PRODUCTION Of NUTRIENT SOURCES FOR RHIZOBIUM

More documents

Recommendations

Info

เชิดชาย บุรมย� : การผลิตแหล�งอาหารสํ าหรับเลี้ยงไรโซเบียม (Production of Nutrient Sources for Rhizobium) อาจารย�ที่ปรึกษา : ผู�ช�วยศาสตราจารย� ดร. สุรีลักษณ� รอดทอง, 202 หน�า ISBN 974-533-026-4 ไรโซเบียมเป�นแบคทีเรียที่พบอยู�ร�วมกับรากพืชตระกูลถั่วและช�วยตรึงไนโตรเจนจากบรรยากาศ ซึ่งเป�นประโยชน�มากด�านธุาตอาหารไนโตรเจนกับพืชอาศัย ป�จจุบันมีการผลิตหัวเชื้อไรโซเบียมเพื่อการ ปลูกพืชตระกูลถั่วที่มีความสํ าคัญทางเศรษฐกิจ ซึ่งไรโซเบียมหลายสายพันธุ�ต�องการแมนนิทอลและกลี เซอรอล เป�นแหล�งอาหารหลักและไม�สามารถใช�ทั้งกลูโคสซึ่งเป�นนํ้ าตาลที่แบคทีเรียโดยทั่วไปนํ าไปใช�ได� ง�าย และซูโครส ซึ่งแมนนิทอลและกลีเซอรอลมีมูลค�าสูงกว�ากลูโคสประมาณ 12-20 เท�า ทํ าให�มีต�นทุนสูง ในการผลิตหัวเชื้อ การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค�เพื่อผลิตกลีเซอรอลและแมนนิทอลจากวัตถุดิบมูลค�าตํ่ า ได�แก� แป�ง และซูโครส โดยจุลินทรีย�ในกลุ�มยีสต� เพื่อนํ าไปเลี้ยงไรโซเบียมกลุ�มที่เจริญช�า ซึ่งอาจช�วยลด ต�นทุนในการผลิตหัวเชื้อได� จากการคัดเลือกยีสต�จํ านวน 147 ไอโซเลทที่แยกได�จากแหล�งธรรมชาติและ 15 สายพันธุ�จากแหล�งเชื้อพันธุ�จุลินทรีย� ด�านความสามารถในการผลิตกลีเซอรอลและแมนนิทอลจากแป�ง และซูโครส พบว�ายีสต�ที่ให�ชื่อว�าไอโซเลท KAY1 ซึ่งแยกได�จากผลกระเจี๊ยบสด สามารถย�อยแป�งได�ดีและ สามารถผลิตแมนนิทอลสะสมภายในเซลล�ในปริมาณสูงสุดคือ 1.2-1.5 กรัมต�อลิตรของอาหารเลี้ยงเชื้อ เมื่อ เลี้ยงยีสต�นั้นในอาหารที่มีแป�งชนิดใดชนิดหนึ่งคือ แป�งมันสํ าปะหลัง แป�งข�าวเจ�า หรือแป�งข�าวกล�อง ใน ปริมาณ 2 เปอร�เซนต�เป�นส�วนประกอบ การให�ความร�อนต�อเซลล�ยีสต�ที่อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียสเป�น เวลา 20 นาที ก�อนนํ าไปเลี้ยงในอาหารแป�ง ช�วยส�งเสริมความสามารถในการผลิตแมนนิทอล ให�ได�ปริมาณ เพิ่มขึ้นอีกประมาณ 1.2 เท�า ยีสต�ไอโซเลท PUY4 ซึ่งแยกได�จากผลพุทราสุก มีความสามารถในการผลิต กลีเซอรอลที่ตรวจพบในอาหารเลี้ยงเชื้อในปริมาณ 14 กรัมต�อลิตร เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีซูโครส 5 เปอร� เซนต�เป�นส�วนประกอบ และเมื่อนํ าไรโซเบียมกลุ�มที่เจริญช�า คือ Bradyrhizobium japonicum USDA 11O และ Bradyrhizobium spp. THA 5 มาเลี้ยงในอาหารที่มีแมนนิทอลซึ่งเตรียมได�จากเซลล�ของยีสต�ไอโซเลท KAY1 พบว�าเชื้อไรโซเบียมทั้ง 2 สายพันธุ�สามารถเจริญได�จํ านวนเซลล�ถึง 10 8 เซลล�ต�อมิลลิลิตร สํ าหรับ อาหารเลี้ยงไรโซเบียมที่มีกลีเซอรอลเป�นส�วนประกอบ พบว�ากลีเซอรอลที่เตรียมจากอาหารเหลวที่ผ�านการ เลี้ยงยีสต�ไอโซเลท PUY4 สามารถส�งเสริมการเจริญของไรโซเบียมทั้งสองสายพันธุ�ได�ดีเช�นเดียวกัน และ ให�ผลทํ านองเดียวกับอาหารเลี้ยงไรโซเบียมที่เตรียมโดยใช�กลีเซอรอลและแมนนิทอลที่ผลิตเป�นการค�า และ จากการศึกษาเพื่อจัดจํ าแนกชนิดของยีสต� พบว�ายีสต�ไอโซเลท KAY1 และ PUY4 จัดฮยู�ในสกุล Rhodotorula และ Pichia ตามลํ าดับ สาขาวิชาเทคโนโลยีชีวภาพ ลายมือชื่อนักศึกษา………………………………... ป�การศึกษา 2544 ลายมือชื่ออาจารย�ที่ปรึกษา………………………... ลายมือชื่ออาจารย�ที่ปรึกษาร�วม………………….… ลายมือชื่ออาจารย�ที่ปรึกษาร�วม………………….… �
