Tema 3 - OCW Usal
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Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 2<br />
<strong>Tema</strong> 3<br />
ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION ULTRAVIOLETA-VISIBLE<br />
La espectrofotometría de absorción en las regiones ultravioleta y visible del<br />
espectro electromagnético es, posiblemente, la más utilizada en la práctica del análisis<br />
cuantitativo de todas las técnicas espectroscópicas. Asimismo, puede resultar de<br />
utilidad como técnica auxiliar para la determinación de estructuras de especies<br />
químicas.<br />
Se basa en la absorción de radiación ultravioleta y visible por el analito, como<br />
consecuencia de lo cual se origina un estado activado que posteriormente elimina su<br />
exceso de energía en forma de calor, en un proceso que esquemáticamente puede<br />
representarse así:<br />
X + hυ —> X* —> X + calor<br />
La cantidad de calor disipado es muy pequeño, por lo que el método tiene la<br />
ventaja de originar un trastorno mínimo en el sistema que se estudia.<br />
El término generalmente empleado en la medida de la radiación absorbida es el<br />
de absorciometría, si bien, normalmente se utiliza la denominación de colorimetría<br />
cuando se trabaja en la region visible del espectro electromagnético y se emplean<br />
aparatos que utilizan filtros (ver más adelante) para seleccionar la radiación utilizada * .<br />
Por otra parte, el término espectrofotometría suele aplicarse cuando la radiación<br />
utilizada se extiende a las regiones ultravioleta e infrarroja, y además, se utilizan<br />
monocromadores en lugar de filtros, así como sistemas de detección más sensibles,<br />
como tubos fotomultiplicadores.<br />
* En sentido estricto, un colorímetro es un instrumento que compara el color de una sustancia con el de<br />
una disolución de referencia usando el ojo humano como detector, si bien, en la práctica, esta denominación<br />
suele aplicarse a muchos fotómetros de filtro con sistemas de detección eléctricos.
Claudio González Pérez 3<br />
En cuanto a la región ultravioleta, hay que indicar que la zona de mayor interés en<br />
la práctica analítica ordinaria es la denominada como ultravioleta próximo (longitud de<br />
onda entre 200 y 400 nm), pues el ultravioleta lejano o ultravioleta de vacío (de 10 a<br />
200 nm) presenta el inconveniente de que oxígeno atmosférico absorbe en esa región,<br />
siendo necesario eliminarlo del instrumento de medida. Debido a ello, la<br />
espectrofotometría en esa región espectral no se ha desarrollado suficientemente.<br />
LEYES DE LA ABSORCION DE RADIACION<br />
Cuando un haz de radiación monocromática de una determinada longitud de onda<br />
atraviesa una capa de disolución conteniendo una especie absorbente, la potencia<br />
(energía por unidad de tiempo y unidad de área) del haz incidente Po se atenúa,<br />
disminuyendo hasta P (figura 3.1.)<br />
Se define la transmitancia, T, como la fracción de radiación incidente que<br />
consigue atravesar la muestra. Varía de 0 a 1 y puede expresarse también como<br />
porcentaje:<br />
T= P<br />
; % T=<br />
P o<br />
P<br />
x 100<br />
P o<br />
Un parámetro de mayor utilidad práctica es la absorbancia, A, definida como<br />
A=–logT=log P o<br />
P<br />
Po P P–dP<br />
P<br />
db<br />
b<br />
Figura 3.1. Absorción de radiación<br />
Obsérvese que cuando no hay absorción de radiación, P=Po y entonces, A=0,<br />
mientras que si se absorbe el 99 %, solo se transmite el 1%, con lo que A=2.
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 4<br />
Para una capa de disolución absorbente de espesor infinitamente pequeño, db,<br />
(Figura 3.1.) la disminución de la potencia radiante, dP, es proporcional a la propia<br />
potencia incidente, P, a la concentración de la especie absorbente, C, y al espesor db:<br />
dP = – k P C db<br />
donde k es una constante de proporcionalidad. Reagrupando la ecuación anterior e<br />
integrando, se obtiene:<br />
donde, ε = k/2.3. La expresión,<br />
ln P<br />
P o<br />
P o<br />
log P<br />
P o<br />
P<br />
dP<br />
P =–kCdb<br />
dP<br />
P<br />
b<br />
=– kCdb<br />
0<br />
=–kCb=2.3log P<br />
P o<br />
=–logT=A=ε bC<br />
A = ε b C<br />
se denomina ley de Beer. Es fundamental en análisis cuantitativo al relacionar la<br />
absorbancia con la concentración.<br />
La constante ε recibe el nombre de absortividad molar, cuando la concentración<br />
se expresa en moles/litro y el camino óptico, b, en centímetros. La absortividad es<br />
una propiedad característica de la sustancia absorbente y depende de la longitud de<br />
onda. Por ello, para aplicar la ley de Beer debe seleccionarse una determinada longitud<br />
de onda, y para este propósito se utiliza el espectro de absorción, siendo éste una<br />
gráfica que indica la variación de la absorbancia, o de la absortividad, con la longitud<br />
de onda.<br />
DESVIACIONES DE LA LEY DE BEER<br />
La proporcionalidad entre la absorbancia y la concentración únicamente se cumple<br />
para disoluciones muy diluidas, observándose desviaciones más o menos acusadas al<br />
aumentar la concentración (figura 3.2.).
A<br />
Claudio González Pérez 5<br />
Desviaciones<br />
positivas<br />
Desviaciones<br />
negativas<br />
Figura 3.2. Desviaciones de la ley de Beer<br />
Las desviaciones de la ley de Beer pueden clasificarse de la forma siguiente:<br />
Reales<br />
Instrumentales<br />
Químicas<br />
Personales<br />
Radiación no monocromática<br />
Radiación parásita<br />
Errores de lectura<br />
Dimerizaciones<br />
Influencia del equilibrio Acido-base<br />
Complejos<br />
Influencia del disolvente<br />
Influencia de la temperatura<br />
Impurezas en los reactivos<br />
Interacción entre especies absorbentes<br />
DESVIACIONES REALES. En la deducción de la ley de Beer que se hizo<br />
anteriormente, no se ha considerado que la absortividad depende del índice de<br />
refracción, n, según la expresión:<br />
ε = ε verdadero<br />
n<br />
n 2 +2<br />
Como, a su vez, el índice de refracción varía con la concentración, la absortividad<br />
no es rigurosamente constante para cualquier concentración, provocando desviaciones<br />
2<br />
C
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 6<br />
negativas. De todas formas, en la práctica, para concentraciones inferiores a 10 –3 M<br />
puede prescindirse de la influencia de este factor, al ser el índice de refracción<br />
esencialmente constante.<br />
DESVIACIONES INSTRUMENTALES. Las fluctuaciones producidas en la<br />
corriente eléctrica, la inestabilidad de algunas fuentes de radiación o la respuesta no<br />
lineal del detector pueden originar el funcionamiento incorrecto de un determinado<br />
aparato. Además de éstos, pueden considerarse los siguientes factores de tipo<br />
instrumental como causas de desviaciones de la ley de Beer:<br />
a) Uso de radiación no monocromática. La deducción de la ley de Beer se hizo<br />
sobre la base de utilizar radiación monocromática, lo cual, en sentido estricto, nunca<br />
se cumple, pues en la práctica, todos los dispositivos seleccionan una banda más o<br />
menos ancha en torno a una determinada longitud de onda. La influencia de la radiación<br />
policromática sobre la ley de Beer puede mostrarse del siguiente modo:<br />
Supóngase un haz formado por las longitudes de onda λ1 y λ2 (banda M en la<br />
figura 3.3.a.).<br />
A<br />
λ 1<br />
M<br />
λ 2<br />
N<br />
A<br />
λ<br />
a) b)<br />
Figura 3.3. Influencia de la radiación policromática sobre la ley de Beer.<br />
Aplicando la ley de Beer a cada una de ellas, se tiene:<br />
A 1 =log P 01<br />
P 1<br />
A 2 =log P 02<br />
P 2<br />
= ε 1 bC; P 1 =P 01 10 –ε 1b C<br />
= ε 2 bC; P 2 =P 02 10 –ε 2b C<br />
N<br />
C<br />
M
Claudio González Pérez 7<br />
Cuando este haz constituido por las dos radiaciones atraviesa una disolución<br />
conteniendo especies absorbentes, la potencia del haz emergente es P1+P2, mientras<br />
que la del haz incidente sobre la muestra es P01 + P02. Según esto, la absorbancia<br />
medida será:<br />
a<br />
A M =log P 01 +P 02<br />
P 1 +P 2<br />
P 01 +P02 =log<br />
P 01 10 –ε 1b C<br />
+P02 10 –ε 2b C<br />
AM = log (P01 + P02) – log (P01 10 –ε 1 b C + P02 10 – ε 2 b C )<br />
En el caso particular de que ε1 = ε2 la ecuación anterior se simplifica, reduciéndose<br />
AM = ε1 b C<br />
que es la ley de Beer. Sin embargo, cuando ε1 es distinto de ε2, la relación entre AM y<br />
la concentración deja de ser lineal. Evidentemente, cuanto mayor sea la diferencia<br />
entre ε1 y ε2, mayores serán las desviaciones de la linealidad. Por eso mismo, aún<br />
cuando la anchura de banda sea relativamente grande, si las diferencias en los valores<br />
de la absortividad son pequeños, la utilización de un haz policromático no implica<br />
diferencias significativas respecto a uno monocromático (ver Fig. 3.3.a., banda N).<br />
b) Presencia de radiación parásita. El haz de radiación que sale de un<br />
monocromador suele estar contaminado con pequeñas cantidades de radiación parásita<br />
o dispersada originada por reflexión de los distintos componentes ópticos, dispersión<br />
por partículas de polvo atmosférico, etc. Por otra parte, la propia muestra puede<br />
originar dispersiones.<br />
Con frecuencia, la radiación dispersada tiene una longitud de onda diferente<br />
respecto a la radiación principal, pudiendo además, en ocasiones, llegar al detector sin<br />
haber atravesado la muestra. Por todo ello, la absorbancia medida en presencia de<br />
radiación parásita es:<br />
A M =log P 0 +P s<br />
P+P s<br />
donde Ps es la potencia del haz dispersado. Al aumentar la concentración de<br />
sustancias absorbentes, disminuye P, con lo que este término puede ser lo<br />
suficientemente pequeño respecto a Ps como para que la expresión anterior se<br />
transforme en:<br />
A M =log P 0 +P s<br />
P+P s<br />
- log P 0 +P s<br />
P s
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 8<br />
lo cual indica la presencia de desviaciones negativas en la ley de Beer debido a este<br />
factor.<br />
c) Errores de lectura. Los errores indeterminados en la lectura de la<br />
transmitancia o absorbancia son errores que potencialmente siempre están presentes<br />
y es necesario tenerlos en cuenta. En ocasiones, pequeños errores en la lectura de la<br />
transmitancia o de la absorbancia pueden ocasionar errores grandes en la<br />
concentración cuando se opera en los extremos de la escala. Esto se ilustra en la<br />
figura 3.4.<br />
% T<br />
1 2 3<br />
Figura 3.4. Errores de lectura.<br />
En 1, figura 3.4., el error absoluto cometido en la determinación de la<br />
concentración, para un cierto error de lectura de transmitancia, es pequeño, pero al<br />
ser pequeña la concentración, el error relativo puede ser grande. En 3, la<br />
incertidumbre en la determinación de la concentración es alta, y en 2, hacia la mitad<br />
de la escala, parece que se trata de la situación más favorable.<br />
Puede demostrarse, como se indica a continuación, que el mínimo error relativo<br />
se obtiene para una absorbancia de 0.434.<br />
La primera derivada de la ley de Beer es:<br />
A = ε b C = – log T ;<br />
ε bdC=–logedT<br />
T<br />
donde dT representa el error indeterminado en la lectura de la escala de<br />
transmitancia y dC indica la incertidumbre en la concentración. Como log e = 0.434 y ε<br />
b = – log T/C, se obtiene,<br />
dC<br />
C<br />
= 0.434<br />
T(log T) dT<br />
Derivando esta ecuación de nuevo e igualando a cero, se obtiene que la<br />
transmitancia óptima corresponde a 36.8 %, que equivale a una absorbancia de 0.434.<br />
C
Claudio González Pérez 9<br />
DESVIACIONES QUIMICAS<br />
Se incluyen en este apartado toda una serie de desviaciones aparentes de la ley<br />
de Beer producidas como consecuencia de procesos químicos en los que participan las<br />
especies absorbentes.<br />
a) Influencia del equilibrio. Cuando la sustancia problema interviene o forma<br />
parte de un sistema en equilibrio con otras especies, el desplazamiento del equilibrio<br />
implica una modificación en la concentración, y, en consecuencia, en la absorbancia.<br />
Algunas situaciones que pueden producirse son las siguientes:<br />
Dimerizaciones. Cuando una disolución de dicromato potásico no tamponada se diluye, ocurre una<br />
transformación parcial en cromato, como consecuencia del equilibrio dímero-monómero:<br />
Cr2O7 2– + H2O 2 CrO4 2– + 2 H +<br />
(λ max = 350, 450 nm) (λ max = 372 nm)<br />
Acido–base. En la figura 3.5. se muestran los espectros de absorción de un indicador ácido-base.<br />
4<br />
1<br />
A<br />
2<br />
3<br />
1<br />
punto<br />
isosbéstico<br />
2<br />
3<br />
4<br />
– +<br />
HIn In + H<br />
rojo amarillo<br />
λ<br />
Figura 3.5. Espectros de absorción de un indicador ácido-base.<br />
Es evidente que cuando las especies absorbentes están implicadas en un equilibrio ácido-base, la<br />
ley de Beer no se cumple, al menos que el pH o la fuerza iónica sean constantes, o se opere a la<br />
longitud de onda del punto isobéstico, esto es, la longitud de onda a la cual las dos especies<br />
absorbentes en equilibrio presenten la misma absortividad. En este sentido hay que mencionar<br />
que los puntos isosbésticos se toman frecuentemente como criterio para la existencia de dos<br />
especies absorbentes interconvertibles de un compuesto determinado.<br />
Complejos. Cuando se mide la absorbancia de un complejo, por ejemplo Fe(SCN) 6 3– , para que se<br />
cumpla la ley de Beer hay que mantener constante la concentración de ligando libre, lo cual se<br />
consigue frecuentemente operando en gran exceso de ligando respecto al metal.
