89-91 - Polskie Stowarzyszenie Biomateriałów

100 wykorzystane do badań były po 6 pasażu, co gwarantowało
ich stabilność i stałe tempo proliferacji.
Oceny stopnia cytotoksyczności badanego biomateriału
dokonano dwoma metodami. W I metodzie wykorzystano
jego ekstrakt uzyskany poprzez 8-dniową inkubację próbek
badanego biomateriału umieszczonych na dnie dołków 24dołkowej
płytki do hodowli komórek (Nunc A/S Roskilde,
Dania) w 2ml medium hodowlanego o składzie identycznym
jak medium do hodowli osteoblastów. Próbki inkubowano
w temperaturze 37 0 C w atmosferze powietrza z 5% zawartością
CO 2 przy 100% wilgotności względnej. Następnie
objętość 0,2ml uzyskanego w ten sposób ekstraktu oraz
jego kolejnych rozcieńczeń w medium hodowlanym (rozcieńczenia
w postępie geometrycznym od 1:2 do 1:128) dozowano
do osteoblastów hFOB 1.19 zaadherowanych do dna
dołków 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowych. Płytki
inkubowano w temperaturze 37 0 C w atmosferze powietrza
z 5% zawartością CO 2 przy 100% wilgotności względnej.
Czas inkubacji dla dwóch równolegle prowadzonych eksperymentów
wynosił: 24 godziny oraz 48 godzin. Ocenę
cytotoksycznego działania kompozytu PLGA+HA na ludzkie
osteoblasty dokonano poprzez pomiar aktywności dehydrogenazy
mitochondrialnej (test MTT) oraz dehydrogenazy
mleczanowej (test LDH) wykonując każde z oznaczeń w
trzech niezależnych powtórzeniach [1,2]
Przeprowadzając badania II etapu na dnie dołków
4-dołkowej płytki do hodowli komórek z 1ml medium hodowlanego
umieszczano próbki badanego materiałów, a
następnie kontaktowano je z jednowarstwową hodowlą
osteoblastów. Płytki inkubowano w temperaturze 37 o C w
atmosferze powietrza z 5% zawartością CO 2 przy 100%
wilgotności względnej. Czas inkubacji wynosił 24, 48 i 72
godziny. Ocenę cytotoksycznego działania kompozytu na
ludzkie osteoblasty dokonano poprzez pomiar aktywności
dehydrogenazy mleczanowej (test LDH) wykonując każde
z oznaczeń w trzech niezależnych powtórzeniach [1].
aktywność dehydrogenazy mleczanowej (test ldh)
Dehydrogenaza mleczanowa uwalniana jest z cytoplazmy
do medium hodowlanego w wyniku uszkodzenia błony
komórkowej i lizy komórek. Wzrost aktywności LDH w supernatantach
hodowli komórkowych koreluje z odsetkiem
martwych komórek i jest proporcjonalny do stężenia formazanu
powstałego przez redukcję soli tetrazolowej. W teście
cytotoksyczności (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Niemcy) oznaczenia wykonano w 96 dołkowych płytkach
według procedury podanej przez producenta [1]. Procent
cytotoksyczności CT [%] obliczano według wzoru (1) – I
etap, oraz wzoru (2) – II etap, do których wstawiano wartości
poszczególnych absorbancji po uprzednim odjęciu wartości
Amedium (absorbancja medium hodowlanego):
gdzie A b – absorbancja próbki badanej, A wk – absorbancja
kontroli wysokiej, czyli wartość całkowitego uwolnienia
LDH (maksymalne uwolnienie LDH po dodaniu do hodowli
komórek 1% roztworu Tritonu X-100), A nk–absorbancja
kontroli niskiej, czyli wartość spontanicznego uwolnienia
LDH (spontaniczne uwalnianie LDH podczas hodowli komórek
natywnych), A ekstr–absorbancja kontroli badanego
ekstraktu.
aktywność dehydrogenazy mitochondrialnej (test
mtt)
of the examined material placed at the bottoms of the pits of
a 24-pit cell cultivation plate (Nunc A/S Roskilde, Denmark)
in 2ml of cultivation medium whose composition was identical
as that of osteoblasts cultivation medium. The samples
were incubated at 37 0 C temperature, the air containing 5%
of CO 2 and having relative humidity of 100%. Next, 0.2ml
of the extract thus obtained and its successive dilutions in
the cultivation medium (dilutions in geometric progression
from 1:2 to 1:128) were dozed to osteoblasts hFOB 1.19
line adhered to the bottom of the pits of a 96-pit cell cultivation
plate. The plates were incubated at the temperature
of 37 0 C, the air containing 5% of CO 2 and having relative
humidity of 100%. The incubation time for both simultaneously
performed experiments was 24 hours and 48 hours.
The assessment of cytotoxic influence of the PLGA+HA
composite on human osteoblasts was performed by measuring
the activity of mitochondrial dehydrogenase (MTT test)
and lactate dehydrogenase (LDH test); each marking was
done in three independent repetitions [1,2].
While performing the second stage examinations, the
samples of the examined material were placed at the bottom
of pits in a 4-pit cell cultivation plate with 1ml of the
cultivation medium, and then they were contacted with
one-layer osteoblasts culture. The plates were incubated at
the temperature of 37 o C, the air containing 5% of CO 2 and
having relative humidity of 100%. The incubation time was
24, 48 and 72 hours. The assessment of cytotoxic influence
of the composite upon human osteoblasts was performed
by measuring the activity of lactate dehydrogenase (LDH
test); each marking was done in three independent repetitions
[1].
ldh (lactate dehydrogenase) release assay
Lactate dehydrogenase is released from the cytoplasm
into the culture medium as a result of damage to the cellular
membrane and cellular lysis. Increased LDH activity in the
supernatants of cell cultures correlates with the percentage
of dead cells. LDH activity was measured using a commercial
cytotoxicity assay kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Germany), in which released LDH in culture supernatants
is measured with a coupled enzymatic assay, resulting in
conversion of a tetrazolium salt into red formazan product.
The marking of LDH activity was done in 96-pit plates according
to the procedure indicated by the manufacturer [1].
The toxicity percentage CT [%] was calculated according to
formula (1) – 1st method and formula (2) – 2nd method, to
which the values of particular absorbances were inserted,
after having subtracted the values the absorbance values
of the culture medium:
where A s–absorbance of the examined sample, A hc
-high control absorbance, or the value of the total LDH
release (maximum LDH release after adding 1% Triton X-
100 solution to cell culture), A lc–low control absorbance, or
the value of spontaneous LDH release (spontaneous LDH
release during native cells cultivation), A extr–absorbance of
the extract.
mtt (mitochondrial dehydrogenase) activity assay
After 24- or 48-hour incubation with the studied PLGA
extract sample, the cells used in the experiment were rinsed
and then the MTT solution was added, thereby obtaining the