachstumskegel pro Bedingung; Gesamtzahl 100) analysiert.
Während nach Inkubation mit dem Kontrollmedium der mittlere Umfang 53 µm und die mittlere
Fläche 33 µm² betrugen, führte die alleinige Behandlung mit VEGF zu einer Größenzunahme von
48% (Umfang 78 µm; p

Abb. 6 Einflussnahme auf die Morphologie des Wachstumskegels
Nach einer 3‐tägigen Inkubation in (a) Kontrollmedium, (b) 50 ng/ml NGF, (c) 0,1 µg/ml VEGF, (d ) VEGF +
NGF, (e) 10 nM Progesteron und (f) Progesteron + NGF wurden die Wachstumskegel morphometrische Vermessen
(g). Hierbei waren deutliche Unterschiede sowohl im Umfang, als auch der Fläche zu bemerken.
Grün: NFM‐FITC, rot: Phalloidin‐TRITC (**p

waren um mehr als 30% vergrößert (Mittelwert Umfang 69 µm, Mittelwert Fläche 45 µm²;
p

inkubierten Proben (Abb. 5b) war die Umfangsbewegung von ständigen Umstrukturierungen und
Formänderungen gekennzeichnet, und zudem kam es häufiger zu einem gerichteten Auswachsen.
Diese Effekte waren extrem gesteigert, der Umsatz an Filopodien und Lamellipodien nahm deutlich
zu, und die Wachstumskegel präsentierten sich äußerst motil. Auch hier ließ sich die Wirkung von
VEGF durch eine Blockade des VEGFR‐2 aufheben, denn die mit Axitinib behandelten [58µmol/ml]
Wachstumskegel verhielten sich so wie die Kontrollen.
Abb. 7 Stimulationen mit VEGF und Progesteron führen zu Alterationen in der Dynamik
Im Vergleich zu den (a) Kontrollen zeigen die Versuche mit (b) 0,1 µg/ml VEGF und (c) 10 nM Progesteron eine
deutlich beschleunigtes Auswachsen und (d) eine gesteigerte Rate der Umfangsbewegung. Grün: GFP ‐NFM,
rot: RFP‐Aktin. (** p

Für die morphometrischen Analysen wurden jeweils acht Wachstumskegel pro Kondition über einen
Zeitraum von 15 Minuten vermessen (Abb. 5d). Eine Addition stimulierender Faktoren führte
zu einer Zunahme der Bewegungsgeschwindigkeit von 1,5 µm/min (Kontrolle) zu einer Steigerung
um 77% nach NGF‐ (2,7 µm/min; p

IV
Diskussion
Sobald die fein abgestimmte Kommunikation zwischen den Nervenzellen im zentralen oder peripheren
Nervensystem gestört ist, hat dies drastische Auswirkungen auf die Betroffenen. Missbildungen,
Verletzungen oder Erkrankungen führen zu einer Störung in der korrekten Verschaltung
neuronaler Netzwerke. Diese können durch genetische und epigenetische Faktoren hervorgerufen
werden oder auch durch Degenerationen infolge einer Verletzung oder einer Sauerstoffunterversorgung
– bspw. im Rahmen eines Schlaganfalles. Um hier neue therapeutische Wege zu gehen
und die Vorgänge der Regeneration von Nervengewebe zu verstehen, ist ein besseres Verständnis
der molekularen, zellulären oder funktionalen Zusammenhänge von großer Bedeutung. Insbesondere
die Einflussnahme auf die Anpassungsfähigkeit des Nervensystems und eine mögliche Förderung
des neuronalen Heilungsprozesses (und somit die Wiederherstellung zerstörter Nervenzellverbindungen)
sind zentrale Punkte wissenschaftlichen Interesses um neue therapeutische Ansätze
zu finden.
Eine der Strukturen, die in diesem Zusammenhang von großer Bedeutung ist, ist der neuronale
Wachstumskegel. Dieses spezialisierte Vorderende befindet sich am äußersten Ende aussprossender
Neurone und bildet die sensorische und motorische Grundlage jedes auswachsenden Axons.
Der Wachstumskegel leitet die Wegfindung, indem er spezifische und unspezifische Signale verarbeitet,
die Informationen in das Zellinnere weiterleitet und mit einer Umstrukturierung der Form
reagiert. Diese dynamischen Eigenschaften werden durch das Zytoskelett möglich. Auch wenn feine
Unterschiede bestehen, ist der zytoskelettale Aufbau in den Wachstumskegeln der verschiedenen
Spezies und Nervenzelltypen sehr ähnlich. Anhand der Verteilung der vorherrschenden zytoskelettalen
Proteine – wobei hier vornehmlich Neurofilamente als statische und Mikotubuli und Aktin
als eher dynamische Komponente in den Vordergrund treten – wird der Wachstumskegel in verschiedene
Regionen eingeteilt [15].
In den letzten Jahren sind zahlreiche Substanzen identifiziert worden, welche einen Effekt auf die
Gestalt des Wachstumskegels und das Auswachsen von Neuriten haben. Hier wurde bereits in den
80er Jahren ein Zusammenhang zwischen der Wachstumskegelform und dessen Beweglichkeit gesehen.
Die Arbeitsgruppe um Argiro wies in Studien bei sympathischen Neuronen nach, dass eine
verminderte Größe des Wachstumskegels von einer verlangsamten und reduzierten neuritischen
Extension begleitet ist [1]. Zudem beobachteten Bray & Chapman einen Zusammenhang zwischen
der Anzahl, Zeit und Position des Erscheinens, der Elongationsrate, der lateralen Bewegung, der
Lebensdauer, der Position und der Art und Weise des Verschwindens von Filopodien – oder
Mikrospikes – und einem anschließendem Auswachsen von Wachstumskegeln in sensorischen Spinalganglien
[6]. Im Umkehrschluss könnten also Stoffe, welche einen positiven Effekt auf die Größe
des Wachstumskegels und die Zellprotrusionen haben, auch fördernd auf die Beweglichkeit und
19

