NanoPhotometer NP80

Special: Synthetische Biologie & Biotechnologie
Andere Arbeitsgruppen, etwa diejenigen
um George Church oder Farren Isaacs
(Harvard bzw. Yale University), versuchten,
durch genetische Manipulation allen 321
UAG-Stop-Codons in E. coli eine neue Bedeutung
zu verleihen, indem sie diese in
UAA Stop-Codons umwandelten. Allerhand
genetische Kunstgriffe waren nötig, aber es
gelang ihnen: Am Ende war das einstmalige
Nonsense-Codon UAG damit frei für
die Translation neuer Aminosäuren. Damit
war theoretisch gezeigt, dass man Codons
re-codieren kann – zumindest solange man
nur an der dritten Base des Codons herumschraubt
und an dessen Bedeutung nichts
verändert.
Ungleich schwieriger erscheint es,
Sense- Codons mit neuen Funktionen zu belegen,
denn damit werden Veränderungen
in der Proteinstruktur und -faltung sowie
vermutlich auch die Translationseffizienz
und -genauigkeit beeinflusst.
Das alles hat somit Auswirkungen
auf die Proteinfunktion
und kann folglich die
Fitness der Bakterien verändern.
Um das auszutesten,
kreierte das Church-Team ein
richtig ambitioniertes Experiment.
Sie wollten gleich 13
seltene DNA-Tripletts in allen
ribosomalen – und damit
absolut essentiellen – Genen
neu codieren. Vorsichtshalber
sollten dabei die Identitäten
der codierten Aminosäuren
unverändert bleiben, also nur
die Nukleotid- und nicht die
Proteinsequenzen verändern werden. Das
Experiment gelang – die Veränderungen
wurden aber dennoch von Fitness-Einbußen
begleitet. Man kann also theoretisch
nicht vorhersagen, wie sich Umdeutungen
von Sense-Codons konkret auf den Organismus
auswirken. Die Forscher zogen
daraus den Schluss, künftig nur noch gezielt
spezielle Codons zu ändern und dabei
auf normales Wachstum zu selektieren
(Science 2014, 342: 357 und 361). Von
Proteom-übergreifender Re-Codierung war
also keine Rede.
Code für neue Aminosäure
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Illustr.: TU Berlin / AK Biokatalyse
Dennoch ließ Budisa diese Idee nicht
fallen. Sein Plan war, eine Aminosäure im
gesamten Genom zu re-codieren. Er wählte
das DNA-Triplett TTG aus. Das eher seltene
Codon kommt 20.699-mal im E. coli Genom
vor und steht für Tryptophan. Diese
Aminosäure sollte durch das sterisch sehr
ähnliche ß-(Thieno[3,2-b]pyrroll)alanin,
kurz [3,2]Tpa ersetzt werden, welches sich
von Tryptophan nur darin unterscheidet,
dass es statt des Benzolrings einen Thiophenring
(5er-Ring mit Schwefel atom)
enthält. In Vorversuchen – noch im Labor
von Nobelpreisträger Robert Huber am
Max-Planck-Institut für Biochemie in Martinsried
– hatte er gezeigt, dass die Tryptophanyl-rRNA-Sythetase
aus E. coli [3,2]Tpa
als Ersatz akzeptiert.
Allerdings wollte Budisa die Proteom-
Re-Codierung nicht durch aufwändige genetische
Manipulationen à la Church und
Isaacs erreichen, sondern er setzte auf die
enorme Kraft der Evolution durch natürliche
Selektion. Zuerst mussten Budisa und
Co. dafür sorgen, dass ihre kommerziellen
Medien tatsächlich hundertprozentig frei
waren von Tryptophan-Spuren, oder von
Resten der Vorstufe Indol. Also pipettierten
seine Mitarbeiter sich selber ein Medium
zusammen, das so genannte New Minimal
Nach 1.000 bis 2.000 Generationen
nahmen die Bakterien [3,2]Tpa anstelle von Tryptophan.