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 10<br />
b) Influencia del disolvente. Como consecuencia de las interacciones soluto–<br />
disolvente se originan con frecuencia desplazamientos espectrales, ensanchamientos<br />
de bandas y otros fenómenos que pueden provocar desviaciones en la ley de Beer. En<br />
este sentido, no es posible hacer predicciones de forma general. Unicamente<br />
mencionar algunos términos relacionados con los desplazamientos espectrales:<br />
desplazamiento batocrómico o desplazamiento hacia el rojo, consiste en un<br />
desplazamiento del máximo de absorción hacia longitudes de onda mayores (este<br />
efecto suele producirse en disolventes de alta constante dieléctrica). Desplazamiento<br />
hipsocrómico o desplazamiento hacia el azul, es el desplazamiento hacia longitudes de<br />
onda más cortas.<br />
c) Influencia de la temperatura. La temperatura puede influir modificando el<br />
equilibrio químico de algunos sistemas, así como, en ocasiones, dar lugar a<br />
desplazamientos batocrómicos. De todas formas, la temperatura no suele ser un<br />
factor a considerar en la mayor parte de los sistemas absorbentes sencillos.<br />
d) Presencia de impurezas en los reactivos. Muchos métodos<br />
espectrofotométricos son lo suficientemente sensibles como para detectar<br />
cantidades a nivel de trazas, por lo que la presencia de impurezas absorbentes en los<br />
mismos reactivos pueden originar errores considerables. Debido a ello, en la práctica<br />
analítica ordinaria, las medidas espectrofotométricas se llevan a cabo frente a un<br />
blanco constituido por la propia célula, el disolvente y los reactivos. En este sentido<br />
interesa que la absorbancia del blanco sea pequeña, pues si es grande, un pequeño<br />
error en su medida puede implicar un gran error relativo en el resultado final.<br />
e) Interacciones entre especies absorbentes. Cuando en una disolución existen<br />
varias especies absorbentes, la ley de Beer se cumple para cada una de ellas, si todas<br />
actúan independientemente. Sin embargo, la interacción entre ellas puede producir<br />
alteraciones en la distribución de cargas, como consecuencia de lo cual puede<br />
modificarse la energía requerida para la absorción y, en consecuencia, variaciones en<br />
la posición, forma y altura de las bandas de absorción. Por otra parte, estas<br />
alteraciones en la distribución de cargas también pueden ser originadas por la<br />
presencia de sales inertes, con el consiguiente aumento de la fuerza iónica de la<br />
disolución.
Claudio González Pérez 11<br />
f) Interacciones soluto–radiación electromagnética. Aunque en sentido estricto<br />
no son factores de tipo químico, también deben considerarse otros tipos de<br />
interacción entre la radiación y la materia, distintos de los que intervienen en el<br />
proceso de absorción. Así, la posible emisión de resonancia y la presencia de<br />
fenómenos fluorescentes y fosforescentes pueden originar desviaciones aparentes en<br />
la ley de Beer.<br />
ERRORES PERSONALES<br />
En este sentido, los mayores errores suelen cometerse por el uso inadecuado de<br />
las cubetas de absorción. Resultan de utilidad las recomendaciones siguientes:<br />
* Es necesario asegurarse de que las cubetas están perfectamente limpias, no<br />
rayadas y exentas de huellas o adherencias en las paredes por las que ha de<br />
pasar la radiación.<br />
* Las cubetas de vidrio y cuarzo pueden limpiarse con ácido nítrico o con agua<br />
regia en frío, pero no con mezcla crómica.<br />
* Una vez limpias, las cubetas deben enjuagarse con agua destilada y con varias<br />
porciones de la disolución a medir.<br />
* No deben secarse interiormente, mientras que el exterior debe secarse con<br />
papel suave, comprobando, además, que, una vez llena con la disolución problema,<br />
no contiene burbujas de aire.<br />
* Aunque se debe trabajar con cubetas idénticas para la muestra y la referencia<br />
(blanco), es buena práctica utilizar siempre la misma disolución en cada una de<br />
ellas.<br />
ABSORCION DE RADIACION<br />
Como se indicó en el capítulo anterior, cuando una molécula absorbe un fotón, se<br />
incrementa su energía, pasando a un estado excitado. En relación con esto, pueden<br />
hacerse las siguientes preguntas: ¿qué pasa con la energía absorbida? ¿en qué se<br />
invierte?, etc. Seguidamente se intentará dar respuesta a ellas.<br />
La absorción de radiación ultravioleta y visible origina transiciones entre<br />
distintos niveles de energía electrónicos, así como simultáneamente transiciones
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 12<br />
vibracionales y rotacionales, de forma que el cambio en la energía molecular de una<br />
determinada especie como consecuencia de la absorción de energía radiante puede<br />
representarse así:<br />
∆E = ∆Eelectrónica + ∆Evibracional + ∆Erotacional + ∆Etraslacional<br />
De todos los términos que figuran en la expresión anterior, el más importante es<br />
∆Eelectrónica, pues la diferencia de energía entre dos estados vibracionales es unas 10<br />
veces menos, y ∆Erotacional es, a su vez, entre 10 y 100 veces menor que ∆Evibracional.<br />
Por otro lado, el último término es tan pequeño que prácticamente puede prescindirse<br />
de su influencia.<br />
Debido a lo anteriormente expuesto, suele ser de utilidad clasificar las especies<br />
absorbentes en base al tipo de transiciones electrónicas que pueden tener lugar.<br />
Asimismo, esto permite correlacionar el comportamiento espectral de una<br />
determinada especie con sus características químicas, lo cual es importante en orden<br />
a determinar estructuras moleculares y para la identificación de ciertos grupos<br />
funcionales.<br />
Tipos de transiciones electrónicas<br />
Las moléculas orgánicas, y una gran cantidad de aniones inorgánicos, contienen<br />
electrones en orbitales moleculares σ y π, así como en orbitales no enlazantes, n, por<br />
lo que cuando estas especies absorben fotones de contenido energético adecuado se<br />
pueden producir transiciones a los correspondientes orbitales moleculares<br />
antienlazantes, σ* y π*, tal como se indica en la figura 3.6., donde se muestra la<br />
estructura de Lewis para una molécula orgánica sencilla y las transiciones electrónicas<br />
correspondientes.<br />
H<br />
H<br />
C O ++ + +<br />
+<br />
σ<br />
π<br />
n<br />
σ*<br />
*<br />
π<br />
n<br />
π<br />
σ<br />
Figura 3.6. Transiciones electrónicas entre niveles de energía moleculares.
Claudio González Pérez 13<br />
Como se representa en la figura 3.6., pueden tener lugar cuatro tipos de<br />
transiciones: σ—>σ*, π—>π*, n—>σ* y n—>π*. Asimismo, también pueden producirse<br />
transiciones denominadas de transferencia de carga y de campo ligando.<br />
Seguidamente se comentarán algunas peculiaridades de cada una de las transiciones<br />
mencionadas.<br />
Transiciones σ—>σ*. Estas transiciones entre orbitales moleculares sigma<br />
enlazantes y antienlazantes implican energías relativamente grandes (ver fig. 3.6.), de<br />
forma que las bandas de absorción se observan en el ultravioleta lejano, a longitudes<br />
de onda inferiores a 200 nm (Figura 3.7.). Esta región del espectro se denomina<br />
frecuentemente ultravioleta de vacío, debido a que los constituyentes normales del<br />
aire, nitrógeno y oxígeno, absorben fuertemente a 160 y 200 nm respectivamente, por<br />
lo que los espectros en esta zona deben obtenerse operando en el "vacío".<br />
Intensidad<br />
UV lejano UV próximo Visible<br />
σ —> σ*<br />
π —> π *<br />
n —> σ*<br />
transferencia de carga<br />
n —> π*<br />
campo ligando<br />
200 400 750<br />
λ, nm<br />
Figura 3.7. Bandas de absorción originadas por diferentes transiciones electrónicas.<br />
En los hidrocarburos saturados, en los que solamente hay enlaces sencillos C–H<br />
se producen estas transiciones; así el metano presenta máximos de absorción a 125 nm<br />
y el etano a 135 nm. Desde el punto de vista analítico, estas bandas tienen poco<br />
interés, debido a dificultades de tipo instrumental.<br />
Transiciones n—>σ*. Las especies químicas saturadas que contengan átomos con<br />
pares electrónicos en orbitales no enlazantes pueden dar lugar a que se produzcan<br />
transiciones n—>σ*. Esto sucede, por ejemplo, en compuestos saturados conteniendo<br />
heteroátomos de oxígeno, azufre y halógenos.<br />
.
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 14<br />
Estas transiciones requieren bastante energía, si bien en menor grado que las σ—<br />
>σ*, por lo que las bandas correspondientes se presentan fundamentalmente en el<br />
ultravioleta lejano. Por otra parte, la intensidad de las absorciones asociadas con<br />
estas bandas suelen ser de pequeña magnitud.<br />
Los máximos de absorción correspondientes a esta transiciones n—>σ* tienden a<br />
desplazarse hacia longitudes de onda menores al aumentar la electronegatividad del<br />
heteroátomo. De hecho, la mayor parte de los compuestos saturados que contienen<br />
oxígeno absorben a longitudes de onda inferiores a 200 nm, lo cual hace posible que<br />
compuestos tales como el agua, o los alcoholes, puedan utilizarse como disolventes en<br />
el ultravioleta próximo.<br />
Transiciones n—>π* y π—>π*. Estas transiciones se consideran juntas debido a<br />
que muchos grupos químicos contienen electrones en orbitales π y no enlazantes. Como<br />
se aprecia en la Figura 3.6., las transiciones π—>π* requieren la absorción de una<br />
cantidad de energía relativamente grande, por lo que suelen aparecer en el<br />
ultravioleta lejano, mientras que las n—>π* necesitan menor cantidad de energía, como<br />
consecuencia de lo cual se originan bandas en las zonas ultravioleta próximo y visible.<br />
En lo que respecta a la intensidad de la absorción, las absortividades molares de<br />
los picos asociados a las transiciones n—>π* son generalmente bajos, mientras que los<br />
correspondientes a los π—>π* son considerablemente mayores. De cualquier forma, el<br />
comportamiento mencionado puede alterarse, como se verá posteriormente, por la<br />
presencia de determinadas agrupaciones atómicas, o por el tipo de disolvente.<br />
Para que tengan lugar las transiciones consideradas en este apartado, es evidente<br />
que la especie química tendrá que contener algún grupo funcional con enlaces π, esto<br />
es, la estructura molecular deberá presentar centros absorbentes no saturados. A<br />
estos grupos de átomos responsables de la absorción en las regiones ultravioleta y<br />
visible se les denomina grupos cromóforos (por extensión, se considera que los<br />
sistemas con electrones s son cromóforos en el ultravioleta lejano). En la tabla 3.1. se<br />
muestran algunos grupos cromóforos y las transiciones implicadas en<br />
espectrofotometría ultravioleta-visible.<br />
Por otra parte, existen determinadas agrupaciones atómicas que por sí mismas no<br />
comunican color a la molécula que pertenecen, pero son capaces de reforzar la acción<br />
de un cromóforo. Estos grupos se denominan auxocromos.