Dynamik wirken. Dies könnte also zu einer Veränderung, insbesondere einer Steigerung des Wachstums
führen. Zu diesen Substanzen gehört beispielsweise VEGF, welcher neben seinen Funktionen
im Zusammenhang der Angiogenese auch positive Effekte auf Neurone hat [77]. Eine weitere Substanz
ist Progesteron – vorwiegend als Sexualhormon bekannt – doch zeigen sich auch vermehrt
Funktionen und Wirkungen in und auf das Nervensystem [65].
Die vorliegenden Studien untersuchten mit verschiedenen Techniken die Einflussnahme von VEGF
und Progesteron auf den Wachstumskegel. Während VEGF bereits als wachstumsfördernd beschrieben
wurde, zeigen unsere Ergebnisse erstmals, dass auch Progesteron einen ähnlichen positiven
Effekt hat. Beide Substanzen wirken fördernd auf die Größe und die Beweglichkeit, was durch
die hier präsentierten Lebendzellbeobachtungen primärer Spinalganglienneurone gezeigt werden
konnte. Desweiteren wurden hier die zugrundeliegenden Signalkaskaden identifiziert und die Rezeptorexpression
dargestellt.
4.1 Der Effekt von VEGF auf das Auswachsen von Neuronen und die Form des
Wachstumskegels
In den vergangenen Jahren wurde die Rolle von VEGF im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheitsvorgängen
in diversen klinischen Studien untersucht, allen voran in der Erforschung und Behandlung
von Krebsleiden [14]. Als therapeutischer Ansatz rückten primär die Blockade des Rezeptors
und der folgenden Signalkaskaden in das Zentrum des Interesses, da hierdurch eine vermehrte
(etwa im Falle der Makula‐Degeneration) oder neue Vaskularisation (bei tumorösen Vorgängen)
vermindert werden kann. So wurde etwa der erste humane anti‐VEGF‐A Antikörper „Bevacizumab“
als Inhibitor der Tumorvaskularisation entwickelt [30, 54]. Doch auch im Zusammenhang neurologischer
Komplikationen durch Ischämien wurde VEGF als mögliches therapeutisches Ziel gesehen
[9, 37, 38, 45, 77]. Die Wirkungen von VEGF beschränken sich hierbei jedoch nicht nur auf die Einflussnahme
der Vaskularisation und Angiogenese. Es sind außerdem verschiedene direkte Effekte
auf und im Nervensystem beschrieben. Beispielsweise stimuliert VEGF unterschiedliche neurogene,
protektive und neurotrophe Effekte wie die Förderung der Proliferation und Protektion von Astrozyten
[67, 76], Schwannzellen [64, 70, 71], Mikroglia [25] und kortikalen Neuronen [32]. So ist es
nicht überraschend, dass ein vermehrtes axonales Wachstum nach VEGF‐Applikation sowohl im
zentralen [5, 31, 35, 59] als auch im peripheren Nervensystem [23, 70, 71] gezeigt wurde.
Übereinstimmend mit diesen Studien zeigten auch die Neuriten in den hier präsentierten Experimenten
ein deutlich gesteigertes Wachstum. Sie reichten hunderte von µm in die Peripherie und
auch das Netzwerk war deutlich dichter im Vergleich zu den Kontrollen. Ein gesteigertes axonales
Auswachsen ist auch mit Veränderungen an der äußersten Spitze dieser Axone, den Wachstumskegeln,
assoziiert. Wie in der Literatur beschrieben [23, 42, 74], waren die Veränderungen auch in den
20