Medium (NMM). Es enthält 19 Aminosäuren,
Salze, Zucker, Spurenelemente,
allesamt biotechnisch oder chemisch synthetisiert
(Eur. J. Biochem. 230: 788).
Diesem Medium setzten sie zu Beginn
des Experiments Indol zu, denn ohne diesen
Baustein wuchsen die Bakterien überhaupt
nicht. Außerdem war eine konstante
Menge Thienopyrrol im Medium. An diese
heterozyklische Verbindung kann das Bakterium
Alanin anhängen und dadurch [3,2]
Tpa herstellen. Indol gelangt durch aktiven
Transport in die Zellen, das Thienopyrrol
durch Diffusion. Durch schrittweise Senkung
der Indol-Konzentration während der
sukzessiven Kultur wurden die Bakterien
zunehmend unabhängig von Indol und
verwendeten den Ersatzstoff. Schon nach
164 Kulturtagen (entspricht 106 Passagierungen)
war es soweit: die Organismen
brauchten kein Tryptophan mehr. Danach
ließen die Berliner nach und nach auch
alle nicht-essentiellen, natürlichen Aminosäuren
weg. Nach insgesamt nur 264
Passagierungen und 506 Tagen hatten sie
eine Kultur, die in Minimalmedium recht
gut wachsen konnte.
Während dieser Zeit hatten Budisa und
Co. natürlich verschiedene Proben gezogen
– und nun stellte sich die Frage: Waren
wirklich im gesamten Proteom alle Tryptophane
durch [3,2]Tpa ersetzt worden?
Zum Nachweis waren Massenspektrometrie
und Gaschromatographie angesagt.
„Ich habe zwei Arbeitsgruppen um diese
Analysen gebeten. Die wussten erst einmal
nichts voneinander – und als sie es erfahren
haben, waren sie ein bisschen sauer mit
mir. Aber ich wollte wirklich zwei völlig
unabhängige Expertisen haben“, erzählt
Budisa gut gelaunt. Na ja – wer in seiner
Freizeit boxt, den können Wortgefechte
wohl nicht wirklich erschüttern.
Das Ergebnis der doppelten Analyse:
Im zuletzt verwendeten Minimalmedium
war kein Tryptophan nachweisbar (!), in
der am längsten evolvierten
Kultur fand die Massenspektrometrie
(MS/MS) noch 0,5
± 0,8 %, die aber in der
Gaschromatographie nicht
auftauchten. Umgekehrt
ersetzte nach MS/MS-Analyse
[3,2]Tpa 99,5 ± 0,8 %
aller Tryptophanpositionen
im Proteom. Da die 0,5%
Tryptophan im Rahmen der
Fehlergrenzen lagen „[…]
demonstrieren diese GC/
MS-Analysen im Rahmen des
Detektionslimits unserer Methode
und der verwendeten
Messgeräte das vollständige
Fehlen von Trp im Proteom der evolvierten
Stämme“ – so die Schlussfolgerung der
Forscher in ihrem Paper, das sie übrigens
nicht wie die US-Kollegen bei einem der
Glamour-Journals einreichten, sondern in
dem weniger bekannten Blatt Angewandte
Chemie (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2015,
127: 10168). Warum das? „Die Konkurrenz
ist sehr schlagkräftig. Wir wollten daher
schlichtweg schnell sein und nicht riskieren,
dass uns jemand zuvor kommt“, erklärt
Budisa. „Angewandte Chemie hat nur drei
Monate für den Review-Prozess benötigt.“
Der Hobbyboxer weiß eben, dass Schnelligkeit
nicht nur im Ring zählt. Die Strategie
war völlig richtig, denn bereits Anfang
2015 publizierten die zwei Gruppen um
Isaacs und Church die zumindest teilweise
Re-Codierung von Sense-Codons zu künstlichen
Aminosäuren (ACS Synth. Biol. 2016,
5: 163-71, Nature 2015, 518: 55).
Sehr wahrscheinlich sammelten die
Bakterien kompensatorische Mutationen
ein, um letztlich auf Tryptophan verzichten
zu können. Und welche? „Na, was vermuten
4/2016 Laborjournal