Claudio González Pérez 15<br />
Tabla 3.1.<br />
Grupos cromóforos y transiciones electrónicas<br />
Grupo cromóforo Estructura Transición<br />
Etilénico C C π−> π∗<br />
Acetilénico C C<br />
π −> π∗<br />
Carbonilo C O<br />
π −> π∗<br />
n −> π∗<br />
Carboxilato C O<br />
Ester<br />
C<br />
O<br />
π −> π∗<br />
n −> π∗<br />
O<br />
Amida<br />
C<br />
OR<br />
π −> π∗<br />
n −> π∗<br />
O<br />
NH2<br />
π −> π∗<br />
n −> π∗<br />
Nitro — NO2<br />
π −> π∗<br />
n −> π∗<br />
Oxima<br />
C N<br />
π −> π∗<br />
n −> π∗<br />
Los grupos auxocromos suelen contener grupos funcionales con electrones en<br />
orbitales no enlazantes y que, en consecuencia, pueden absorber únicamente en el<br />
ultravioleta lejano, como consecuencia de transiciones n—>σ*. Sin embargo, si un<br />
auxocromo y un cromóforo se encuentran en la misma molécula, la absorción del<br />
cromóforo se desplaza hacia longitudes de onda más largas, a la vez que se produce un<br />
incremento en la intensidad de la absorción. Este efecto se atribuye normalmente a la<br />
posibilidad de que se den transiciones n—>π*. En relación con las modificaciones de las<br />
intensidades de absorción se definen los siguientes términos: efecto hipercrómico<br />
(aumento de la intensidad de la absorción) y efecto hipocrómico (disminución de la<br />
intensidad de la absorción).<br />
Cuando una molécula contiene dos o más grupos cromóforos pueden darse las<br />
siguientes posibilidades:<br />
a) Si los cromóforos están separados por dos o más enlaces sencillos se dice que están aislados,<br />
y, en estos casos, la absorción es la suma de todos los grupos cromóforos presentes. Ejemplo:<br />
λ max (nm) ε max<br />
CH 3–CH 2–CH 2–CH=CH 2 184 10000<br />
CH 2=CH–CH 2–CH 2–CH=CH 2 185 20000
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 16<br />
b) Cuando los cromóforos están conjugados, esto es, separados por un enlace sencillo, se produce<br />
un desplazamiento batocrómico acompañado de un efecto hipercrómico.<br />
λ max (nm) ε max<br />
–C=C– 170 16000<br />
–C=C–C=C– 220 21000<br />
–C=C–C=C–C=C– 260 35000<br />
La razón de estos desplazamientos se considera que es debida a que la conjugación hace que se<br />
produzca una deslocalización de los electrones π sobre, al menos, cuatro átomos, como<br />
consecuencia de lo cual se rebaja el nivel de energía del orbital π*, con lo que al ser menor la<br />
energía requerida para las transiciones, los máximos de absorción se desplazan hacia mayores<br />
longitudes de onda, aumentando además las probabilidades de que tengan lugar las mencionadas<br />
transiciones, lo que origina un aumento simultáneo en la intensidad de la absorción. Sin embargo,<br />
cuando existe algún enlace triple, se observa una disminución de la intensidad de absorción<br />
(efecto hipocrómico)<br />
CH 2 = CH – CH = CH 2<br />
CH 2 = CH – C CH<br />
λ max<br />
219<br />
219<br />
ε max<br />
21000<br />
6500<br />
c) Cuando los cromóforos están unidos directamente, el espectro resultante normalmente es<br />
distinto del que presentan ambos cromóforos cuando están aislados, ya que en realidad se forma<br />
un nuevo cromóforo.<br />
λ max ε max<br />
CH 2=CH 2 170 10000<br />
CH 2=C=CH 2 225 500<br />
En cuanto a la influencia del disolvente, puede decirse que al aumentar la<br />
polaridad del disolvente se produce un desplazamiento hipsocrómico (hacia menor<br />
longitud de onda) de las bandas n—>π* y un desplazamiento batocrómico (hacia<br />
longitudes de onda mayores) de las bandas π—>π*. Esto puede explicarse teniendo en<br />
cuenta que el estado excitado es más polar que el estado fundamental, por lo cual, la<br />
presencia de un disolvente polar tiende a estabilizar los estados excitados, rebajando<br />
su nivel energético. De todas formas, si únicamente tuviera lugar este efecto, en<br />
ambas transiciones ocurrirían desplazamientos batocrómicos. Sin embargo, en el caso<br />
de las transiciones n—>π* se produce un aumento de solvatación del par de<br />
electrones no enlazados, lo cual rebaja la energía del orbital no enlazante en mayor<br />
medida que lo que disminuye la energía del orbital π*. En consecuencia, se produce un
Claudio González Pérez 17<br />
aumento de la energía requerida para la transición n—>π* y el consiguiente<br />
desplazamiento hipsocrómico.<br />
Bandas de transferencia de carga. Estas bandas se originan cuando se produce<br />
transferencia de electrones de una parte a otra de un sistema. Para ello es necesario<br />
que uno de sus componentes tenga características de dador de electrones y otro de<br />
aceptor. Como consecuencia de esta transferencia de electrones se origina un estado<br />
excitado que es el resultado de un proceso de oxidación-reducción interna. Así, por<br />
ejemplo, la absorción de un fotón por el complejo Fe(III)–SCN – da lugar a la<br />
transferencia de un electrón desde el tiocianato hasta uno de los orbitales del hierro,<br />
originándose una especie excitada consistente en Fe(II) y SCN neutro:<br />
Fe(III)–SCN– + hν —> Fe(II)–SCN<br />
Lo mismo que sucede con otros tipos de excitación electrónica, el electrón que ha<br />
experimentado la transferencia vuelve a su estado original, si bien, ocasionalmente<br />
puede tener lugar la disociación del estado excitado, teniendo lugar, en este caso, una<br />
reacción fotoquímica.<br />
Algunas moléculas orgánicas pueden originar bandas de absorción por<br />
transferencia de carga intramolecular:<br />
R<br />
C = O<br />
+ hν<br />
+<br />
R<br />
–<br />
= C — O<br />
Las bandas de absorción originadas por estos procesos de transferencia de carga<br />
son particularmente importantes en análisis químico, ya que muchos compuestos<br />
orgánicos e inorgánicos las presentan en el ultravioleta (a veces también en el visible)<br />
y las absortividades molares suelen ser muy altas (superiores a 10000), por lo cual se<br />
obtienen límites de detección muy bajos para estas especies.<br />
Bandas de campo ligando. El color que presentan muchos iones y compuestos de<br />
metales de transición normalmente se deben a absorciones denominadas de campo<br />
ligando (junto a éstas, suelen presentarse las intensas bandas de transferencia de<br />
carga anteriormente mencionadas). Estas absorciones suelen ser de baja intensidad y
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 18<br />
aparecen en la región visible, llegando en ocasiones hasta el ultravioleta próximo y el<br />
infrarrojo próximo.<br />
El origen de las bandas de campo ligando puede explicarse del siguiente modo: los<br />
cinco orbitales d de un átomo o un ión de un elemento de transición, cuya<br />
representación se muestra en la figura 3.8., en ausencia de un campo magnético o<br />
eléctrico externo están degenerados, no siendo necesaria la absorción de radiación<br />
para promover un electrón de un orbital a otro.<br />
Como puede verse en la figura 3.8., los orbitales dx2–y2 y dz2 están orientados<br />
según los ejes de coordenadas x, y y z. Estos orbitales forman el grupo eg. Por su<br />
parte, los orbitales dxy, dyz y dxz, llamados orbitales t2g, se orientan según las<br />
bisectrices a dichos ejes.<br />
Al formarse un complejo octaédrico entre el ión metálico y el agua, o algún otro<br />
ligando, los átomos dadores de los ligandos se aproximan al ión metálico central a lo<br />
largo de los ejes, por lo que habrá una mayor repulsión entre los electrones de los<br />
ligandos y los electrones de los orbitales eg del ion central, que entre los de los<br />
ligandos y los de los orbitales t2g.<br />
x<br />
x<br />
y<br />
z<br />
d xy<br />
y<br />
z<br />
d 2 2<br />
x –y<br />
x<br />
z<br />
d yz<br />
y<br />
x<br />
y<br />
z<br />
z<br />
d xz<br />
Figura 3.8. Representación esquemática de los cinco orbitales atómicos d.<br />
d z 2<br />
x<br />
y
Claudio González Pérez 19<br />
Como consecuencia de las repulsiones mencionadas, la aproximación de los seis átomos<br />
dadores (cargas puntuales) a lo largo de los ejes produce un campo eléctrico que<br />
elimina la degeneración existente en el grupo de orbitales d y los divide en dos grupos,<br />
los t2g con energía inferior y los eg con energía superior (figura 3.9.) *<br />
E<br />
d d d d 2 2<br />
xy xz yz x –y dz 2<br />
d 2 2<br />
x –y dz 2<br />
d xy d xz d yz<br />
∆ oct.<br />
Figura 3.9. Desdoblamiento de los orbitales d por efecto del campo ligando.<br />
La energía de separación entre los dos grupos, representada por ∆oct depende de<br />
las características del ión metálico (carga y número cuántico principal del orbital d) y<br />
del ligando (distribución de su densidad de carga y polarizabilidad). En este sentido,<br />
es posible ordenar los ligandos más comunes en orden creciente de ∆ (serie<br />
espectroquímica):<br />
I –
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 20<br />
y a este valor hay que adicionarle determinadas cantidades en función de la presencia<br />
de otras agrupaciones atómicas presentes en la molécula. En la tabla 3.2 se muestran<br />
dichas cantidades, correspondientes a algunos casos concretos.<br />
Tabla 3.2.<br />
Longitudes de onda de máxima absorción<br />
Dienos Bencenos Comp. carbonílicos Ac. y esteres<br />
conjugados monosutituidos –C=C–CO C=C–CHO<br />
insaturados<br />
λ base, nm 217 203 254 215 210 197<br />
Doble enlace<br />
adicional + 30 +45 +30 +30 +30<br />
Grupo alquilo +5 +20 +17<br />
Cl, Br +5 +7 +8<br />
— OH +7 +16<br />
—COOH<br />
—NH2<br />
+27 +19<br />
+27 +26<br />
α +10<br />
β +12<br />
γ +18<br />
α +35<br />
β +30<br />
γ +50<br />
α +10<br />
β +12<br />
γ +18<br />
α +35<br />
β +30<br />
γ +50<br />
Algunas consideraciones respecto al color<br />
Los cuerpos luminosos, como el Sol o una lámpara, emiten radiaciones en un amplio<br />
espectro que comprende muchas longitudes de onda. Aquellas longitudes de onda que<br />
están comprendidas entre unos 400 y 700 nm son capaces de afectar la retina del ojo<br />
humano y con ello dar origen a las impresiones subjetivas de la visión. Se hace mención<br />
de impresiones subjetivas, debido a que en la percepción del color influyen factores<br />
químicos, fisiológicos y físicos; de hecho, la respuesta humana al color varía de una<br />
persona a otra.<br />
Las personas que tienen una visión normal del color son capaces de correlacionar<br />
aproximadamente la longitud de onda de la radiación visible que llega al ojo con la<br />
subjetiva sensación del color, y éste, a veces se utiliza para designar ciertas porciones<br />
del espectro.<br />
+10
Claudio González Pérez 21<br />
Cuando incide radiación electromagnética visible sobre la materia puede ser<br />
absorbida total o parcialmente; si la absorción es total, el objeto aparece de color<br />
negro, y si se reflejan todas las radiaciones, de color blanco. Nosotros percibimos los<br />
objetos por medio de la luz emitida o reflejada, de forma que cuando la luz blanca<br />
(conteniendo todas las longitudes de onda) pasa a través de un medio que es<br />
transparente a ciertas longitudes de onda, pero que absorbe otras, para el observador<br />