hier gezeigten Untersuchungen deutlich festzustellen, da sowohl der Umfang als auch die Fläche
vergrößert waren. Besonderes Interesse galt in den vorliegenden Studien der zytoskelett‐alen Zusammensetzung
des Wachstumskegels und der darauf abzielenden direkten oder indirekten Beeinflussung
durch VEGF oder Progesteron. So konnte erstmals mit hochauflösenden, mikroskopischen
Verfahren gezeigt werden, dass die beobachteten Effekte vornehmlich in der peri‐pheren Zone und
dem Aktinzytoskelett begründet sind. Die durch die massiv gesteigerte Anzahl der Lamellipodia und
Filopodia stark vergrößerte Zelloberfläche spiegelte sich auch in einer ausgedehnteren Fläche und
Ausbreitung der Wachstumskegel wieder. Zudem war das zugrundeliegende Aktinzytoskelett auffällig
verdichtet, die Anzahl der Neurofilamente hingegen blieb etwa gleich. Eine gleichzeitige Stimulation
mit VEGF und NGF führte zu einer Verstärkung dieser Veränderungen, da sowohl das a‐
xonale Auswachsen als auch die Größe der Wachstumskegel noch weiter zunahmen. Diese additive
Wirkung könnte darin begründet liegen, dass der VEGFR‐2 insbesondere von Neuronen exprimiert
wird, welche auch den hochaffinen NGF‐Rezeptor TrkA auf ihrer Zelloberfläche präsentieren
[2, 20, 70].
4.2 VEGF ist ein schnelles Stimulanz des Aktinzytoskeletts im neuronalen Wachstumskegel
Werden nun diese Ergebnisse in Zusammenhang mit Studien gesetzt, welche eine Kohärenz zwischen
der Morphologie und der Motilität sehen [1, 6], liegt die Annahme nahe, dass VEGF auch zu
einer gesteigerten Dynamik führt, besonders da ein vermehrtes neuritisches Auswachsen nachgewiesen
werden konnte. Eine der elementaren Funktionen des Wachstumskegels ist die Aufnahme
und Verarbeitung von Signalen aus seiner Umwelt, auf welche er mit einer Umstrukturierung und
gegebenenfalls Wachstumsänderung reagiert, um das richtige Ziel zu finden. Diese axonale Zielfindung
erfordert eine bis ins kleinste Detail abgestimmte und funktionierende Kooperation verschiedener
Signalstoffe, welche sowohl in löslicher, als auch fester Form zu finden sind. Der Schlüssel
zur korrekten Wegfindung ist hierbei ein feiner Gradient zwischen anziehenden und abstoßenden
Signalen, wobei die Kaskade der zytoskelettalen Anpassungen nicht nur von den jeweils wirkenden
Stoffen, sondern insbesondere von dem im Zellinneren vorherrschenden Signalmilieu abhängig
ist [18, 41].
Der ultimative Effektor all dieser Signale ist das Aktinzytoskelett. Es stellt die Grundlage der Bewegungen
des Wachstumskegels dar und ermöglicht so die dynamischen und schnellen Reaktionen.
Auch wenn beschrieben wurde, dass F‐Aktin nicht notwendigerweise für das Auswachsen vonnöten
ist, so ist es für eine zytoskelettale Antwort auf Leitsignale sowohl in vitro [17, 39, 43], als
auch in vivo [4, 13, 33] unentbehrlich. Damit sich die Membranprotrusionen aktiv vor‐ und zurückschieben
und somit die Umgebung ertasten können, ist ein fein abgestimmtes Zusammenspiel von
21

Polymerisation und Depolymerisation einzelner Aktin‐Einheiten von den Filamenten notwendig.
Eine Erklärung, wie der Wachstumskegel die Aktin‐Dynamiken für seine Vorwärtsbewegungen
nutzt, wurde von Mitchison und Kirschner (1988) in Form der „clutch“‐ oder Griff‐Hypothese vorgestellt
[49]. Diese schlägt vor, dass Rezeptoren an der Zelloberfläche des Wachstumskegels an
adhäsive Substrate binden und so einen Komplex bilden. Dieser wiederum generiert einen
molekularen Griff, welcher filamentöses Aktin verankert und so eine Aktin‐basierte Vorwärtsbewegung
ermöglicht, während der retrograde Aktin‐Fluss inhibiert wird. Bisher sind jedoch nur wenige
Studien mit hochauflösender Bildgebungstechnik der detaillierten zyto‐skelettalen und morphologischen
Umstrukturierung veröffentlicht [10, 11, 15, 16, 44, 72]. Es ist bekannt, dass es nach Applikation
eines Lockstoffes zu einer Ansammlung von Aktin‐Einheiten nahe dem Stimulanz kommt
[44]. Für VEGF wurden ähnliche Effekte – unter anderem in unserer Arbeitsgruppe – beschrieben
[23, 61]. Auch in den vorliegenden Experimenten konnte festgestellt werden, dass dem gerichteten
Auswachsen eine Akkumulation von Aktin‐Einheiten am Ort des späteren Aussprossens voranging.
Diese konnten visualisiert und somit objektiviert werden, indem die primären Spinalganglienneurone
mit RFP‐Aktin (Lifeact, [57]) und GFP‐Neurofilament mikroinjiziert wurden. So wurden dieselben
Wachstumskegel über mehrere Stunden beobachtet, analysiert und vermessen. Auf diese
Weise konnten diese feinen Veränderungen der zytoskelettalen Komponente in eine zeitliche Dimension
eingeordnet werden. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen daher erstmals, dass es sich bei
den Effekten von VEGF auf das Aktinzytoskelett um schnelle und direkte Anpassungen handelt und
der Wachstumskegel somit weitestgehend autonom auf Leitsignale reagiert. Diese Veränderungen
treten schnell ein, bereits innerhalb weniger Minuten sind sie sichtbar. Durch die gleichzeitige
Gabe von VEGF und NGF werden diese noch gesteigert, wobei sich auch hier die Vermutung verstärkt,
dass dies in einer gleichzeitigen Expression des NGF‐Rezeptors TrkA und VEGFR‐2 begründet
liegt [70].
4.3 Der VEGFR‐2 vermittelt die Effekte auf das Aktinzytoskelett
In der Literatur wurde angenommen, dass die Wirkung von VEGF auf das Aktinzytoskelett durch
den VEGFR‐2 vermittelt wird [23, 40]. Unsere Ergebnisse bestätigen diese Annahme, da der spezifische
VEGFR‐2 Inhibitor Axitinib die Effekte komplett blockierte. Axitinib unterbindet die Tyrosinkinase‐Aktivität
des Rezeptors und wird bereits erfolgreich als Mittel der 2. Wahl bei metastasiertem
Nierenzellkarzinom verwendet [19]. Zudem wird eine positive Einflussnahme auf die Verläufe
bei Schilddrüsenkrebs und metastasiertem Brustkrebs berichtet [34]. Einige Signalkaskaden und essenzielle
Signalmoleküle der VEGFR‐2‐vermittelten Wirkungen wurden bereits als wichtige Regulatoren
des neuronalen Wachstumskegels identifiziert, jedoch bleiben viele Details bisher unbe‐
22

