Grundstudium Biologie Grundkurs V

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28 Im geschlossenem System durchlaufen die Kulturen aufgrund der sich ständig ändernden Bedingungen verschiedene Phasen. Nach dem Beimpfen können die Organismen im Prinzip gleich mit der maximalen Rate wachsen (exponentielle oder auch logarithmische Phase). Voraussetzung hierfür ist, dass sie in ihrem Stoffwechsel auf eine optimale Verwertung der Nährstoffe eingestellt sind. Sie wachsen mit dieser maximalen Rate solange, bis die Konzentration einer begrenzt vorhandenen Komponente des Mediums (dies wird in erster Linie das Substrat sein) auf limitierende Werte absinkt, so daß das Wachstum der Kultur ausklingt. Verbunden damit wird zunächst die Wachstumsrate geringer (Verzögerungsphase) bis das Wachstum letztlich ganz zum Stillstand kommt (stationäre Phase). Auch die Bildung von Stoffwechsel-Endprodukten kann über eine Hemmung zum Stillstand des Wachstums führen (z. B. Änderung des pH-Wertes bei der Produktion von Säuren). Werden Zellen aus suboptimalen Wachstumsverhältnissen als Impfmaterial in frisches Medium übertragen, so sind sie zunächst nicht gleich auf die günstigeren Bedingungen eingestellt. Die Adaptation an das frische Medium erfolgt dann in einer ersten Phase, die noch kein Wachstum erkennen lässt ("lag"-Phase). Anschließend (Anlaufphase) wird die Wachstumsrate bis zu ihrem maximalen Wert (exponentielle Phase, s.o.) gesteigert. Lag- und Anlaufphase können auch auftreten, wenn die Komposition des Mediums geändert wird. Wachstumsprozesse gehorchen Exponentialfunktionen. Deren graphische Darstellung wird in halblogarithmischem Maßstab überschaubar. Zum einen wird in dieser Auftragung der Übergang zwischen verschiedenen Wachstumsphasen deutlicher und zum anderen lässt sich die maximale Wachstumsrate (µ max ) aus der Steigung des Geradenbereichs ablesen. Messung der Biomasse Eine Reihe von Methoden steht dem Experimentator zur Verfügung, um die Biomasse direkt oder indirekt zu quantifizieren. Zu den direkten Methoden gehören die Ermittlung von Trockengewicht, Zellprotein oder des Gesamtstickstoffs der Biomasse einer Kultur. Zur routinemäßigen Bestimmung der Biomasse hat sich als indirekte Methode die Messung optischer Eigenschaften einer Population bewährt. Dabei wird die in der Mikrobiologie übliche optische Dichte (O.D.) der Suspension in einem Wellenlängenbereich des Spektrums gemessen, in dem keine Pigmente der Bakterien absorbieren. Damit ist gewährleistet, dass in erster Linie die Lichtstreuung an den Zellen in die Messung eingeht. Aufgaben: Bestimmen Sie mit den unten aufgeführten Kulturen von Escherichia coli: a) die Wachstumsrate (µ) b) die Verdopplungszeit (td ) und c) gegebenenfalls die Zeit vom Animpfen bis zum Erreichen der exponentiellen Phase Vorsicht ! Escherichia coli ist im Prinzip kein pathogener Organismus. Dies bedeutet jedoch nicht, dass mit ihm sorglos umgegangen werden kann; denn ein Auftreten in größeren Mengen kann, z.B. über Hautverletzungen auch zur Infektion führen. Es gilt das grundsätzliche Gebot des sauberen Arbeitens in der Mikrobiologie.
Vers. VI.1: Material: - Schüttelwasserbäder: mindestens 2 Stück pro Kurs - Eppendorf oder vergleichbares Photometer: 2 Stück plus Filter - Erlenmeyerkolben (300 ml, 1 Stück pro Gruppe), die in Einsätze für Wasserbäder passen - sterile Pasteurpipetten (lange Spitze) in Pipetten-Dose: (10 Pip. und 1 Dose pro Gruppe) - Einmal-Küvetten, 1,0 cm, halbmikro (1 Stück pro Gruppe) - Gefäß für gebrauchte Pipetten - Desinfektionslösung (Sterillium) - Nährmedien in Kolben (alternativ können den Kursteilnehmern gleich die mit den richtigen Mengen an Nährlösung gefüllten Kulturkolben vorbereitet werden) - 3 Eisbäder, Gummihütchen zum Pipettieren, 5 Reagenzröhrchen, Log-Papier - 2 Stationen zum Animpfen der Kulturen: mit je 1 Übernacht-Kultur und sterilen 10 ml Pipetten - Taschenrechner ( bitte mitbringen !) Durchführung: Jede Gruppe bearbeitet jeweils eine Kultur mit Zellen von Escherichia coli, die in Voll- Medium als Schüttelkultur (= gute Belüftung) entweder bei 37 °C ( optimale Wachstumstem- peratur; gerade Gruppen-Nr.) oder bei 27 °C ( suboptimale Wachstumstemperatur; ungerade Gruppen-Nr.) wachsen. Die Anzucht erfolgt in 300 ml Erlenmeyerkolben, das Kulturvolumen beträgt 100 ml. Um gutes Wachstum zu erhalten, sollten die Kulturen mit einer O.D. 623 von 0.05 - 0.1 (Messung in Halbmikro-Küvetten, 1,0 cm Strahlengang) angeimpft werden. Probennahme mit sterilen Pasteurpipetten: ca. 3/4 gefüllt, in Abständen von 20 min (Zeiten ge- nau protokollieren!). Sollte die Messung nicht sofort nach der Probenahme durchführbar sein: Proben im Eisbad rasch abkühlen und dort bis zur Messung aufbewahren. Vor der Messung die Proben kurz auf- schütteln, dabei jedoch Schaum- oder Bläschenbildung vermeiden! Ab einem O.D.-Wert von 0,5 muss die Probe vor der O.D.-Bestimmung mit Medium verdünnt werden, damit die Mes- sung weiterhin im linearen Bereich erfolgen kann. Tragen Sie die Messwerte in halblogarithmischem Maßstab gegen die jeweilige Kulturdauer auf und berechnen Sie die gewünschten Werte. 29
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