ese medio aparece coloreado. Debido a que solo las radiaciones no absorbidas llegan al<br />
ojo, sus longitudes de onda indican el color del medio. Se dice que este color es<br />
complementario al color que se percibiría si la luz absorbida se pudiera detectar,<br />
debido a que la luz emitida y absorbida juntas forman la luz blanca original.<br />
Análogamente, los objetos de color que son opacos absorben algunas longitudes de<br />
onda y reflejan otras cuando son iluminadas por luz blanca. En la tabla 3.1. se indican<br />
los valores que corresponden a determinadas zonas del espectro visible.<br />
Tabla 3.1.<br />
Colores del espectro visible<br />
λ absorbida (nm) Color absorbido Color observado<br />
(complementario)<br />
380–420<br />
420–440<br />
440–470<br />
470–500<br />
500–520<br />
520–550<br />
550–580<br />
580–620<br />
620–680<br />
680–780<br />
violeta<br />
azul–violeta<br />
azul<br />
verde–azulado<br />
verde<br />
amarillo–verdoso<br />
amarillo<br />
anaranjado<br />
rojo<br />
púrpura<br />
INSTRUMENTACION<br />
amarillo-verdoso<br />
amarillo<br />
anaranjado<br />
rojo<br />
púrpura<br />
violeta<br />
azul–violeta<br />
azul<br />
verde–azulado<br />
verde<br />
El instrumento que normalmente se utiliza para medir la transmitancia o la<br />
absorbancia de una muestra en función de la longitud de onda es el<br />
espectrofotómetro. Antes de pasar a describir sus componentes básicos, es<br />
conveniente indicar algunos términos relacionados con la nomenclatura utilizada a<br />
propósito de la instrumentación en los métodos ópticos de análisis. Las definiciones
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 22<br />
que se indican no pueden considerarse universales, pero sí están en razonable acuerdo<br />
con el uso popular y son las que se utilizan en las principales obras dedicadas al tema * .<br />
FOTOMETRO: Cualquier dispositivo utilizado para medir la intensidad de<br />
radiación. Normalmente se utiliza para designar un instrumento sencillo provisto<br />
de filtros para seleccionar una banda de longitudes de onda y de una fotocélula o<br />
un fototubo para medir la intensidad de radiación.<br />
ESPECTROFOTOMETRO: Instrumento más sofisticado que posee un<br />
monocromador en lugar de filtros. Además, el sistema de detección normalmente<br />
es un fotomultiplicador, más sensible que una fotocélula.<br />
COLORIMETRO: Instrumento muy simple que compara, usando el ojo humano<br />
como detector, el color de la sustancia problema con el de una disolución patrón.<br />
(El nombre de colorímetro suele aplicarse en la práctica a cualquier instrumento<br />
apropiado para medir en la region visible, y, en realidad, así se conocen muchos<br />
fotómetros de filtro comerciales).<br />
ESPECTROSCOPIO: Aparato diseñado para detectar detectar líneas<br />
espectrales a simple vista. Su aplicación está restringida al análisis cualitativo y<br />
para elementos con líneas de emisión en la zona visible del espectro.<br />
ESPECTROGRAFO: Instrumento que registra líneas espectrales sobre una placa<br />
fotográfica.<br />
ESPECTROMETRO: Denominación general que se aplica a instrumentos que<br />
poseen sistemas de detección eléctricos.<br />
Según las definiciones anteriores, un espectrofotómetro es un espectrómetro<br />
que mide fotones. Su utilización suele limitarse, en la práctica, a la región<br />
untravioleta, visible e infrarroja.<br />
* Eugene D. Olsen. "Métodos Opticos de Análisis". Ed. Reverté. Barcelona.
Claudio González Pérez 23<br />
Los componentes básicos de un espectrofotómetro son: una fuente de radiación,<br />
un monocromador, que seleccione una banda estrecha de longitudes de onda, una<br />
cubeta, o recipiente que contenga la muestra, un detector de radiación y un sistema<br />
de tratamiento y lectura de la señal detectada (figura 3.10.)<br />
.<br />
Fuente de<br />
Filtro<br />
o<br />
radiación monocromador<br />
espejo<br />
Muestra<br />
Detector<br />
Referencia<br />
Figura 3.10. Espectrofotómetro de doble haz.<br />
Fuentes de radiación<br />
Medidor<br />
o<br />
registro<br />
Las fuentes de radiación utilizadas en espectrofotometría ultravioleta y visible<br />
deben ser continuas en una amplia zona del espectro, de intensidad elevada y ser<br />
esencialmente constante con la longitud de onda.<br />
En la zona ultravioleta y visible, la fuentes más utilizadas son de dos tipos:<br />
fuentes térmicas, basadas en la emisión de radiación por efecto de la temperatura, y<br />
fuentes cuya radiación se debe a descargas eléctricas producidas en el seno de gases.<br />
Entre las primeras, la más común es la lámpara de filamento de volframio. En<br />
condiciones ordinarias de operación, esta lámpara resulta útil entre unos 350 nm y<br />
unos 3000 nm. (figura 3.11.)<br />
Energia<br />
.<br />
deuterio<br />
visible<br />
volframio (- 3000ºK)<br />
200 400 700<br />
λ , nm<br />
Figura 3.11. Curvas de distribución espectral de las lámparas de deuterio y volframio.<br />
.
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 24<br />
Como puede observarse en la figura 3.11., la mayor parte de la energía emitida<br />
corresponde a la zona infrarroja. La distribución de la energía depende de la<br />
temperatura del filamento, la cual depende, a su vez, del voltaje; un incremento en la<br />
temperatura de operación aumenta la energía total emitida y desplaza el máximo de<br />
intensidad hacia longitudes de onda más cortas. Sin embargo, en la práctica, esto no<br />
se utiliza para obtener mayor cantidad de radiación ultravioleta, ya que se acorta<br />
considerablemente el tiempo de vida de la lámpara.<br />
Debido a que la radiación emitida depende únicamente del voltaje suministrado,<br />
éste tiene que ser muy estable, por lo cual los instrumentos llevan incorporado un<br />
sistema para la estabilización de la corriente. Por otra parte, el calor producido por la<br />
lámpara puede constituir un problema, por lo que, con frecuencia, en el lugar donde se<br />
coloca la lámpara se instala un ventilador con objeto de evitar el calentamiento de la<br />
muestra y de los demás componentes del instrumento.<br />
Por debajo de 350 nm, la potencia de una lámpara de volframio es inadecuada,<br />
debiéndose emplear una fuente diferente. La más común es una lámpara de descarga<br />
de hidrógeno, o de deuterio. Cuando se produce una descarga eléctrica entre dos<br />
electrodos en el seno de un gas, como hidrógeno, las colisiones entre los electrones de<br />
la descarga y las moléculas gaseosas provocan la excitación electrónica, vibracional y<br />
rotacional de dichas moléculas, con lo que se obtiene un espectro de líneas que es<br />
característico del gas, siempre que la presión sea baja. Al aumentar la presión, las<br />
líneas se ensanchan, llegando a superponerse, hasta que, a presiones relativamente<br />
altas (0.2–5 mm) se produce un espectro continuo.<br />
Tanto la lámpara de hidrógeno como la de deuterio tienen un intervalo de<br />
utilización comprendido entre 175 y 350 nm (figura 3.11.). También se utilizan con la<br />
misma finalidad la lámpara de descarga de xenon y la de vapor de mercurio.<br />
Finalmente, indicar que, puesto que el vidrio absorbe fuertemente a longitudes<br />
de onda inferiores a unos 350 nm, las lámparas de ultravioleta deben utilizar ventanas<br />
de cuarzo.
Claudio González Pérez 25<br />
Filtros y monocromadores<br />
La misión de los filtros y de los monocromadores es seleccionar un haz de<br />
radiación "monocromática" * . Con este fin se utilizan los siguientes dispositivos:<br />
De corte<br />
Absorción<br />
De banda<br />
Filtros<br />
Selección de la<br />
longitud de onda<br />
Interferencia<br />
Monocromadores<br />
Prismas<br />
Redes<br />
De transmisión<br />
De reflexión<br />
Los filtros de absorción se utilizan en la región visible y se basan en la absorción<br />
selectiva de ciertas longitudes de onda. Normalmente consisten en un vidrio coloreado<br />
o una suspensión de un colorante en gelatina que se coloca entre dos placas de vidrio.<br />
Los filtros de banda (figura 3.12. A) se caracterizan por su anchura de banda<br />
(anchura a la mitad de la altura) que puede oscilar entre 30 y 250 nm.<br />
100<br />
% T A (filtro verde)<br />
50<br />
anchura<br />
de banda<br />
B (filtro naranja)<br />
combinación de los dos filtros<br />
400 500 600 700 800<br />
λ, nm<br />
Figura 3.12. Transmitancia de algunos filtros.<br />
Los filtros de corte tienen transmitancias de casi el 100 % en una zona del<br />
espectro visible, pero luego disminuye rápidamente hasta un valor de transmitancia<br />
cero (figura 3.12.B). Por combinación de diferentes filtros pueden seleccionarse<br />
bandas espectrales relativamente estrechas (figura 3.12.).<br />
* La radiación monocromática es la radiación de una sola longitud de onda. Por supuesto, es imposible<br />
producir radiación monocromática verdadera, en sentido estricto. Sin embargo, cuanto mejor sea el<br />
monocromador, tanto más estrecho será el intervalo de longitudes de onda.
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 26<br />
Los filtros de interferencia consisten en un dieléctrico transparente<br />
(frecuentemente, fluoruro cálcico o magnésico) recubierto en ambos lados con dos<br />
finas capas de plata semirreflectante. (figura 3.13.)<br />
Figura 3.13. Filtro de interferencia.<br />
Cuando un haz de radiación incide sobre este dispositivo, una fracción atraviesa<br />
la primera capa metálica, mientras que la restante se refleja. La parte que ha pasado<br />
sufre una escisión similar al llegar a la segunda capa metálica. Si la parte reflejada en<br />
la segunda interacción es de longitud de onda adecuada, se refleja, en parte, desde la<br />
cara interior de la primera capa en fase con la radiación incidente de la misma longitud<br />
de onda. El resultado es que se refuerza esa determinada longitud de onda, mientras<br />
que la mayoría de las otras, fuera de fase, sufren una interferencia destructiva. Estos<br />
filtros proporcionan anchuras de banda menores y transmitancias de pico mayores que<br />
los filtros de absorción. Se dispone de filtros de interferencia para todas las zonas<br />
de las regiones ultravioleta y visible, así como parte del infrarrojo.<br />
Un monocromador se caracteriza por producir un haz de radiación de gran<br />
pureza espectral y permitir variar, de forma continua y en un amplio intervalo, la<br />
longitud de onda de la radiación. Los componentes básicos de un monocromador son<br />
una rendija de entrada, que selecciona un haz de radiación policromática entrante, un<br />
elemento dispersante, prisma o red, que dispersa la radiación en sus longitudes de<br />
onda individuales, y una rendija de salida, que aísla la banda espectral deseada (figura<br />
3.14.)<br />
La dispersión de radiación por un prisma se basa en el fenómeno de la refracción;<br />
esto es, el cambio de dirección que experimenta un haz de radiación al pasar de un<br />
medio a otro con distinto índice de refracción. El grado de desviación depende de la<br />
longitud de onda; así, los azules se desvían más que los rojos.