CHARDCHAI BUROM : PRODUCTION OF NUTRIENT SOURCES FOR RHIZOBIUM THESIS ADVISOR : ASST. PROF. SUREELAK RODTONG, PH.D., 202 PP. ISBN 974-533-026-4 Rhizobia are the effective nitrogen fixation bacteria in symbiosis with legumes. Rhizobial inoculants are currently produced for growing several economic legumes. The utilization of carbon compounds by rhizobia varied with their species and strains. Most slow-growing rhizobia cannot use the simple sugar, glucose, as well as sucrose. Mannitol and glycerol are mainly used for the cultivation of these slow-growing rhizobia. Prices of the carbohydrate compounds are about 12-20 times more expensive than glucose. Consequently, the production of these legume inoculants is costly. This study was aimed to produce glycerol and mannitol for Rhizobium cultivation by microbial conversion of cheap substrates such as starch and sucrose. The production cost of rhizobial inoculants might be reduced. A total of 147 yeasts isolated from natural sources and 15 yeast type strains were screened for their glycerol and mannitol production capabilities. It was found that the yeast isolate KAY1 isolated from rozelle fruit could utilized starch, and was proved to be the highest accumulation of mannitol in its cell when cultured in the medium containing 2% of either cassava starch, rice starch, or Khao-klong starch. The maximum yield of mannitol was 1.2-1.5 grams of mannitol per litre of cutured medium of yeast. When the yeast cells were heated at 45 o C for 20 min, the production of mannitol in yeast cells was increased 1.2 times higher than untreated cells. The yeast isolate PUY4 isolated from Phut-sa (Zizyphus jujuba Lamk) fruit could produce glycerol detected in its broth culture at the concentration of 14 grams of glycerol per litre of cutured medium. When cultured two slowgrowing rhizobium strains, Bradyrhizobium japonicum USDA 110 and Bradyrhizobium spp. THA 5, in the medium containing mannitol prepared from KAY1 cells. The good growth of about 10 8 cells/ml of the two strains of Bradyrhizobium was obtained. When cultured the two Bradyrhizobial strains in the medium containing glycerol prepared from cultured medium of isolate PUY4, their growth was also enhanced. The similar results were achieved when the same compositions of rhizobial media were prepared using either commercial glycerol and mannitol. Yeast isolates KAY1 and PUY4 were identified as belonging to genera Rhodotorula and Pichia, respectively. สาขาวิชาเทคโนโลยีชีวภาพ ลายมือชื่อนักศึกษา………………………………... ป�การศึกษา 2544 ลายมือชื่ออาจารย�ที่ปรึกษา………………………... ลายมือชื่ออาจารย�ที่ปรึกษาร�วม………………….… ลายมือชื่ออาจารย�ที่ปรึกษาร�วม………………….… ��
Page 1 and 2: PRODUCTION OF NUTRIENT SOURCES FOR
Page 3: PRODUCTION OF NUTRIENT SOURCES FOR
Page 7 and 8: CONTENTS Page ABSTRACT (THAI)……
Page 9 and 10: 3.6.1� Determination of the suita
