Grundstudium Biologie Grundkurs V

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I. KURS: ANREICHERUNGSKULTUREN; STERILISATIONSVERFAHREN Wie unter allen Lebewesen, so gibt es auch unter den Mikroorganismen anspruchsvolle und weniger anspruchsvolle Formen, - Spezialisten und Organismen mit weniger ausgeprägten Eigenschaften. Entsprechend lassen sich Mikroorganismen durch die Wahl der Kulturmethoden selektiv anreichern. Anreicherungskulturen dienen zur Gewinnung von Reinkulturen. Das Vorliegen von Reinkulturen aber ist im allgemeinen die grundlegende Voraussetzung für wissenschaftliche Untersuchungen an Mikroorganismen sowie für die medizinische, Lebensmittel-mikrobiologische und ökologische Diagnostik. Da Mikroorganismen definitionsgemäß < 1mm groß sind, lassen sie sich im allgemeinen erst dann feststellen, wenn sie bereits in größeren Mengen vorliegen. Für die Haltung von Reinkulturen ist es deshalb notwendig, dass rechtzeitig der Befall mit Fremdkeimen (Kontaminanten) verhindert wird. Hierzu sind sterile Arbeitstechniken erforderlich, die sowohl die Sterilisation der Nährmedien und der für die Kultur erforderlichen Gerätschaften als auch die Technik der Weiterführung von Reinkulturen (Umfüllen von Nährmedien und deren Beimpfung) umfassen. Der erste Kurstag soll die Studierenden mit grundlegenden Techniken des sterilen Arbeitens vertraut machen. Über geeignete Versuche soll verdeutlicht werden, weshalb bestimmte Sterilisationsbedingungen einzuhalten sind (z. B. Unterschiede zwischen Sterilisation durch trockene oder feuchte Hitze, Wahl genügend hoher Sterilisationstemperaturen). Darüber hinaus sollen erste Anreicherungskulturen auf der Grundlage relativ einfacher Selektionskriterien angesetzt werden. (Am 2. Kurstag werden dann Stoffwechselspezialisten angereichert). 1. Ansetzen des Nährmediums GPH Versuch I. 1 Das Medium “Glucose-Pepton-Hefeextrakt” (GPH, siehe Anhang) ist ein komplexes Nährmedi- um, das die Nährstoffansprüche einer Vielzahl an Bakterien erfüllt. • Von dem Nährmedium GPH setzt jede Gruppe ein Volumen von 500 ml an • nach dem Einstellen des pH-Wertes werden 100 ml davon (vor der Zugabe von Agar-Agar) in 300 ml Erlenmeyerkolben abgefüllt (zur späteren Verwendung als Flüssigmedium), • die verbleibenden 400 ml werden in 500 ml Erlenmeyerkolben abgefüllt und mit der angegebenen Menge an Agar-Agar versetzt ( zur späteren Verwendung als Nähragar ) • anschließend werden die Medien 15 - 20 min im Autoklaven sterilisiert • nach dem Abkühlen auf ca 50 °C werden mit dem GPH-Agar-Medium Platten (in die Unter- schale der Petrischale) unter Einhaltung steriler Bedingungen gegossen. • Die Flüssigmedien (100 ml) werden für anschließende Sterilisationsversuche benötigt. 2. Sterilisationsverfahren Die Anwendung der gebräuchlichen Sterilisationsverfahren ist durch die Art des Sterilisiergutes bestimmt. Während temperaturresistente Gerätschaften (z. B. aus Glas oder Metall) bei trockner Hitze im Bereich um 180 °C sterilisierbar sind, können hitzelabile Materialien (Flüssigkeiten, Plastikmaterialien) bei mäßiger Hitze, mit Hilfe von chemischen Agenzien, durch Filtration oder durch kurzwellige Strahlung sterilisiert werden. Flüssigkeiten werden im Labor bevorzugt bei feuchter Hitze (Kochen, Autoklavieren) sterilisiert. Beim Kochen unter Normaldruck können maximal bis 100 °C erreicht werden. Diese Temperatur reicht häufig nicht aus, um hitzeresistente 4
5 Formen (z. B. Sporen) abzutöten. Deshalb sollte das Sterilisiergut nach 30 minütigem Aufkochen und einer 4 stündigen Standphase bei Raumtemperatur (Sporen keimen dann zu hitzelabilen vegetativen Zellen aus) ein zweites Mal gekocht werden (fraktionierte Sterilisation = Tyndallisation). Gebräuchlicher ist es jedoch, Flüssigkeiten im Dampfdrucktopf (Autoklav) unter gespanntem Dampf bei höheren Temperaturen zu sterilisieren (2 atm = 202,65 kPa ; 121 °C). Versuch I. 2 Zur Überprüfung der Wirksamkeit üblicher Sterilisationsverfahren wird je eine Spatelspitze Spo- renerde (reife Komposterde) in fünf Reagenzgläser gegeben. Die Reagenzgläser werden mit Kap- pen verschlossen und beschriftet (Datum, Versuch, Gruppen-Nr., Röhrchen-Nr. ). Je ein Reagenz- glas wird anschließend • bei Raumtemperatur gehalten (Kontrolle, Rö. Nr. 1 ) • 2 Minuten bei 180 °C im Heißluftsterilisator erhitzt ( Rö. Nr. 2 ) • 30 Minuten bei 180 °C im Heißluftsterilisator erhitzt ( Rö. Nr. 3 ) • 30 Minuten im Dampftopf gekocht ( Rö. Nr. 4 ) • 15 Minuten im Autoklaven bei 2 atm gehalten ( Rö. Nr. 5 ). Nach dem Abkühlen werden die Reagenzgläser steril mit je 8 ml des autoklavierten GPH- Flüssigmediums versetzt ( von AssistentInnen) und bei 30 °C bebrütet. 3. Luftkeimplatten Die Luft enthält feine Wassertröpfchen oder kleine Partikeln als Schwebestoffe, an die Bakterien oder Pilzsporen angeheftet sein können. Die Zusammensetzung solcher in der Luft enthaltenen Populationen wird durch den Grad der Luftfeuchtigkeit, die Temperatur, Art und Intensität der Strahlung oder auch durch spezifische Keimquellen (z.B. antibiotikaresistente Bakterien in Krankenhäusern) bestimmt. Bei niedrigem Feuchtigkeitsgehalt der Luft und intensiver Sonnenstrahlung bleiben nur wenige Organismen vermehrungsfähig. Viele dieser Bakterien sind pigmentiert, bilden Sporen oder haben einen hohen GC-Gehalt der DNA. Auf Luftplatten findet man häufig Vertreter der Gattungen Micrococcus, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Streptomyces und die Hefe Rhodutorula. Versuch I. 3 Material: Für die Anreicherung von Keimen aus der Luft verwenden wir Platten (Petrischalen) mit GPH- und MP-Agar (siehe Anhang). Jede Gruppe gießt oder erhält je eine Platte mit einem der beiden Nährböden. Durchführung: An einem vom Kursleiter angegebenen Standort werden die Petrischalen für 30 min mit abgeho- benem Deckels exponiert. Die auf der Unterschale außen beschrifteten Platten (Gruppen-Nr, Da- tum, Standort) werden bei 30°C bebrütet.
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