Claudio González Pérez 27<br />
El material de que está construido el prisma depende del tipo de radiación a<br />
dispersar; en la región visible se usan prismas de vidrio, mientras que en el<br />
ultravioleta es necesario usarlos de cuarzo.<br />
rendija<br />
de entrada<br />
λ +λ<br />
1 2<br />
.<br />
λ1<br />
λ 2<br />
rendija<br />
de salida<br />
Figura 3.14. Dispersión de radiación por un prisma.<br />
Los prismas presentan las ventajas de su gran pureza espectral (no hay órdenes<br />
de dispersión superiores, como en las redes), mientras que el principal inconveniente<br />
reside en que la dispersión no es lineal; esto es, las longitudes de onda no se dispersan<br />
de manera uniforme: es mayor para las longitudes de onda más cortas.<br />
Las redes de reflexión * , que son las más utilizadas, consisten en una superficie<br />
dura, pulida, sobre la que se ha grabado un gran número de surcos paralelos y muy<br />
próximos entre sí (entre 300 y 2000 surcos por milímetro para las regiones<br />
ultravioleta y visible).<br />
Figura 3.15. Difracción de radiación por una red de reflexión.<br />
Cuando un haz de radiación incide sobre una red de reflexión con un ángulo i<br />
(figura 3.15.) se refleja según un ángulo φ, diferente del incidente. En la Figura 3.15.<br />
se muestran los haces paralelos 1 y 2. La máxima interferencia constructiva entre<br />
ambos se produce cuando la diferencia de caminos recorridos por ellos sea un múltiplo<br />
entero de la longitud de onda, y esta diferencia es AB – CD. Los segmentos AB y CD<br />
pueden expresarse en función de d y de los ángulos i y .<br />
* Tambien existen las redes de transmisión, que normalmente se construyen trazando una serie de surcos<br />
paralelos sobre una placa de vidrio, con una punta de diamante.
por lo cual,<br />
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 28<br />
AB = d sen i CD = – d sen φ **<br />
nλ = d (sen i + sen φ)<br />
donde n, número entero, se denomina orden de difracción.<br />
Según la ecuación anterior, existen distintos valores de λ para unos<br />
determinados ángulos i y φ, por lo que junto con la línea de primer orden (n=1)<br />
aparecen líneas de órdenes superiores. Ordinariamente, la línea de primer orden es la<br />
más intensa. Las líneas de órdenes superiores pueden eliminarse mediante filtros.<br />
El fenómeno de la difracción de una radiación policromática por una red se<br />
representa esquemáticamente en la figura 3.16. Para seleccionar la radiación de una<br />
determinada longitud de onda, se hace girar la red hasta hacer que la radiación que<br />
interesa coincida con la rendija de salida, eliminando los órdenes superiores mediante<br />
filtros.<br />
1<br />
800<br />
er orden<br />
600<br />
2º orden<br />
400<br />
400<br />
200<br />
3<br />
267<br />
er orden<br />
300<br />
200<br />
200<br />
radiación incidente<br />
(200–800 nm)<br />
Figura 3.16. Difracción de una radiación policromática por una red.<br />
En cuanto a la anchura de rendija de salida debe tenerse en cuenta lo siguiente: a<br />
medida que disminuye la anchura de rendija se reduce la anchura de banda, siendo<br />
posible aumentar la resolución, pero solo hasta un cierto límite, ya que, a partir de un<br />
determinado valor, la difracción por la propia rendija comienza a ser apreciable.<br />
Además, es necesario considerar que al disminuir la anchura de rendija, disminuye<br />
también la intensidad del haz de radiación, por lo que hay que tener en cuenta la<br />
sensibilidad del detector, la cual puede limitar el estrechamiento de la rendija.<br />
** El signo menos indica que el ángulo de reflexión, φ, cae en el lado opuesto al ángulo de incidencia, i.
Claudio González Pérez 29<br />
En resumen, y comparando con los prismas, las redes de difracción presentan las<br />
ventajas de su elevada resolución, dispersión lineal y pocas pérdidas de radiación por<br />
absorción. Posiblemente, el mayor inconveniente esté relacionado con la presencia de<br />
órdenes de difracción superiores.<br />
Recipientes para las muestras<br />
En espectrofotometría analítica, casi siempre se trabaja con disoluciones, por lo<br />
cual la mayoría de los recipientes para las muestras son celdas o cubetas para colocar<br />
líquidos en el haz del espectrómetro. Estos recipientes deben estar fabricados con un<br />
material que permita el paso de radiación de la región espectral de interés. Así, el<br />
vidrio puede emplearse entre 350 y 2000 nm, mientras que en la región ultravioleta se<br />
necesita cuarzo o sílice fundida (ambas sustancias también son transparentes en la<br />
región visible).<br />
En algunos instrumentos baratos se utilizan a veces tubos de ensayo cilíndricos<br />
como recipientes para las muestras. Es importante que estos tubos siempre se<br />
coloquen igual, para lo que se marcan en un lado, y la marca siempre se pone en la<br />
misma dirección cuando se coloca el tubo en el compartimento de cubetas del<br />
instrumento.<br />
Las celdas se deben llenar de tal forma que el haz de radiación pase a través de<br />
la disolución, con el menisco por encima del haz. Las celdas típicas para las regiones<br />
ultravioleta y visible tienen 1 cm de paso óptico, si bien existe una gran variedad en<br />
cuanto a tamaño, forma y otras peculiaridades, como se muestra en la figura 3.17.<br />
.<br />
estándar<br />
(1 cm)<br />
cilíndrica<br />
de flujo térmica<br />
Figura 3.17. Celdas para espectrofotometría.<br />
.<br />
microcelda<br />
2 cm<br />
.
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 30<br />
Detectores<br />
Los detectores usados en espectrofotometría ultravioleta y visible son<br />
transductores que convierten la energía radiante en una señal eléctrica * . Un detector<br />
ideal deberá presentar las características siguientes:<br />
* Sensibilidad elevada en la región espectral de interés.<br />
* Respuesta lineal para la energía radiante.<br />
* Tiempo de respuesta pequeño.<br />
* Utilizable en un amplio intervalo de longitudes de onda.<br />
* Elevada relación señal/ruido.<br />
* Mínima señal de salida en ausencia de radiación.<br />
* Buena disponibilidad para la amplificación.<br />
Sin embargo, no existe el detector ideal, por lo que en la práctica, se evalúan<br />
todos los factores anteriores y se selecciona algún detector que resulte adecuado al<br />
caso. Los más utilizados son: células fotovoltaicas, fototubos y tubos<br />
fotomultiplicadores.<br />
Células fotovoltaicas. Consisten en una placa de hierro, que actúa de electrodo<br />
positivo, sobre la que se deposita una fina capa de un material semiconductor, como<br />
selenio, y éste se recubre de una capa muy fina de oro o plata, que actúa como<br />
segundo electrodo o electrodo colector (figura 3.18.)<br />
Plata<br />
Hierro<br />
Figura 3.18. Célula fotovoltaica.<br />
( )<br />
Selenio<br />
Cuando la radiación electromagnética incide sobre el selenio, se promocionan<br />
electrones a las bandas de conducción, haciendo que pasen electrones desde la<br />
superficie del selenio hasta el electrodo colector de plata, produciéndose un aumento<br />
de la conductividad proporcional al número de fotones que inciden sobre la superficie<br />
del semiconductor.<br />
Las células fotovoltaicas presentan las siguientes características: son sencillas<br />
de construir, relativamente baratas y no requieren una fuente de energía externa, por<br />
lo que pueden conectarse directamente a un galvanómetro o un amperímetro. En<br />
cuanto a los inconvenientes, su uso limitado a la región visible (su máxima sensibilidad<br />
* En espectrofotometría infrarroja suelen utilizarse detectores térmicos, que responden al calor.<br />
( )
Claudio González Pérez 31<br />
se presenta hacia los 550 mn, mientras que la respuesta a 350 y a 750 nm disminuye<br />
hasta un 10 % de la máxima), presentan dificultades para la amplificación, y<br />
fenómenos de fatiga, de forma que la corriente de salida disminuye gradualmente con<br />
el tiempo.<br />
Fototubos. Consisten en un cátodo semicilíndrico recubierto interiormente de un<br />
material fotosensible, y un ánodo, en el interior de un recipiente en el que se ha hecho<br />
el vacío (figura 3.19.).<br />
hν<br />
(+)<br />
.<br />
(–)<br />
e –<br />
.<br />
Figura 3.19. Fototubo.<br />
Cuando la radiación incide sobre el cátodo, se produce una emisión de<br />
fotoelectrones que se dirigen al ánodo, originándose una corriente que posteriormente<br />
se amplifica. La emisión de electrones depende de la naturaleza de la superficie del<br />
cátodo y de la frecuencia de la radiación. En el comercio existen fototubos que<br />
difieren en el material con el que está construida la superficie del cátodo, siendo, por<br />
tanto, diferente su respuesta a la radiación de diversas frecuencias.<br />
Muchos espectrofotómetros están provistos de detectores intercambiables que<br />
permiten mantener una buena respuesta en un amplio margen de longitudes de onda.<br />
En general, puede concluirse que los fototubos son más sensibles que las células<br />
fotovoltaicas, por la posibilidad de poder amplificar la corriente inicialmente<br />
generada.<br />
Tubos fotomultiplicadores. Este tipo de detector consiste en un cátodo<br />
fotosensible y una serie de electrodos (dínodos), cada uno a un potencial menos<br />
negativo que el que le precede (figura 3.20.)
