NanoPhotometer NP80

Special: Synthetische Biologie & Biotechnologie
& Biotechnologie
Illustr: techNyouvids
men, der spezifisch in Astrozyten gehemmt
wird. Dann leuchten alle Zellen außer den
Astrozyten. In diesem Fall hat man eine
NICHT-Bedingung implementiert: Falls
der Astrozytenmarker NICHT vorhanden
ist, dann produziere GFP.
Bei solchen Booleschen Funktionen
spricht man auch von Logikgattern, und
diese kann man weiter ausbauen: Falls
Signal A UND Signal B vorhanden sind,
dann produziere GFP. Signal A könnte
ein Transkriptions-Aktivator sein, der
sich nur in Gegenwart eines Chaperons
korrekt faltet und andernfalls nicht funktioniert.
Das Chaperon wäre dann Signal
B. Und nur wenn Aktivator und Chaperon
gleichzeitig vorhanden sind, produziert
die Zelle GFP.
Man kann mehrere solcher Systeme
hintereinanderschalten, indem
zum Beispiel der generierte Output
wieder als Input für das nächste molekulare
Logikgatter dient. Idealerweise
hat man einen modularen Baukasten,
um sich beliebig komplexe Verrechnungseinheiten
zu konstruieren. Upstream der
Recheneinheit braucht man Sensoren, die
Eingangssignale in die Sprache der Verrechnungseinheit
übersetzen – Transkriptionsfaktoren
oder auch regulatorische
RNAs. Downstream gibt es ein oder mehrere
Ausgangssignale, wie ein Fluoreszenzsignal
oder ein bestimmtes Verhalten der
Zelle. (Anschauliche Beispiele für solche
molekularen Logikgatter bietet ein Review
von Jennifer Brophy und Christopher Voigt:
Nat Methods 11(5): 508-20).
Ein genetischer Schaltkreis kann auch
Information speichern. Timothy Gardner
et al. stellten bereits 1999 einen einfachen
Schalter für E. coli vor, den man mit einem
kurzen Signal dauerhaft in die eine oder
andere Richtung kippen kann (Nature
403: 339-42). Auf einem Plasmid liegt eine
Prinzip eines genetischen Kippschalters:
Tetracyclin schaltet die Fluoreszenz über GFP ein,
IPTG schaltet sie wieder ab.
kodierende Sequenz für den Tet-Repressor
(TetR). Davor ein Promotor, der vom
Lac-Repressor (LacI) abgeschaltet werden
kann. Kommt es zur TetR-Expression, dann
blockiert TetR wiederum den Promotor, der
direkt vor der LacI-Sequenz liegt. Somit
wird klar: Die E. colis können nicht gleichzeitig
LacI und TetR produzieren, weil beide
Repressoren ihre Expression gegenseitig
hemmen.
Nicht ganz dicht
Allerdings kann man zwischen beiden
Zuständen hin und her schalten. Gibt
Illustr: Mario Rembold
man nämlich IPTG zu, dann blockiert
man das LacI-Protein und schaltet somit
auf TetR um. Und die Repressorwirkung
des TetR-Proteins wiederum lässt sich mit
Tetracyclin abschalten. Als Reporter nahmen
die Autoren damals GFP hinter dem
Promotor, der auch die LacI-Expression
steuert. Dann schaltet Tetracyclin die
Fluoreszenz ein, IPTG schaltet sie wieder
aus. Wichtig hierbei ist, dass IPTG
oder Tetracyclin nicht dauerhaft im
Medium enthalten sein müssen. Es ist
jeweils nur ein kurzer Puls notwendig,
um den Schalter zu kippen. Dann bleibt
das System stabil und merkt sich die Einstellung.
Zumindest theoretisch.
In der Realität sind Promotoren aber
häufig „undicht“. Das stellten Tom Ellis
und seine Kollegen fest, als sie 2009
erwähnten TetR/LacI-Schalter in der
Bäckerhefe implementierten (Nat Biotechnol
27(5): 465-71). Denn bei diesem
Konstrukt war LacI nicht in der Lage, die
TetR-Expression vollständig zu blockieren.
Daher kippt der Schalter allmählich
zurück zur TetR-Einstellung. „Undichte
Promotoren sind häufig problematisch in
der synthetischen Biologie“, resümiert Tom
Ellis, der heute am Imperial College London
forscht. „Es ist ziemlich schwer, einen vollständigen
Off-Promotor mit null Prozent
Expression zu bekommen.“
Kurzerhand haben Ellis und Kollegen
aus dem Bug ein Feature gemacht: „Wir
nutzen das als Timer“, erklärt er. Mit einer
Tetracyclin-Gabe startet man die molekulare
Zeitschaltuhr. Die Hefezellen produzieren
jetzt mehrere Stunden lang viel LacI
und wenig TetR. Innerhalb von ein bis zwei
Laborjournal
4/2016
33