kannt [77]. Allgemein spielen die Rho‐Familie der GTPasen und deren Effektoren, die Serin‐/Threonin‐Kinasen,
eine wichtige Rolle im neuronalen Zellwachstum, in der Migration und der Motilität
[31, 58, 75]. Eines der Signalmoleküle von elementarer Wichtigkeit scheint das „cell division control
protein 42“ (Cdc42) zu sein, denn es nimmt Einfluss auf die Aktin‐Dynamiken und daher auch die
Zellbewegungen. Über diverse sekundäre Botenstoffe und Aktin bindenden Proteine kontrolliert
Cdc42 verschiedene Signalkaskaden, beispielsweise über das „heat shock protein 27“ (Hsp27) [46,
60], die „stress activated protein kinase (SAPK)2/p38 [40, 60], das Wiskott‐Aldrich Syndrom Protein
(WASP), die Phosphatidylinositol 3’Kinase (PI3‐K)/Akt [60], die „actin‐related proteins“ (Arp)2/3
[18, 48], den „actin depolymerizin factor“ (ADF)/cofilin [48] und den Signalweg Rho/ROCK [31].
Doch detailliertere Untersuchungen dieser Signalwege und der involvierten Moleküle sind erforderlich,
da derzeit die Verbindungen zwischen diesen Faktoren nicht vollkommen geklärt sind.
4.4 Die Wirkung von Progesteron auf periphere Spinalganglien
Auch Progesteron rückte aufgrund seiner Wirkungen im Nervensystem in den letzten Jahren immer
weiter in den Fokus diverser Arbeitsgruppen. Da hier verschiedene non‐reproduktive, neuroprotektive
und neuroregenerative Effekte im ZNS und PNS beschrieben werden, könnte der Einsatz
von Progesteron neue Möglichkeiten für therapeutische Eingriffe ermöglichen [3, 26, 29, 65].
Vor einigen Jahren wurde zudem beschrieben, dass verschiedene gliale und neuronale Zellen im
zentralen und peripheren Nervensystem steroidogene Enzyme produzieren und Steroide de novo
synthetisieren [47, 63]. Auch sensorische Neurone und Schwannzellen in Spinalganglien exprimieren
diese Enzyme. Hier sind besonders das „cytochrome P450 side‐chain cleavage enzyme“
(P450scc) und die „β‐hydroxysteroid dehydrogenase“ (3β‐HSD) von großer Bedeutung, denn beide
wirken als Schlüsselenzyme in der Steroid‐ bzw. Progesteronsynthese. Da beide Enzyme auch in
peripheren Spinalganglien exprimiert werden, wird angenommen, dass diese in der Lage sind, Progesteron
de novo aus Cholesterol zu bilden [53]. Zudem wurde festgestellt, dass Progesteron deutliche
– primär protektive – Wirkungen im Nervensystem hat. Jedoch mangelt es bisher an Informationen
zu den genauen Effekten exogenen Progesterons im PNS [63]. Der zeitliche Zusammenhang
zwischen wichtigen morphologischen Änderungen in der embryologischen Phase und der endogenen
Produktion von Progesteron deutet auf eine Beteiligung dieses Hormons im physiologischen
Reifungsprozess des PNS hin. Daher lässt sich vermuten, dass Progesteron einen großen
Einfluss auf die axonale Wegfindung und den Wachstumskegel hat.
Der Nachweis des Cytochroms P450scc und der 3β‐HSD in embryologischen Spinalganglien deutet
an, dass hier auch Progesteronsynthese stattfindet und Progesteron auch eine Wirkung auf diese
hat. So zeigen die mit Progesteron behandelten Proben starke strukturelle Unterschiede im Vergleich
zu Kontrollen. Die morphometrischen Untersuchungen zum Neuritenwachstum zeigten ein
23