hν<br />
C<br />
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 32<br />
–550 V.<br />
–600 V. –500 V.<br />
C: càtodo<br />
dínodos<br />
Figura 3.20. Tubo fotomultiplicador.<br />
A<br />
A: ánodo<br />
La radiación que llega al fotocátodo provoca la emisión de electrones primarios,<br />
que son acelerados hasta el primer dínodo. Al incidir en él, cada fotoelectrón origina la<br />
emisión de varios electrones adicionales; éstos, a su vez, son acelerados hasta el<br />
dínodo 2, y así sucesivamente, hasta que al final, la corriente así producida se recoge<br />
en el ánodo, se amplifica electrónicamente y se mide. Normalmente, los tubos<br />
fotomultiplicadores contienen 9 ó 10 dínodos, los cuales originan de 10 6 a 10 7<br />
electrones por cada fotón.<br />
Este sistema de detección se caracteriza por su respuesta rápida y elevada<br />
sensibilidad. El límite de detección viene condicionado por el ruido de fondo que se<br />
origina como consecuencia de la emisión termoiónica, la cual puede reducirse<br />
enfriando. De hecho, estas corrientes pueden eliminarse virtualmente enfriando el<br />
detector a –30 ºC, si bien esto no se lleva a cabo en el trabajo espectrofotométrico<br />
ordinario.<br />
INSTRUMENTOS DE HAZ SENCILLO Y DE HAZ DOBLE<br />
Las medidas de absorción de radiación ultravioleta y visible son, por su propia<br />
naturaleza, de carácter relativo; debe de compararse, continuamente, la absorción de<br />
la muestra, conteniendo el analito, con la de una referencia o blanco conteniendo las<br />
mismas especies que la muestra, excepto el analito. En los instrumentos de haz<br />
sencillo hay solamente un haz de radiación que, después de pasar a través de la<br />
muestra llega al detector. De esta forma, para comparar la absorción del blanco, debe<br />
sustituir éste a la muestra en cada lectura, lo cual implica varios segundos entre cada<br />
medida.<br />
Alternativamente, la muestra y la referencia pueden compararse varias veces por<br />
segundo usando un instrumento de doble haz. En él, (figura 3.10.) la radiación pasa
Claudio González Pérez 33<br />
alternativamente a través de la muestra y de la referencia, lo cual se lleva a cabo<br />
mediante un motor que hace girar un espejo ("chopper") dentro y fuera de la<br />
trayectoria de la radiación. Cuando el espejo obturador intermitente no desvía el haz,<br />
éste pasa a través de la muestra y el detector mide la potencia radiante P. Cuando<br />
dicho espejo desvía el haz a través de la celda de referencia, el detector mide Po. De<br />
esta forma la radiación es desviada varias veces por segundo, y el circuito compara<br />
automáticamente P y Po para obtener la absorbancia.<br />
La operación con el sistema de doble haz presenta, fundamentalmente, las dos<br />
ventajas siguientes: la comparación muy rápida de muestra y referencia ayuda a<br />
eliminar errores debidos a fluctuaciones en la intensidad de la fuente y del detector,<br />
inestabilidad electrónica y cambios en el sistema óptico. Por otra parte, se facilita la<br />
posible automatización.<br />
APLICACIONES<br />
En principio, cualquier especie química que absorba radiación electromagnética en<br />
las regiones ultravioleta o visible es susceptible de poder ser determinada por<br />
técnicas espectrofotométricas. El mayor campo de aplicación se encuentra en el<br />
análisis cuantitativo, siendo la espectrofotometría una de las herramientas más<br />
usadas.<br />
Análisis cualitativo<br />
Los espectros de absorción ultravioleta y visible son, en general, menos útiles con<br />
fines cualitativos que los espectros en la región infrarroja, debido a que en aquellos<br />
las bandas son más anchas y, por consiguiente, menos características.<br />
La identificación de un compuesto puro requiere la comparación empírica de los<br />
detalles del espectro (máximos, mínimos y puntos de inflexión) de la sustancia<br />
problema con los del compuesto puro. Además, la intensidad de la absorción,<br />
expresada en términos de la absortividad molar, ε, se usa con frecuencia como<br />
criterio adicional para la identificación, sobre todo si ε tiene un valor elevado a<br />
determinadas longitudes de onda.<br />
Cuando se trata de identificar sustancias orgánicas, es conveniente operar en<br />
fase de vapor y a presión baja, ya que en estas condiciones, el espectro observado es
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 34<br />
debido a moléculas aisladas y, generalmente es posible resolver la estructura fina<br />
vibracional y rotacional, lo que proporciona detalles característicos para la<br />
identificación. En disolución y, sobre todo, en presencia de disolventes polares como el<br />
agua, alcoholes, ésteres y cetonas, las moléculas no se encuentran aisladas, sino<br />
solvatadas, como consecuencia de lo cual se limita la rotación. Además, los campos del<br />
disolvente pueden modificar de forma irregular los niveles de energía vibracionales y,<br />
cuando el número de moléculas es grande, los niveles de energía son poco definidos,<br />
obteniendose como resultado la aparición de una banda.<br />
Una de las pocas sustancias orgánicas con espectro de absorción característico<br />
en disolución es el benceno. Su espectro se usa frecuentemente en test de<br />
especificaciones de pureza, donde el contenido en benceno debe ser cuidadosamente<br />
controlado, por ejemplo, en alcohol absoluto o en ciclohexano.<br />
Aun cuando la identificación de un compuesto orgánico de forma inequívoca con<br />
este técnica, no es posible normalmente, el espectro de absorción en las regiones<br />
ultravioleta y visible puede ser de utilidad para la detección de ciertos grupos<br />
funcionales. Así, por ejemplo, la presencia de una banda débil entre 280 y 290 nm, que<br />
se desplaza hacia menores longitudes de onda al aumentar la polaridad del disolvente,<br />
indica la presencia de un grupo carbonilo. De cualquier forma, y para mayor seguridad,<br />
estos datos deben usarse siempre en combinación con los obtenidos a partir de<br />
espectros infrarrojos, de resonancia magnética nuclear o cualquier otra información<br />
analítica de que se disponga. En resumen, el espectro de absorción ultravioleta y<br />
visible no es una prueba infalible de la identidad de una especie química, pero sí<br />
representa otra herramienta disponible para aplicarla de forma inteligente.<br />
En cuanto a sustancias inorgánicas, casi las únicas que tienen espectro de<br />
absorción ultravioleta y visible característico son los iones trivalentes de las tierras<br />
raras. De hecho, el Ho2O3 se utiliza en ocasiones para comprobar el calibrado de la<br />
longitud de onda de algunos instrumentos.<br />
Análisis cuantitativo<br />
Ya se ha comentado que la espectrofotometría de absorción ultravioleta y visible<br />
es una de las técnicas más usadas en análisis cuantitativo. Se ha estimado que solo en<br />
el campo biosanitario, un 95 % de las determinaciones cuantitativas se llevan a cabo<br />
por espectrofotometría * .<br />
* Douglas A. Skoog y James J. Leary. "Análisis Instrumental". Ed. Mc Graw–Hill. Madrid (1993)
Claudio González Pérez 35<br />
En relación con los métodos clásicos de análisis (gravimétricos y volumétricos),<br />
los métodos espectrofotométricos son menos exactos, si bien su mayor sensibilidad<br />
(10 –4 –10 –6 M) y rapidez los hace competir ventajosamente con aquellos en muchas<br />
ocasiones. La precisión puede considerarse aceptable, ya que, normalmente se<br />
obtienen incertidumbres relativas entre 1 y 2 %, aunque con determinadas<br />
precauciones pueden reducirse considerablemente.<br />
La base de la aplicación de los métodos espectrofotométricos al análisis<br />
cuantitativo es la ley de Beer. El procedimiento a seguir para llevar a cabo una<br />
determinación analítica consta de una serie de etapas encaminadas a establecer las<br />
condiciones de trabajo y la preparación de la curva de calibrado.<br />
a) Selección de la longitud de onda. Las medidas de absorbancia se llevan a<br />
cabo normalmente a la longitud de onda correspondiente al máximo de absorción,<br />
ya que de esta forma se obtienen máximas sensibilidades. Por otra parte, en esa<br />
zona, la curva espectral suele ser bastante plana, por lo que el cumplimiento de la<br />
ley de Beer es normalmente satisfactorio (ver anteriormente: "Uso de radiación<br />
no monocromática" en las "Desviaciones de la ley de Beer").<br />
A veces no es posible operar a la longitud de onda del máximo de absorbancia<br />
cuando a esa longitud de onda absorbe apreciablemente alguna especie (distinta<br />
del analito) presente, incluso, en ocasiones, el propio reactivo.<br />
b) Preparación de las muestras para el análisis. Muchos compuestos orgánicos<br />
absorben en la región ultravioleta y el tratamiento de la muestra solo implica la<br />
separación de las posibles interferencias. Por otra parte, algunos elementos<br />
inorgánicos absorben intensamente en la región visible, pero solo en ciertos<br />
estados de oxidación. En estos casos, una etapa previa (además de la disolución si<br />
se trata de muestras sólidas) debe incluir un proceso redox para llevar el<br />
elemento al estado de oxidación adecuado. Así, por ejemplo, el manganeso se<br />
determina frecuentemente en forma de permanganato, previa oxidación con<br />
persulfato:<br />
2 Mn 2+ + 5 S2O8 2– + 8 H2O —> 2 MnO4 – + 10 SO4 2– + 16 H +<br />
La disolución violeta de permanganato presenta un máximo de absorbancia a 525<br />
nm.<br />
En otras ocasiones es posible desarrollar un color por medio de reactivos<br />
orgánicos o inorgánicos. Así, por ejemplo, el Fe 3+ puede determinarse mediante el
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 36<br />
color rojo de los complejos formados con SCN – ; el Ni 2+ por el color rosa de su<br />
quelato con dimetilglioxima, etc.<br />
En relación con estudios medioambientales, es importante la determinación de<br />
SO2 en el aire, para lo cual suele utilizarse pararosanilina como reactivo,<br />
midiendo a 560 nm la absorbancia del compuesto rojo obtenido. Asimismo, la<br />
determinación rutinaria de amoniaco, nitritos y nitratos en aguas para consumo<br />
público suele hacerse espectrofotométricamente. Para el amoniaco se utiliza el<br />
reactivo de Nessler, operando en presencia de AEDT para evitar las<br />
interferencias de Ca, Mg y Al, mientras que para el nitrito suele utilizarse la<br />
clásica reacción de diazotación con aminas aromáticas y posterior reacción con<br />
ácido naftilamino-7-sulfónico, midiendo la absorbancia a 520 nm. Por su parte, el<br />
nitrato se reduce previamente a nitrito y se determina éste por el procedimiento<br />
indicado anteriormente. Estas especias, NH3, NO3 – y NO2 – pueden representar<br />
peligro para la salud cuando están presentes en aguas de consumo a niveles<br />
superiores a 500, 50 y 0.1 g/mL respectivamente.<br />
La formación de especies absorbentes mediante el uso de reactivos adecuados<br />
hace necesario considerar toda una serie de factores, entre los que cabe<br />
mencionar:<br />
pH. Esta variable suele jugar un papel muy importante en las reacciones de formación de<br />
complejos. La importancia del pH y su influencia sobre los iones metálicos y los ligandos se<br />
discute detalladamente en las obras que tratan el tema correspondiente a equilibrios en<br />
disolución.<br />
Concentración de los reactivos. Previamente a cualquier nueva determinación<br />
espectrofotométrica es necesario establecer los márgenes de concentraciones adecuados de los<br />
reactivos, ya que cantidades demasiado grandes o demasiado pequeñas pueden originar<br />
desviaciones de la ley de Beer.<br />
Tiempo adecuado para la medida. Cuando la especie absorbente es estable y su formación es<br />
rápida, no es necesario controlar el tiempo al que realizar las medidas, mientras que si se<br />
incumple alguna de las premisas anteriores, esta variable será necesario tomarla en<br />
consideración.<br />
Temperatura. Determinadas reacciones requieren operar a temperatura elevada para aumentar<br />
la cinética de formación de un determinado complejo. En estas ocasiones la temperatura de<br />
trabajo deberá especificarse en el procedimiento.<br />
Orden de adición de los reactivos. A veces, es importante añadir los reactivos según una<br />
determinada secuencia. Por ejemplo, la determinación de cobalto mediante la formación del<br />
complejo entre Co(III) y nitrilotriacetato implica la formación previa del correspondiente
Claudio González Pérez 37<br />
complejo con Co(II), por lo cual el peróxido de hidrógeno (oxidante) debe añadirse en último<br />
lugar.<br />
Eliminación de interferencias. Existen muy pocas reacciones que sean totalmente específicas,<br />
por lo que en muchas ocasiones es necesario eliminar las interferencias de determinadas<br />
especies, lo cual muy frecuentemente se consigue por enmascaramiento.<br />
Extracción con disolventes orgánicos. La eliminación de sustancias interferentes puede llevarse<br />
a cabo en ocasiones mediante extracción con algún disolvente orgánico inmiscible con el agua,<br />
aunque tambien puede recurrirse a esta técnica cuando la especie absorbente es poco soluble en<br />
agua.<br />
Concentración de sales. Altas concentraciones de electrólitos influyen frecuentemente sobre la<br />
absorción de determinados compuestos, debido a la formación de asociaciones iónicas que<br />
originan desplazamientos del máximo de absorbancia.<br />
Los efectos de las variables mencionadas deben conocerse y, en consecuencia,<br />
escogerse un conjunto de condiciones de trabajo de forma que la absorbancia no<br />
sea afectada apreciablemente por pequeñas variaciones incontroladas en sus<br />
magnitudes.<br />
c) Determinación de la relación absorbancia–concentración. Una vez conocida<br />
la absorbancia de una determinada especie, en principio, se podría obtener la<br />
concentración a partir de la ley de Beer: A = ε b C. Sin embargo, como se<br />
comentó, no es prudente asumir el cumplimiento de dicha ley y utilizar un solo<br />
patrón para determinar la absortividad molar, ε. Asimismo, tampoco es<br />
conveniente basar los resultados de un análisis en un valor de la bibliografía para<br />
obtener ε. Por ello, el método normal de trabajo consiste en la preparación de un<br />
calibrado a partir de una serie de disoluciones patrón, preparadas en las mismas<br />
condiciones que la muestra y obtener los resultados por interpolación.<br />
Cuando se trata de analizar materiales complejos, es muy difícil, si no imposible,<br />
reproducir en los patrones las condiciones de las muestras. En estas ocasiones<br />
suele ser de utilidad el método de adición estándar, con objeto de<br />
contrarrestar los efectos de la matriz. Este método, en análisis<br />
