89-91 - Polskie Stowarzyszenie Biomateriałów

przestrzennej, a także stopnia porowatości czy skłonności
do resorpcji. Bardzo ważne znaczenie ma ponadto rodzaj
kontaktowanych z materiałem komórek, ich pochodzenie,
sposób i gęstość posiewu czy pasaż, po którym zostały
użyte do badań [10-13].
Duże zainteresowanie, jakim cieszy się w obszarze nauk
biomedycznych, bioresorbowalny kopolimer glikolidu z laktydem
(PLGA) ma odzwierciedlenie w licznych opracowaniach
naukowych potwierdzających możliwość jego stosowania w
takich specjalnościach medycyny jak inżynieria tkankowa
i genetyczna, farmakologia, chirurgia czy stomatologia
[14-18]. kopolimer ten łączy się często z różnego rodzaju
napełniaczami pochodzenia naturalnego czy syntetycznego,
które wpływają między innymi na charakterystykę
mechaniczną kompozytu, odpowiedź komórkową i proces
jego degradacji [19,20]. Wyjątkowy wpływ na końcowe właściwości
kompozytu mają napełniacze ceramiczne oparte o
fosforany wapnia (hydroksyapatyt, fosforan trójwapniowy)
czy bioszkło [21-23]. Wpływają one bowiem w sposób
istotny na aktywność biologiczną powstałego z ich udziałem
kompozytu co ma odzwierciedlenie w ich lepszej integracji
z żywą tkanką [24,25].
W niniejszej pracy postawiono sobie za cel ocenę stopnia
cytotoksyczności kompozytu złożonego z kopolimeru
glikolidu z laktydem oraz hydroksyapatytu (PLGA+HA)
w kontakcie z ludzkimi komórkami kościotwórczymi linii
hFOB 1.19.
materiał i metody
Materiałem badawczym w pracy był kopolimer glikolidu i
L-laktydu (PLGA: 82% L-laktydu, 18% glikolidu), który został
pozyskany z Centrum Materiałów Polimerowych i Węglowych
PAN w Zabrzu. Syntezę przeprowadzono na drodze
otwarcia pierścienia z użyciem nietoksycznego inicjatora
- acetyloacetonianu cyrkonu [26]. kopolimer charakteryzował
się średnim ciężarem cząsteczkowy Mn=75kDa oraz
współczynnikiem polidyspersji Mn/Mw=2,1. kompozyt
PLGA+HA sporządzono przez dodanie do kopolimeru 15
wt% nanocząsteczek hydroksyapatytu (HA) pochodzenia
naturalnego z kości wołowej [27].
Do badań in vitro użyto krążków o średnicy 16mm i grubości
1mm wyciętych z błonek otrzymanych metodą wylewania
z roztworu CH2Cl2 kompozytu na szalki. W celu poprawy
homogeniczności PLGA+HA przed dodaniem nanocząsteczek
hydroksyapatytu do rozpuszczonego w CH 2Cl 2
kopolimeru zwilżano je wcześniej w tym samym roztworze.
Połączenie obu składników nastąpiło poprzez mieszanie na
mieszadle magnetycznym oraz rozbijanie ultradźwiękami.
Całość prowadzona była w temperaturze pokojowej.
Do badań in vitro oceniających cytotoksyczność badanego
kompozytu użyto ludzkich osteoblastów linii hFOB 1.19
zakupionych w American Type Culture Collection – ATCC
(Manassas, VA, uSA), numer katalogowy CRL-11372.
Badania przeprowadzono zgodnie z zaleceniami normy
PN-EN ISO 10993-5 [3].