hoch signifikant gesteigertes Auswachsen und eine Verdichtung des Neuritengeflechts. Zudem ist
in Studien belegt worden, dass eine Inkubation mit Progesteron zu einer gesteigerten Myelinisierung
führt [36]. Unsere Ergebnisse bestärken frühere Hypothesen, dass der Progesteronrezeptor
„progesterone receptor membrane component 1“ (PGRMC1), auch Vema oder 25‐Dx genannt, in
der Regulation der axonalen Zielfindung involviert ist [65]. Die Vermutung liegt nahe, da PGRMC1
eine altersabhängige Expression im Rückenmark zeigt, mit deutlicher Akzentuierung auf das sich
entwickelnde Myelon [62]. Die neuroprotektiven Wirkungen von Progesteron scheinen mit diesem
Rezeptor in Zusammenhang zu stehen, da es zu einer Hochregulation der mRNA und auch des Rezeptors
selbst unter Progesterontherapie bei Rückenmarksverletzungen und Schädel‐Hirn‐Traumata
von Ratten kommt [65]. So stützen auch die Ergebnisse der vorliegenden Studie die Hypothese,
dass Progesteron eine wichtige Rolle in der Formation und Erhaltung neuronaler Schaltkreise
einnimmt.
4.5 Progesteron hat einen direkten und schnellen Effekt auf das Aktinzytoskelett
Als wichtigster Motor und strukturelles Korrelat des Auswachsverhaltens war der Wachstumskegel
Fokus dieser Studie. Hier führte die Progesteronbehandlung zu deutlich vergrößertem Umfang und
Fläche. Da Sexualhormone regulierend auf die Organisation von Geweben wirken – am ehesten
indem sie das Zytoskelett beeinflussen [27] – wurde diese Verbindung in Spinalganglienneuronen
untersucht. Es zeigte sich, dass es charakteristische Änderungen in der zytoskelettalen Komposition
und Verteilung gab. So war die periphere Zone deutlich vergrößert und die Zahl der Lamellipodien
und Filopodien massiv gesteigert. Im Gegensatz dazu schien die Anzahl und Verteilung der Neurofilamente
in der zentralen Region kaum beeinflusst worden zu sein. In Übereinstimmung mit anderen
Studien scheint sich das Aktin‐Neurofilament‐Verhältnis deutlich zugunsten von Aktin zu verlagern
[73]. Dies deutet somit auch hier auf Aktin als Effektor der progesteron‐induzierten Umordnung
hin.
Die Ergebnisse unserer Lebendzellbeobachtungen der mit Progesteron inkubierten Wachstumskegel
legen erneut die Annahme nahe, dass es eine enge Korrelation zwischen vermehrter Größe und
beschleunigten Bewegungen gibt. Alle so behandelten Proben zeigten eine hoch signifikant gesteigerte
Motiliät im Vergleich zu den Kontrollen. Interessanterweise war der Effekt der alleinigen
Progesteronapplikation dabei größer als bei einer gleichzeitigen Behandlung von Progesteron
und NGF. Hierbei ist die Tatsache, dass es keinen additiven Effekt dieser beiden Substanzen gibt,
erstaunlich. Da die alleinige Behandlung mit NGF oder Progesteron zu ähnlichen Ergebnissen führt,
ist die These, dass es eine direkte Verbindung beider gibt, anzunehmen. Tatsächlich wurde eine
Hochregulation der NGF‐Rezeptoren TrkA und p75 NTR nach Injektion mit Progesteron beschrieben
[27]. Es ist also denkbar, dass sich die Empfindlichkeit des Wachstumskegels für NGF und somit
24