Page 11 and 12: �� 17� Glycerol concent
Page 13 and 14: 40� Time courses of mannitol prod
Page 15 and 16: 59� Effects of various heat shock
Page 17 and 18: LIST OF TABLES Table Page ��
Page 19 and 20: LIST OF ABBREVIATIONS Aw water avai
Page 21 and 22: CHAPTER I INTRODUCTION For mass cul
Page 23 and 24: available (Burton, 1965). The molec
Page 25 and 26: 1.1.1� Carbon metabolism in Rhizo
Page 27 and 28: strains unable to use the carbon so
Page 29 and 30: Figure 2. The fructose bisphosphate
Page 31 and 32: 1.2�Classification of yeasts Mank
Page 33 and 34: Table 3. (continued). Class Order F
Page 35 and 36: Ustilaginales (Oberwinkler, 1987).
Page 37 and 38: f Cystofilobasidium has thick-walle
Page 39 and 40: Table 5. (continued). Sugar alcohol
Page 41 and 42: specific cases, but Brown (1978) pr
Page 43 and 44: KY 6166 was also studied using larg
Page 45 and 46: Figure 5. Important pathways of gly
Page 47 and 48: may be present in different ratios.
Page 49 and 50: amylase systems of the yeast specie
Page 51 and 52: Table 7. (continued). EC Recommende
Page 53 and 54: Table 8. (continued). Species a D.p
Page 55 and 56:
Table 9. (continued). Cell product
Page 57 and 58:
2.1.3 Equipment and other materials
Page 59 and 60:
Spotted either the supernatant of c
Page 61 and 62:
amylase action, the actual reaction
Page 63 and 64:
A) Determination of the suitable an
Page 65 and 66:
B) Salt-stress conditions Fifty mil
Page 67 and 68:
2.2.8 Cultivation of Bradyrhizobium
Page 69 and 70:
The cultured medium of yeast. Quant
Page 71 and 72:
intervals for accumulation of gas i
Page 73 and 74:
CHAPTER III RESULTS AND DISCUSSION
Page 75 and 76:
Glycerol Xylitol Glucose Mannitol S
Page 77 and 78:
Glycerol Xylitol Glucose Mannitol S
Page 79 and 80:
Table 10. Primary screening of glyc
Page 81 and 82:
Table 10. (continued). No. Isolate
Page 83 and 84:
Glycerol in cell lysate (g/l) A Gly
Page 85 and 86:
average were 4-10 g of glycerol per
Page 87 and 88:
were isolated from fresh fruits, Ma
Page 89 and 90:
�third day of incubation (Figure
Page 91 and 92:
Reducing sugars (g/l) Reducing suga
Page 93 and 94:
These results indicated that the co
Page 95 and 96:
3.6.1 Determination of the suitable
Page 97 and 98:
g/l 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4
Page 99 and 100:
Reducing sugars (g/l) 8 6 4 2 0 0 1
Page 101 and 102:
Reducing sugars (g/l) 4.0 3.5 3.0 2
Page 103 and 104:
g/l 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
Page 105 and 106:
g/l g/l g/l 1.5 1.0 0.5 0.0 1.2 1.0
Page 107 and 108:
Starch fermentation was conducted i
Page 109 and 110:
g/l g/l 7 6 5 4 3 2 1 0 8 6 4 2 0 0
Page 111 and 112:
g/l g/l 8 6 4 2 0 8 6 4 2 0 1 2 3 4
Page 113 and 114:
g/l g/l 8 6 4 2 0 8 6 4 2 0 0 1 1 2
Page 115 and 116:
g/l g/l 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4