espectrofotométrico, se suele aplicar de la siguiente manera: a varias alícuotas<br />
idénticas de la muestra se adicionan volúmenes variables de una disolución<br />
estándar del analito, de concentración conocida. Se añaden entonces los<br />
reactivos correspondientes al método empleado y cada disolución se enrasa a un
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 38<br />
volumen fijo, antes de medir la absorbancia * . Si se cumple la ley de Beer, los<br />
datos se representan como en la figura 3.21., a partir de la cual se obtiene el<br />
punto de corte de la recta (obtenida, si es necesario, por ajuste por mínimos<br />
cuadrados) con el eje horizontal y, a partir de ahí la concentración de la muestra<br />
original.<br />
0.6<br />
A<br />
0.4<br />
0.2o<br />
o<br />
o<br />
0 5.0 10.0 15.0<br />
V, ml<br />
Figura 3.21. Método de adición estándar para análisis espectrofotométrico.<br />
Análisis de mezclas de sustancias absorbentes<br />
Cuando en una disolución hay varias sustancias que absorben radiación, es posible,<br />
en muchos casos, llevar a cabo su determinación sin necesidad de separar previamente<br />
los distintos componentes. Se va a considerar el caso de que la muestra esté<br />
constituida por los componentes M y N. La forma de proceder depende de los<br />
espectros de absorción de ambas especies, y pueden presentarse los siguientes casos:<br />
Espectros no superpuestos. En estas ocasiones, como se muestra en la figura<br />
3.22, es posible encontrar algunas longitudes de onda a las que absorba solo una<br />
de las especies; λ1 para determinar M y λ2 para determinar N.<br />
A<br />
M<br />
λ1 λ2<br />
Figura 3.22. Análisis de mezclas. Espectros no superpuestos.<br />
* Cuando la cantidad de muestra es limitada, las adiciones estándar pueden llevarse a cabo por sucesivas<br />
adiciones de incrementos de una disolución patrón de concentración conocida a una única alícuota del<br />
problema. Las medidas de la absorbancia se hacen en el original y despues de cada adición.<br />
o<br />
N
Claudio González Pérez 39<br />
Espectros superpuestos parcialmente. Cuando la situación es como se muestra<br />
en la figura 3.23., la especie N no interfiere en la medida de M a la longitud de<br />
onda λ1, por lo que la determinación de esta especie puede hacerse directamente<br />
a λ1. A continuación se determina la absorbancia de M a la longitud de onda λ2 a<br />
partir de la absortividad molar (en una experiencia previa) y finalmente, se resta<br />
esta contribución de la absorbancia medida a λ2. Con ello se obtiene la<br />
absorbancia del componente N, cuya concentración se calcula posteriormente de<br />
la forma acostumbrada.<br />
A<br />
λ1<br />
M<br />
M+N<br />
Figura 3.23. Análisis de mezclas. Superposición parcial de espectros.<br />
Espectros completamente superpuestos. Como se indica en la figura 3.24. no es<br />
posible encontrar una longitud de onda en la que M y N absorban de forma<br />
exclusiva.<br />
A<br />
λ 1<br />
M<br />
M+N<br />
N<br />
Figura 3.24. Análisis de mezclas. Superposición completa de espectros.<br />
λ 2<br />
N<br />
λ2
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 40<br />
En este caso, el problema se resuelve midiendo las absorbancias A1 y A2 a las<br />
longitudes de onda λ1 y λ2 respectivamente, y planteando las ecuaciones<br />
siguientes:<br />
A1 = εM1 b CM + εN1 b CN (a λ1)<br />
A2 = εM2 b CM + εN2 b CN (a λ2)<br />
Esto es posible porque la ley de Beer establece que la absorbancia es una<br />
propiedad aditiva, de forma que la absorbancia total de una disolución a una<br />
longitud de onda dada es igual a la suma de las absorbancias de los componentes<br />
individuales presentes.<br />
En las ecuaciones anteriores, b representa el camino óptico y εM1, εM2, εN1 y εN2<br />
las absortividades molares de M y N a las longitudes de onda λ1 y λ2, que deben<br />
ser determinadas previamente a partir de disoluciones patrón, o mejor, a partir<br />
de las pendientes de sus representaciones de la ley de Beer.<br />
Esta forma de proceder es válida solo si se cumple la ley de Beer y si los dos<br />
componentes se comportan independientemente uno del otro. La mayor precisión<br />
se alcanza cuando se eligen longitudes de onda en las que las diferencias entre<br />
las absortividades molares sean grandes: a λ1, εM grande y εN pequeña, y a λ2, εM<br />
pequeña y εN grande. Sin embargo, no todos los sistemas se comportan de este<br />
modo. Puede ocurrir que exista solapamiento a todas las longitudes de onda y que,<br />
para cada λ, εM>εN. Un procedimiento alternativo para analizar estas muestras<br />
consiste en un método gráfico, cuyo fundamento es el siguiente: la primera de las<br />
ecuaciones anteriores puede escribirse así:<br />
A1 ε M1 b =CM + ε N1<br />
CN ε M1<br />
En lugar de medir A, εM y εN solamente a dos longitudes de onda, se miden estas<br />
magnitudes a varias, para lo cual es necesario disponer de los espectros<br />
correspondientes a los componentes puros y a la mezcla desconocida. Para un<br />
cierto número de medidas, se representan gráficamente los valores de A/εM b<br />
frente a εN/εM, obteniéndose una línea recta. La pendiente de la recta permite<br />
obtener CN y la ordenada en el origen, CM. El método puede extenderse con<br />
facilidad a sistemas de tres componentes. La principal ventaja del método es que<br />
el uso de múltiples puntos a lo largo de todo el espectro, en lugar de utilizar<br />
solamente dos, permite alcanzar un grado superior de precisión y exactitud.
Claudio González Pérez 41<br />
Valoraciones fotométricas<br />
En las valoraciones convencionales, el punto de equivalencia se detecta por medio<br />
de la observación visual del cambio de color, ya sea inherente a uno de los reactivos<br />
(por ejemplo, el permanganato) o producido por un indicador. Los operadores con vista<br />
normal, en condiciones favorables, obtienen fácilmente una precisión de unas cuantas<br />
décimas por ciento. Sin embargo, es difícil o imposible obtener buenos resultados en<br />
casos donde el cambio de color es gradual, o donde los colores de las dos formas no<br />
contrastan claramente. En estos casos puede detectarse el punto final<br />
fotométricamente.<br />
En las valoraciones fotométricas se miden las cambios de absorbancia de una<br />
disolución durante la valoración. Estos cambios de absorbancia indican cambios en la<br />
concentración de alguna especie absorbente de radiación. Para llevar a cabo esta<br />
técnica, el recipiente de valoración puede colocarse directamente en el camino óptico<br />
del instrumento, si bien, esto requiere normalmente alguna modificación del<br />
compartimento de la muestra. Por ello, lo más corriente es la utilización de células de<br />
flujo. La absorbancia medida, a la longitud de onda óptima, después de cada adición de<br />
valorante, se representa frente al volumen de reactivo.<br />
Las curvas de valoración consisten, si la reacción es completa, en dos líneas<br />
rectas que se cortan en el punto final. Para las que son apreciablemente incompletas<br />
se produce una curvatura en las proximidades del punto de equivalencia. En estos<br />
casos, el punto final se obtiene por prolongación de los dos tramos rectos. En la figura<br />
3.25. se muestra la forma de algunas curvas de valoración fotométrica.<br />
La curva a) es típica de la valoración donde solo absorbe el reactivo valorante,<br />
como en la valoración de As(III) con BrO3 –—Br – leyendo la absorbancia a la longitud<br />
de onda del bromo. La curva b) es característica de sistemas donde absorbe el<br />
producto de la reacción; por ejemplo, en la valoración de Cu(II) con AEDT. Por otra<br />
parte, cuando el analito se convierte en una especie no absorbente, se obtiene la curva<br />
c). Este es el caso, por ejemplo, de la valoración de p-toluidina en butanol con ácido<br />
perclórico, midiendo a 290 nm. Cuando un analito coloreado se transforma en un<br />
producto incoloro al tratar con un reactivo valorante que también absorbe, se<br />
obtienen curvas como la d). Finalmente, las curvas e) y f) pueden representar la<br />
adición de ligandos para formar dos complejos sucesivos de diferente absortividad.
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 42<br />
Figura 3.25. Curvas de valoraciones fotométricas.<br />
En la figura 3.26. se muestra la curva de valoración fotométrica de una mezcla de<br />
Bi(III) y Cu(II) con AEDT.<br />
A<br />
Punto final<br />
del Bi<br />
Punto final<br />
del Cu<br />
vol. de AEDT<br />
Figura 3.26. Valoración de una mezcla de Bi(III) y Cu(II) con AEDT.<br />
A la longitud de onda de medida (745 nm), ninguno de los cationes ni el reactivo<br />
absorben, así como tampoco el complejo Bi(III)—AEDT. Este complejo es más estable<br />
que el de Cu(II)—AEDT y se forma en la primera parte de la valoración. Cuando se ha<br />
terminado de formar el complejo Bi(III)—AEDT, comienza la formación del complejo<br />
de Cu(II), aumentando la absorbancia hasta que éste se forma completamente. Se<br />
obtienen dos puntos finales bien definidos.
Claudio González Pérez 43<br />
Las valoraciones fotométricas presentan las siguientes ventajas sobre las<br />
convencionales:<br />
* Con ellas es posible la determinación de sustancias no absorbentes, puesto que<br />
solo es necesario que absorba alguna de estas tres especies: reactivo valorante,<br />
sustancia a valorar o producto de la reacción.<br />
* La presencia de otras sustancias que absorban a la longitud de onda a la que se<br />
mide no origina necesariamente interferencia, ya que solo importa el cambio que<br />
se observa en los valores de la absorbancia.<br />
* Los datos experimentales que realmente interesan se toman muy alejados del<br />
punto de equivalencia. De esta forma, las reacciones empleadas no necesitan<br />
tener constantes de equilibrio tan favorables como las requeridas para una<br />
valoración convencional, que depende de observaciones cerca del punto de<br />
equivalencia. Por la misma razón pueden utilizarse disoluciones más diluidas.<br />
Determinación de constantes de disociación de ácidos y bases.<br />
La determinación espectrofotométrica de constantes de disociación de ácidos y<br />
bases se basa en que el espectro de absorción de moléculas orgánicas con grupos<br />
funcionales ácidos o básicos depende del pH del medio.<br />
Para un ácido débil,<br />
HA A – +H +<br />
pK a =pH+log HA<br />
A –<br />
K a = A– H +<br />
HA<br />
Para determinar el valor de pKa es necesario conocer el pH y las concentraciones<br />
(en sentido estricto, las actividades) de las formas ácida (HA) y básica (A –). La<br />
relación [HA]/[A – ] puede obtenerse espectrofotométricamente si se conocen las<br />
correspondientes absortividades molares, εHA y εA–, las cuales, a su vez, pueden<br />
obtenerse desplazando el equilibrio de forma virtualmente completa hacia la derecha<br />
y hacia la izquierda mediante la adición de un exceso de base y de ácido<br />
respectivamente.<br />
Según la ecuación anterior, cuando [HA] = [A –], pKa = pH y este valor de pH<br />
corresponde a la mitad de la curva de valoración fotométrica, esto es, al 50 % de la
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 44<br />
valoración del ácido HA. Este punto puede obtenerse representando gráficamente la<br />
absorbancia a una determinada longitud de onda frente al pH. En la figura 3.27. se han<br />
representado los espectros de absorción de un indicador ácido-base a distintos<br />
valores de pH.<br />
A<br />
615 nm<br />
400 500 600 700 6 7 8 9<br />
λ<br />
9<br />
8<br />
7.5<br />
7<br />
6.5<br />
6<br />
Figura 3.27. Espectros a varios pH y variación de la absorbancia con el pH a =625 nm<br />
El punto donde se cruzan los espectros se denomina punto isosbéstico. La<br />
presencia de un punto isobéstico evidencia que el equilibrio en cuestión implica solo<br />
dos especies absorbentes.<br />
Cuando se representa la absorbancia a 615 nm frente al pH (curva de la derecha<br />
en la figura 2.27.) se obtiene una curva en forma de S. La parte izquierda corresponde<br />
a la forma ácida del indicador, mientras que la parte superior derecha corresponde a<br />
la conversión casi total en la forma básica. Debido a que el pKa se define como el valor<br />
de pH en el cual una mitad del indicador está en la forma ácida y la otra mitad en la<br />
forma básica, dicho pKa se determina por el punto de inflexión.<br />
Determinación de la estequiometría de complejos<br />
El principal interés de la técnica espectrofotométrica para determinar la<br />
composición de complejos en disolución reside en el hecho de que pueden efectuarse<br />
medidas sin perturbar los equilibrios que se consideran. Con esta finalidad se utilizan<br />
fundamentalmente los siguientes métodos:<br />
Método de las variaciones continuas. Considérese que pueden formarse varios<br />
complejos,<br />
pH
Claudio González Pérez 45<br />
M + L ML<br />
M + 2 L ML2<br />
……etc<br />
pero que en ciertas condiciones predomina uno. Para determinar la estequiometría del<br />
complejo predominante por el método de las variaciones continuas, el procedimiento a<br />
seguir consiste en preparar mezclas de diferentes concentraciones de M y L, pero<br />
manteniendo constante la concentración final (en la práctica, se preparan disoluciones<br />
del catión y del ligando de concentraciones idénticas y se mezclan en distintas<br />
relaciones de volumen, pero de modo que el volumen total sea constante).<br />
La absorbancia de cada disolución se mide a una longitud de onda apropiada y se<br />
representa gráficamente la absorbancia corregida (absorbancia medida menos las<br />
absorbancias de M y L libres * ) frente a la fracción molar de L. Se obtiene una gráfica<br />
donde la absorbancia máxima se corresponde con la estequiometría del complejo<br />
predominante. En la figura 3.28. se muestra la variación de la absorbancia para dos<br />
complejos de estequiometría ML2.La curvatura de las líneas experimentales es el<br />
resultado de no haberse completado la reacción de formación del complejo (de hecho,<br />
se ha desarrollado algún método para la determinación de constantes de formación de<br />
complejos, basado en la medida de las desviaciones con relación a las líneas rectas<br />
teóricas indicadas en la figura). Cuando se forma un complejo muy estable se obtiene<br />
una curva como la B, y cuando es poco estable, como la curva C. Por otra parte, la<br />
representación dará un mínimo si el complejo absorbe menos que los reactivos.<br />
Figura 3.28. Variaciones continuas para dos complejos ML 2.<br />
* En muchas ocasiones, M ó L (o ambos) no absorben a la longitud de onda de interés, de manera que no es<br />
necesaria la corrección.