Część doświadczalną pracy przeprowadzono w katedrze
i Zakładzie Mikrobiologii i Immunologii Śląskiego uniwersytetu
Medycznego w Zabrzu. Hodowlę komórek prowadzono
w plastikowych butelkach o pojemności 50 ml (Nunc A/S Roskilde,
Dania). Jako medium hodowlane stosowano podłoże
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium oraz podłoże Ham’s
F12 połączone w proporcji 1:1 (bez czerwieni fenolowej i
antybiotyków) z dodatkiem 2,5mM L-glutaminy oraz 0,3mg/
ml G418 Sulphate i 10% płodowej surowicy cielęcej (FBS)
inaktywowanej termicznie. komórki hodowano w sposób
ciągły w temperaturze 34 o C w atmosferze powietrza z 5%
zawartością CO 2 przy 100% wilgotności względnej. komórki
which they were used for the examination [10-13].
The significant amount of interest in bioresorbable lactide-glycolide
co-polymer (PLGA) in biomedical sciences is
reflected in numerous scientific works which confirm the fact
that the material can be used in such medical specializations
as tissue engineering, genetic engineering, pharmacology,
surgery or stomatology [14-18]. This co-polymer is often
combined with different kinds of fillers of natural or synthetic
origin, which have an influence upon, among others, the mechanical
characteristics of the composite, the cell response
and the process of its degradation [19, 20]. Ceramic fillers
based on calcium phosphate (hydroxyapatite, tricalcium
phosphate) or bio-glass have an exceptional influence on
the properties of the composite [21-23]. They have a vital
effect on the biological activity of the composite created with
their participation, which is reflected by their better integration
with living tissue [24,25].
The aim of this work is to assess the degree of cytotoxicity
of the composite consisting of lactide-glycolide composite
and hydroxyapatite (PLGA+HA) in contact with human
bone-forming cells hFOB 1.19 line.
material and methods
The material examined in the research was L-lactideglycolide
co-polymer (PLGA: 82% of L-lactide and 18% of
glycolide) which was obtained at the Polymer and Carbon
Materials Centre of the Polish Science Institute in Zabrze.
The synthesis was performed by opening the ring using
a non-toxic initiator - zirconium acetylacetonate [26]. The
copolymer had a medium molecular weight Mn=75kDa and
the polydispersion coefficient Mn/Mw=2.1. PLGA+HA composite
was obtained through adding 15wt% of nanoparticles
of hydroxyapatite (HA) of natural origin (from bovine bone)
to the co-polymer [27].
To perform in vitro examinations discs of 16mm diameter
and 1mm thickness were used; they were cut from
membranes obtained by pouring the composite on bowls
from CH 2Cl 2 solution. In order to improve PLGA+HA homogeneity,
before adding hydroxyapatite nanoparticles to the
co-polymer dissolved in CH 2Cl 2, they were moisture in the
same solution. Both ingredients were blended by mixing
them on a magnetic mixer and breaking them with the use
of ultrasound. The whole procedure was performed in room
temperature.
To perform in vitro examinations assessing cytotoxicity
of the examined composite human osteoblasts hFOB 1.19
line were used. They were purchased in American Type
Culture Collection – ATCC (Manassas, VA, uSA), catalogue
number CRL-11372. The examinations were performed in
accordance with the regulations of the PN-EN ISO 10993-5
norm [3].
The experimental part of the research was performed at
the Chair and Department of Microbiology and Immunology
of the Medical university of Silesia in Zabrze. The cells were
cultured in plastic 50ml bottles (Nunc A/S Roskilde). Dulbecco’s
Modified Eagle’s Medium was used together with Ham’s
F12 in proportion 1:1 (without phenol red and antibiotics)
with the addition of 2,5mM L-glutamine, 0,3mg/ml G418
Sulphate and 10% foetal bovine serum (FBS) inactivated
thermally. The cells were cultured in a continuous manner at
a temperature of 34 o C, air containing 5% CO 2, and 100%
relative humidity. The cells used in the research were after
6 passages, which guaranteed their stability and a constant
rate of proliferation.
The assessment of cytotoxicity level of the biomaterial
assessed was done using two method. The first method
used its extract obtained by 8-day incubation of the samples
99