Page 117 and 118:
g/l g/l 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4
Page 119 and 120:
The results showed that amounts var
Page 121 and 122:
g/l g/l 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
Page 123 and 124:
�� fermentation, but the inc
Page 125 and 126:
g/l g/l 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 3.2
Page 127 and 128:
g/l g/l 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
Page 129 and 130:
�� intracellularly a decreas
Page 131 and 132:
g/l g/l 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 2.5
Page 133 and 134:
g/l g/l 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6
Page 135 and 136:
g/L 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 0
Page 137 and 138:
g/l 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7
Page 139 and 140:
�� effected by heat shock po
Page 141 and 142:
Table 15. The comparison of media f
Page 143 and 144:
Table 17. Growth of Bradyrhizobium
Page 145 and 146:
�� Rhizobium (Stowers, 1985;
Page 147 and 148:
�� 3.9 Identification of yea
Page 149 and 150:
KAY1 PIY2 PUY4 Y69 LIY2 COY1 FAY2 C
Page 151 and 152:
�� assimilations were observ
Page 153 and 154:
Table 20. (continued). Yeast strain
Page 155 and 156:
Table 20. (continued). 15. Pichia k
Page 157 and 158:
�� 3.9.5 Ascospore formation
Page 159 and 160:
(a) (b) (c ) (d) (e) �� Figu
Page 161 and 162:
(a) (b) (c) (d) (e) (f) �� F
Page 163 and 164:
(c) (a) �� Figure 72. Cell m
Page 165 and 166:
�� Metshnikowia (Pitt and Mi
Page 167 and 168:
CHAPTER IV CONCLUSION This study ex
Page 169 and 170:
only a low capital investment. Ther
Page 171 and 172:
�� Barnett, J. A., Payne, R.
Page 173 and 174:
�� De Mot, R., and Verachter
Page 175 and 176:
�� Jennings, D. H. (1995). T
Page 177 and 178:
�� Lie, T. A., Muilenbury M.
Page 179 and 180:
�� Onishi, H., and Suzuki, T
Page 181 and 182:
�� Sinclair, N. A., and Stok
Page 183 and 184:
�� Van Rossum, D., Schuurman
Page 185 and 186:
�� Young, J. P. W., and Hauk
Page 187 and 188:
Acetone Methanol Solvent for mobile
Page 189 and 190:
� 300 µg/ml, 200 µg/ml, and 100
Page 191 and 192:
Soluble Starch 20.0 g Distilled wat
Page 193 and 194:
13.�Nitrate broth KNO 3 1.0 g Glu
Page 195 and 196:
If the sample had been diluted befo
Page 197 and 198:
Table 1D. (continued). Source of ye
Page 199 and 200:
Page 201 and 202:
Page 203 and 204:
Page 205 and 206:
Page 207 and 208:
Page 209 and 210:
Page 212 and 213:
E. Additional figures Abs 540 nm (a
Page 214 and 215:
Abs 580 nm 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.
Page 216 and 217:
Figure 7E. Calibration curves for H
Page 218 and 219:
Figure 9E. Example of HPLC chromato
Page 220:
Cell/mL 1.0E+09 8.0E+08 6.0E+08 4.0
show all

PRODUCTION Of NUTRIENT SOURCES FOR RHIZOBIUM

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?