dessen positive Wirkung auf die Größe steigern lässt. Zudem scheint eine Unterform des PGRMC1,
Vema/VEM1, in der axonalen Zielfindung beteiligt zu sein, indem hierüber die Verfügbarkeit von
Wegleitungsrezeptoren reguliert wird [17, 65], wie möglicherweise auch von NGF‐Rezeptoren. In
dieser Studie konnte jedoch kein additiver Effekt festgestellt werden, obwohl die Morphologie nach
singulärer Behandlung mit NGF und Progesteron ähnlich war, wobei Behandlungen mit NGF eher
zu einer höheren Anzahl von Filopodien führte und Progesteron eine zumeist durch Lamellipodien
gekennzeichnete Morphologie generierte. Deswegen ist ein gemeinsamer, bislang unbekannter
Signalmechanismus von NGF und Progesteron wahrscheinlich.
4.6 Die Effekte von Progesteron werden durch Mifepriston inhibiert
Die Identifizierung dieser Signalwege war der nächste Punkt unserer Studie. Es ist bekannt, dass
sowohl die mRNA der klassischen Progesteronrezeptoren (PR‐A und PR–B), als auch der PGRMC1
in Spinalganglien exprimiert werden. Eine Blockade von PR‐A und PR–B mit dem spezifischen Blocker
Mifepriston führte unter Progesterongabe zu einem neuritischen Auswachsen vergleichbar mit
den Kontrollen. Daher liegt es nahe, dass die beobachteten Effekte von Progesteron durch diese
Rezeptoren vermittelt werden.
Diese klassischen Progesteronrezeptoren sind Transkriptionsfaktoren, welche durch die Bindung
von Progesteron aktiviert werden. Sie sind insbesondere im Soma präsent, wo sie an Chaperone
gebunden vorliegen. Nach der Bindung von Progesteron ändern sie ihre Form, dissoziieren von den
Chaperonen, dimerisieren und wandern in den Zellkern. Hier bindet der PR‐Komplex an das spezifische
„progesterone response element“ (PRE), welches die Transkription verschiedenster mRNA
reguliert [4, 13]. Bisher sind jedoch nur wenige Informationen über einen Zusammenhang zwischen
diesem genomischen Aktivierungsweg und morphologischen Änderungen nach Progesteroninkubation
bekannt. Eine Möglichkeit besteht in einer gesteigerten Produktion von Aktinmonomeren,
welche anschließend in den Wachstumskegel transportiert werden. Okabe und Hirokawa beschrieben
bereits 1991 [50], dass ein anterograder Fluss von Aktinmonomeren die Polymerisation von
Aktin im Wachstumskegel steigert [33]. Auch Progesteron könnte die Synthese von β‐Aktin
durch seine Funktion als Transkriptionsfaktor steigern. Dieses Modell erklärt jedoch nicht die
schnellen Umstrukturierungen nach Progesteronapplikation. Hierfür muss sehr wahrscheinlich ein
anderer Signalweg verantwortlich sein, unabhängig von Zellkern‐involvierenden Vorgängen wie einer
Proteinbiosynthese. Die schnellen, non‐genomischen Signalwege wurden auch für Progesteronrezeptoren
beschrieben, die direkt Kinase‐Kaskaden im Zytoplasma aktivieren [11, 13, 72]. Diese
Kinasen regulieren verschiedene molekulare Kaskaden, etwa über G‐Proteine wie die Rho‐Familie
der GTPasen, Tyrosinkinasen und c‐Scr, welche wiederum über die Regulierung von verschiedenen
25

ABP direkt auf die Reorganisation des Aktinzytoskeletts wirken und somit die Zellmotilität beeinflussen
[11]. Daher liegt die Annahme nahe, dass Progesteronrezeptoren nicht nur über die vielfach
beschriebenen genomischen Mechanismen wirken, sondern alternative Wege aktivieren, welche
keine Modulation der Proteinsynthese benötigen und somit für die schnellen Umstrukturierungen
im Wachstumskegel nach Progesteronapplikation verantwortlich sind.
Die vorliegende Studie untersucht erstmals mit Hilfe der hochauflösenden Lebendzellmikroskopie
die Wirkungen von VEGF und Progesteron auf periphere Neurone. Eine Behandlung mit diesen Substanzen
führt zu einem signifikant gesteigerten axonalen Auswachsen, begleitet von einer Vergrößerung
der Wachstumskegel. Auch die Motilität ist signifikant gesteigert, in beiden Fällen lassen
sich schon nach wenigen Minuten Änderungen feststellen. Zudem konnte der VEGFR‐2 als der Mediator
der Effekte von VEGF und die klassischen Progesteronrezeptoren als Vermittler der durch
Progesteron hervorgerufenen Änderungen auf die Neurone und deren Zytoskelett identifiziert werden.
Des Weiteren konnte mit den vorliegenden Studien erstmals nachweisen werden, dass es einen
direkten Effekt von VEGF und Progesteron auf das Aktinzytoskelett des neuronalen Wachstumskegels
gibt.
Als Teil der Grundlagenforschung bringen diese Ergebnisse wichtige neue Erkenntnisse zu den molekularen
und zellulären Grundlagen des neuronalen Wachstumskegels. Sie können so dazu beitragen,
neue Ausgangspunkte für neue VEGF‐ und/oder progesteronvermittelte thera‐peutische Ansätze
in der Behandlung von Missbildungen, Verletzungen und Erkrankungen des peripheren Nervensystems
zu finden.
Teile dieser Promotionsarbeit sind bereits im Rahmen einer Erstautorenschaft unter dem Titel „Fast
rearrangement of the neuronal growth cone's actin cytoskeleton following VEGF stimulation“
in der Zeitschrift Histochemistry & Cell Biology (IF 2.61) und einer geteilten Erstautorenschaft unter
dem Titel „Rapid impact of progesterone on the neuronal growth cone“ in der Zeitschrift Endocrinology
(IF 4.717) veröffentlicht.
26