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 46<br />
Método de la relación molar. Este método es similar al anterior, excepto que aquí se<br />
mantiene constante la concentración de uno de los componentes (a menudo, el ión<br />
metálico) mientras que el otro se hace variar.<br />
Al representar la absorbancia del complejo frente a la relación en moles de los<br />
reactivos, se obtienen líneas rectas de diferente pendiente, produciéndose la<br />
intersección en una relación que corresponde a la estequiometría del complejo (figura<br />
3.29.) En el complejo ML representado en la figura 3.29. el catión metálico absorbe a<br />
la longitud de onda de medida, puesto que el punto inicial tiene una absorbancia mayor<br />
que cero. Por su parte, en el complejo ML2 el ligando absorbe a la longitud de onda a la<br />
que se midió, por lo que la pendiente del segundo tramo es mayor que cero.<br />
.<br />
1.2<br />
A<br />
1.0<br />
0.8<br />
0.6<br />
0.4<br />
0.2<br />
0<br />
ML<br />
ML 2<br />
1 2 3<br />
Figura 3.29. Método de la relación molar.<br />
[L] /[M]<br />
El método de la relación molar presenta sobre el de las variaciones continuas las<br />
siguientes ventajas: en primer lugar distingue mejor entre complejos de números de<br />
coordinación altos; por ejemplo, entre ML5 y ML6 (xL=0.83 y xL=0.87). Además, y en<br />
otro orden de cosas, los datos experimentales indican claramente el exceso de<br />
reactivo necesario para que el complejamiento sea total, lo cual es muy útil en<br />
procedimientos analíticos. Por otra parte, y esto puede considerarse una desventaja,<br />
el gran exceso de reactivo puede conducir a formar complejos de orden superior.<br />
.
Claudio González Pérez 47<br />
ESPECTROFOTOMETRIA DE DERIVADAS<br />
La espectrofotometría de derivadas es una técnica que se conoce desde hace<br />
mucho tiempo, pero que se ha desarrollado en época relativamente reciente, sobre<br />
todo por la falta de instrumentación a un precio razonable. Actualmente, la utilización<br />
de sistemas electrónicos de diferenciación mediante el empleo de un micro ordenador<br />
acoplado en serie con el espectrofotómetro permite la representación de derivadas<br />
de primero, segundo e incluso órdenes superiores de la absorbancia frente a la<br />
longitud de onda:<br />
dA<br />
dλ<br />
para la primera derivada<br />
d 2 A<br />
para la segunda derivada<br />
2<br />
dλ<br />
siendo A la absorbancia y λ la longitud de onda.<br />
La primera derivada de un espectro original también puede definirse como la<br />
representación gráfica de la pendiente de la curva de absorción a cada longitud de<br />
onda. En la figura 3.30. se muestran las características del espectro de la primera y<br />
de la segunda derivada para el caso de un pico de absorción simétrico.<br />
A A<br />
1ª derivada 2ª derivada<br />
Figura 3.30. Pico de absorbancia simétrico y su primera y segunda derivada.<br />
En el espectro de la primera o de la segunda derivada, la señal de ordenadas no<br />
es proporcional al valor de absorción, sino a la pendiente del espectro normal. Por ello,<br />
como la pendiente en el espectro normal puede tener valores positivos y negativos, el
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 48<br />
espectro de derivadas presenta valores positivos y negativos en la escala de<br />
ordenadas, o bien, máximos y mínimos, según el carácter de la pendiente. Para una<br />
sustancia absorbente, la posición de la longitud de onda y la relación entre los valores<br />
de los extremos (máximos y mínimos) representa una magnitud característica.<br />
La utilización de la espectrofotometría de derivadas presenta las siguientes<br />
ventajas:<br />
* Medida exacta de λmax. Mientras que en el espectro normal, especialmente en<br />
el caso de bandas de absorción anchas, la posición correspondiente a la longitud de<br />
onda del máximo solo puede ser fijada de manera aproximada, mientras que en la<br />
primera derivada del espectro, la posición del máximo viene definida exactamente por<br />
el paso de la curva por el valor cero.<br />
* Mejor resolución de los espectros. En el espectro normal, la estructura fina<br />
puede ser difícil de ver. En estos casos, es más conveniente emplear la segunda<br />
derivada, ya que los máximos y mínimos del espectro normal y de la segunda derivada<br />
aparecen prácticamente a las mismas longitudes de onda y la estructura fina del<br />
espectro normal se pone de manifiesto mejor que en la primera derivada. En la<br />
práctica analítica normal esto tiene gran importancia, ya sea con fines de<br />
identificación, como criterio de pureza o para control de calidad.<br />
* Determinaciones en presencia de turbidez. Las disoluciones turbias presentan<br />
en general un aumento continuo de la absorbancia hacia longitudes de onda más cortas<br />
y no ocasionan, por consiguiente, ninguna variación espectral importante en la primera<br />
y segunda derivada, al menos para un nivel de turbidez no demasiado elevado.<br />
* Determinaciones cuantitativas en presencia de dos o más componentes. La<br />
determinación cuantitativa de componentes con bandas de absorción relativamente<br />
estrechas y que estén solapadas con una banda ancha de un segundo componente es<br />
uno de los campos de aplicación más extensos de esta técnica.<br />
Cuando el componente que se desea determinar solo es visible en el espectro<br />
total por un pequeño pico o por un hombro, la utilización de métodos convencionales<br />
puede implicar grandes errores. Sin embargo, la primera o segunda derivadas de un<br />
espectro de dos componentes permite, bajo ciertas condiciones, ver claramente los<br />
diferentes compuestos y hacer determinaciones cuantitativas con errores<br />
sistemáticos muy pequeños o incluso despreciables (figura 3.31.)
Claudio González Pérez 49<br />
Espectro normal<br />
1ª derivada<br />
a) b)<br />
Figura 3.31. Espectro normal y primera derivada. a) un componente. b) dos componentes.<br />
En la figura 3.31. se han representado los espectros normales y la primera<br />
derivada de un componente caracterizado por una pequeña banda a) y el mismo<br />
componente "oscurecido" por la presencia de otra especie con una banda de absorción<br />
más ancha.<br />
EJERCICIOS<br />
1. Dadas las siguientes sustancias: pentano, pentanol, clorohexano, butadieno,<br />
benceno, fenol, amoniaco, butilamina, ácido acético, benzopireno, ozono, ¿Absorberán<br />
radiación visible?. ¿Cuáles absorberán radiación ultravioleta?. Justifíquelo.<br />
2. Se determinó la absortividad molar de un compuesto químico midiendo la<br />
absorbancia de una disolución de concentración conocida utilizando una cubeta de 1<br />
cm. Se obtuvo el valor de 2.2x10 4 L mol –1 cm –1. ¿Qué valor se obtendría si se utilizase<br />
una cubeta de 10 cm?. ¿Qué espesor (camino óptico) debería tener la cubeta para que<br />
la misma disolución presente una transmitancia del 8.42 %?<br />
3. En disoluciones acuosas neutras, el fenol tiene una absortividad molar de<br />
1.8x10 4.mol –1.cm –1 . ¿Qué intervalo de concentraciones de fenol pueden determinarse si<br />
los valores de las absorbancias en cubetas de 10 cm deben limitarse a valores de 0.2 a<br />
0.9 unidades de absorbancia?.<br />
4. Se trata de determinar la concentración de Fe(III) en un agua mineral. Para<br />
ello, se pipetean alícuotas de 10 mL de la muestra en matraces aforados de 50 mL. Se<br />
adicionan a cada uno exactamente 0, 5, 10, 15 y 20 mL de una disolución patrón que
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible 50<br />
contiene 11.1 p.p.m. de Fe(III), seguido de un exceso de ion tiocianato, para formar<br />
complejo rojo Fe(SCN) 2+ . Después de enrasar a 50 mL, las absorbancias de las cinco<br />
disoluciones medidas a 580 nm (longitud de onda de máxima absorción) fueron 0.240,<br />
0.437, 0.621, 0.809 y 1.009 respectivamente (cubetas de 1 cm). Obtener la<br />
concentración de Fe(III) en la muestra de agua.<br />
5. Se analizó espectrofotométricamente una mezcla de dicromato y<br />
permanganato, en medio ácido sulfúrico 1 M y utilizando cubetas de 1 cm. Para ello, se<br />
midieron las absorbancias a 440 y a 545 nm, obteniendo los valores de 0.385 y 0.653<br />
respectivamente. Previamente, se encontró que la absorbancia de una disolución de<br />
dicromato 8.33x10 –4 M era de 0.308 a 440 nm y de 0.009 a 545 nm. Análogamente,<br />
una disolución de permanganato 3.77x10 –4 M presentó una absorbancia de 0.035 a 440<br />
nm y de 0.886 a 545 nm. Calcular las concentraciones de permanganato y de dicromato<br />
en la mezcla analizada.<br />
6. Se determinó la estequiometría de un complejo MLn por el método de las<br />
variaciones continuas y el de la relación molar, partiendo de disoluciones de M y de L<br />
0.0100 molar. Para aplicar el primer método se mezclaron los volúmenes de cada una<br />
de ellas que se indican en la tabla, obteniendo los correspondientes valores de<br />
absorbancia. Para el método de la relación molar, se añadieron los volúmenes de L<br />
indicados en la tabla a 5.0 mL de la disolución de M, enrasando al mismo volumen en<br />
todos los casos.<br />
Variaciones continuas Relación molar<br />
mL de M mL de L A mL de L A<br />
10.0<br />
9.00<br />
8.00<br />
7.00<br />
6.00<br />
5.00<br />
4.00<br />
3.00<br />
2.00<br />
1.00<br />
0.00<br />
0.00<br />
1.00<br />
2.00<br />
3.00<br />
4.00<br />
5.00<br />
6.00<br />
7.00<br />
8.00<br />
9.00<br />
10.0<br />
0.000<br />
0.130<br />
0.261<br />
0.399<br />
0.530<br />
0.660<br />
0.799<br />
0.750<br />
0.500<br />
0.252<br />
0.000<br />
Obtener la estequiometría del complejo MLn.<br />
0.00<br />
1.00<br />
2.00<br />
3.00<br />
4.00<br />
5.00<br />
6.00<br />
7.00<br />
8.00<br />
12.0<br />
14.0<br />
0.000<br />
0.080<br />
0.181<br />
0.269<br />
0.360<br />
0.447<br />
0,540<br />
0.628<br />
0.720<br />
0.900<br />
0.900