V
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31

VI
Anhang
Abb. A1. Auspflanzung und Präparation der primären Spinalganglienkulturen
(a) Unter sterilen Bedingungen wird nach Dekapitation die Wirbelsäule der 10 Tage alten Hühnerembryos
freipräpariert. (b) Die Feinpräpartation der Ganglien wird unter Zuhilfenahme eines binokularen Mikroskops
durchgeführt.
Abb. A2 Mikroinjektion
(a) Mikroinjektionsarbeitsplatz, (b) konfokales Laserscanningmikroskop, (c) mikroinjizierte Spinalganglienkultur
zur Darstellung der typischen Verteilung zytoskelettaler Proteine in den Neuronen. Neurofilament ist grün
fluoreszierend markiert, Aktin rotfluoreszierend, die Zellkernfärbung erfolgte mit Dapi.
32

Abb. A3 Lebendzellbeobachtung eines VEGF‐behandelten, mikroinjizierten Wachstumskegels
Über mehrere Stunden hinweg zeigen sich die Wachstumskegel agil und tasten die Umgebung kontant ab.
Besonders die mit VEGF‐inkubierten Proben zeigten vermehrt ein gerichtetes Auswachsen.
33

Abb. A4 Schematische Darstellung intrazellulären Signalkaskaden von VEGF und Progesteron
34

Danksagung
Diese Dissertation wäre ohne die Hilfe zahlreicher Hände und Mitwirkenden nicht möglich
gewesen. Für die Möglichkeit dieser Promotion und die kontinuierliche Unterstützung während
aller Abschnitte der Arbeit möchte ich mich zu allererst bei meinem Doktorvater PD
Dr. Carsten Theiß bedanken. Sowohl die persönliche, als auch die fachliche Betreuung auch
über die „Durststrecken“ hätte ich mir nicht besser wünschen können. Danke für die wunderbare
Zeit, für die ansteckende Begeisterung und Motivation, die unerschöpfliche Hilfe,
die konstruktive Kritik und die vielen lustigen und inspirierenden Momente.
Für die finanzielle Unterstützung von Mai 2011 bis Mai 2013 im Rahmen eines Promo‐tionsstipendiums
bedanke ich mich bei der Heinrich und Alma Vogelsang Stiftung.
Im Labor wäre ich ohne die Hilfe von Frau C. Grzelak, Frau A. Lodwig, Frau B. Menzel und
Frau H.‐T. Nguyen nicht weit gekommen, vielen Dank für die unschätzbare Hilfe bei der
Bewältigung der unterschiedlichen Methoden, den vielen hilfreichen Tipps und allen voran
der netten Zeit. Zudem danke ich Frau A. Conrad und Frau A. Lenz für die gute
Zusammenarbeit
und die Unterstützung bei der Büroarbeit.
Ein weiteres großes Dankeschön möchte ich zudem an Frau Prof. Brand‐Saberi für die vielen
Anregungen, Hilfestellungen und Unterstützung richten. Für die hervorragende Zusammenarbeit
danke ich desweiteren Herr PhD A. Balakrishnan‐Renuka, Frau M. Böing, Dr. D
Föhring, Dr. P. Happel, M. Lever, M. Masyuk und besonders L. Wessel und R. Wüstefeld.
Schließlich möchte ich mich bei meiner Familie von Herzen bedanken, welche mich nicht
nur während dieser Arbeit, sondern ein Leben lang getragen und unterstützt haben. Danke
für die Hilfe bei den gefühlt unzähligen Korrekturen und Layoutfragen – aber vor allem,
dass ich immer auf Euch zählen kann!

Lebenslauf
geboren am 1. November 1985 in Duisburg, Deutschland
Beruflicher Werdegang
seit 01/2014
Ärztin in Weiterbildung in der Klinik für Allgemeine Pädiatrie, Neonatologie
und Kinderkardiologie am Universitätsklinikum Düsseldorf
Studienverlauf
11/2013
08/2012
08/2008
seit 2006
2005
2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung (2,0)
Beginn des Praktischen Jahres
‐ 1. Tertial Innere Medizin (Prosper Hospital Recklinghausen)
‐ 2. Tertial Chirurgie (Red Cross Children’s Hospital, Kapstadt, Südafrika)
‐ 3. Tertial Pädiatrie (Korle Bu Teaching Hospital, Accra, Ghana)
(beide ermöglicht durch ein PROMOS‐Stipendium)
1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung (2,5)
Studium der Humanmedizin an der Ruhr‐Universität Bochum
Abitur (1,3)
Promotion
08/10‐01/14
05/11‐05/13
Experimentelle Dissertationsarbeit zum Thema „Hochauflösende Lebendzellbeobachtungen
des Aktinzytoskelettes des neuronalen Wachstumskegels – der Einfluss
von VEGF und Progesteron im peripheren Nervensystem“ unter Leitung von
Prof. Dr. Carsten Theiß, Abteilung für Cytologie, Medizinische Fakultät der Ruhr Universität
Bochum. Prüfung: 28.04.2015
Promotionsstipendium der Heinrich und Alma Vogelsang Stiftung
Wissenschaftliche Tätigkeiten
12/14
08/2013
09/2012
03/2012
11/2011
09/2011
Wessel, L, Olbrich L, Brand‐Saberi B, Theiss C (2014).New aspects of progesterone
interactions with the actin cytoskeleton and neurosteroidogenesis in the cerebellum
and the neuronal growth cone. Histochemistry & Cell Biology, 62(12):835‐45.
doi: 10.1369/0022155414550691 IF: 2.927
Olbrich L, Wessel L, Balakrishnan‐Rnuka A, Brand‐Saberi B, Theiss C (2013). Fast impact
of progesterone on the neuronal growth cone. Endocrinology, 154(10):3784‐
3795. DOI: 10.1210/en.2013‐1175 IF: 4.717
Olbrich L, Foehring D, Happel P, Brand‐Saberi B, Theiss C (2013). Fast rearrangement
of the neuronal growth cone's actin cytoskeleton following VEGF stimulation.
Histochemistry & Cell Biology, 139(3):431‐445. IF: 2.927
Vortrag zum Thema der Dissertation auf der 29. Arbeitstagung der Anatomischen
Gesellschaft Würzburg
Posterpräsentation auf dem Jahrestreffen der Anatomischen Gesellschaft in Frankfurt
a.M.
Teilnahme an der FoRUM‐Tagung der medizinischen Fakultät der Ruhr Universität
Bochum mit Posterpräsentation (1. Posterpreis)

03/2011 Teilnahme an der Arbeitstagung der Anatomischen Gesellschaft Würzburg mit Posterpräsentation
Teilnahme an der Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Zellbiologie (Bonn)
mit Posterpräsentation
Famulaturen
09/2011
04‐05/2010
03/2010
08/2009
03/2009
Famulatur in Bethesda‐Krankenhaus, Duisburg (Anästhesie)
Famulatur auf dem Krankenhausschiff der Universidade Federal do Pará, Brasilien
(Reiseförderung von Medizinernachwuchs.de)
Famulatur im Universitätsklinikum von Santa Catarina, Brasilien (Gynäkologie)
Famulatur im Herz‐ und Diabeteszentrum NRW Bad Oeynhausen (Pädiatrie/Kinderkardiologie)
Famulatur in der „Gemeinschaftspraxis Kokorsch, Zurhelle, Jostkleigrewe“, Duisburg
(Allgemeinmedizin)
Besondere Kenntnisse & Soziales Engagement
Sprachen
Studierenden‐initiativen
Auslandsaufenthalte
Weiterbildung Internationale
Gesundheit
Englisch, Portugiesisch und Französisch
(Gründungs‐)Mitglied der Studierendeninitiative globalegesundheit (seit 2009)
Aufbau und Leitung der You‐Manity‐Gruppe der Medizinischen Fakultät der
Ruhr Universität Bochum (seit 2009)
Referentin beim TriKont‐Seminar (Veranstalter bvmd e.V.), Leipzig (12/2010)
Teilnahme an der Generalversammlung der IFMSA (International Federation of
Medical Students Associations) als Delegierte für das deutsche „Standing Comitee
on Public Health“ in Accra, Ghana (03/2012)
Mitarbeit im „Binde Rural Hospital“, Ghana (03/2012)
Teilnahme am internationalen Studentenfestival ISFiT, Trondheim, Norwegen,
zum Thema Global Health (02/2011)
Mitarbeit im Projekt „Nova Vida“ Crato, Brasilien (Tätigkeit v.a. im Bereich der
Gesundheitsbildung von Kindern und Jugendlichen) (07‐08/2009)
Soziales Praktikum im Kinderdorf „Cidade da Crianca“, Simões Filho, Brasilien
09/05‐03/06)
Teilnahme am X., XI., XII., XIII. und XIV. Humanitären Kongress (10/2009,
10/2010, 10/2011, 10/2012, 10/2013), Berlin (Veranstalter: Ärzte ohne Grenzen
e.V.)
Teilnahme an der 29. Jahrestagung der Arbeitsgemeinschaft Tropenpädiatrie,
Hamburg
Teilnahme an der XII. Sommerakademie „Globale Gesundheit“, Würzburg (Veranstalter:
Missionsärztliches Institut Würzburg)
Teilnahme an der Konferenz „Global – Gerecht – Gesund“, Berlin (Veranstalter:
Gesundheit Berlin‐Brandenburg und medico international)

Die Dissertation basiert auf folgenden Publikationen:
Wessel, L, Olbrich L, Brand‐Saberi B, Theiss C (2014).New aspects of progesterone interactions
with the actin cytoskeleton and neurosteroidogenesis in the cerebellum and the
neuronal growth cone. Histochemistry & Cell Biology, 62(12):835‐45. doi:
10.1369/0022155414550691
IF: 2.927
Olbrich L, Wessel L, Balakrishnan‐Rnuka A, Brand‐Saberi B, Theiss C (2013). Fast impact of
progesterone on the neuronal growth cone. Endocrinology, 154(10):3784‐3795. DOI:
10.1210/en.2013‐1175
IF: 4.717
Olbrich L, Foehring D, Happel P, Brand‐Saberi B, Theiss C (2013). Fast rearrangement of
the neuronal growth cone's actin cytoskeleton following VEGF stimulation. Histochemistry
& Cell Biology, 139(3):431‐445.
IF: 2.927