Participación del Factor Silenciador Neuronal Restrictivo - Tesis ...

Universidad de Chile,
Facultad de Medicina, Instituto de Ciencias Biomédicas,
Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas.
Participación del Factor Silenciador Neuronal
Restrictivo (REST/NRSF) en la Neurogénesis de
Xenopus laevis.
TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS
BIOMÉDICAS
Alumno: Patricio Olguín Aguilera
Director de Tesis: Dr. Manuel Kukuljan Padilla
Lugar de realización: Laboratorio de Fisiología Celular y Molecular,
Programa de Fisiología y Biofísica, ICBM, Facultad de Medicina,
Universidad de Chile.

AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer a mis padres Alicia y Ricardo por el apoyo
incondicional que me brindaron durante estos años de estudio, a mi hermano y
amigo Nicolás y a mi hermano Ricardo eterna inspiración de nuestras vidas.
A mi querida Carolina gracias por el amor, la vida juntos, la comprensión,
el apoyo, la ayuda indispensable, la fuerza, la paciencia, los momentos vividos,
la compañía exquisita y tantas, tantas cosas.
A Manuel quien confió en mi desde el principio y me dio la libertad para
desarrollar mis ideas, gracias por el entusiasmo, la guía, las discusiones, los
seminarios, las ideas, los sueños.
Quisiera agradecer especialemente a Ricardo quien me introdujo en lo
que ahora son nuestras preguntas, divergentes pero similares. Gracias por
enseñarme a trabajar, a no repetir recetas, por recordarme de que esto se trata
de 99% trabajo y de que la mayor parte de éste debe entretenernos.
A a los que colaboraron directamente en la realización de esta tesis: a
Pablo, por la discusión estimulante, por su trabajo y actitud, salud por los
buenos tiempos; a Eduardo, por su apoyo, trabajo y amistad; y a Jose Luis por
su ayuda y guía indispensable.
A mis amigos Fernando, Angélica y Elvis sin su ayuda hubiera sido
imposible llegar hasta este día, muchísimas gracias.
Tambien agradecer a Jimena por su apoyo, por dejarme disponer de su
laboratorio, por el trabajo fuera de horario, por el pasatiempos que se convirtió
en lo que hago ahora y pretendo hacer en el futuro, por las acaloradas
discusiones y el cariño.
A todos los compañeros de laboratorio quienes tuvieron la paciencia de
soportarme, a Gabriela, Ximena, Paulina, Valeria, Romina, Rebeca, Dayan,
Pablo y Lorena.

Quisiera agradecer muy especialmente a Angeles Ribera y Gail Mandel
quienes me abrieron las puertas de sus laboratorios para desarrollar parte de
algunos objetivos de esta tesis y explorar otras alternativas experimentales.
También quiero agradecer el apoyo de la Facultad de Medicina y
especialmente la confianza depositada por el Programa de Doctorado a Rosa
Deves, Monica Astudillo y a toda la gente que hace funcionar la escuela.
Finalmente a las becas que me permitieron cursar el Doctorado, ICBM y
CONICYT; a las becas de ayuda de viaje Mecesup UCH 9903 y 0306; y a los
proyectos que hicieron posible el desarrollo de esta tesis: CONICYT AT403023
y Núcleo Milenio Centro de Neurociencias Integradas (CENI).

Índice temático
RESUMEN……………………………………………………………………………..1
SUMMARY……………………………………………………………………………..3
ANTECEDENTES……………………………………………………………………..5
1. Establecimiento del territorio neural de Xenopus laevis…………………..5
1.1 Inducción Neural……………………………………………………………….5
1.2 El modelo por defecto. ………………………………………………………..6
1.3 Inductores neurales y vías de señalización que participan en la inducción
neural……………………………………………………………………………8
2. Especificación del borde de la placa neural e inducción de las crestas
neurales………………………………………………………………………..13
2.1 Posicionamiento del borde de la placa neural……………………………..13
2.2 Inducción de las crestas neurales…………………………………………..13
3 Neurogénesis embrionaria de Xenopus laevis…………………………….17
3.1 Genes que conectan la inducción neural con la neurogenesis………….17
3.2 Neurogénesis primaria en Xenopus laevis…………………………………18
3.2.1 Determinación y diferenciación neuronal en Drosophila, genes
proneurales……………………………………………………………………18
3.2.2 Selección de progenitores neurales, genes neurogénicos y el mecanismo
de inhibición lateral…………………………………………………………...19
3.2.3 Determinación y diferenciación neuronal en Xenopus, genes proneurales
y neurogénicos………………………………………………………………..20
3.3 Posicionamiento de los cluster proneurales, genes del prepatrón……...22
3.3.1 Establecimiento de los dominios neurogénicos en Xenopus laevis…….23
3.4 Factores que modulan la actividad proneural de las proteínas bHLH….26
4. REST/NRSF y la regulación de la expresión de los genes neuronales que
codifican para proteínas estructurales……………………………………..27
4.1 Estructura función de REST/NRSF………………………………………...28
4.2 Mecanismos moleculares de represión y silenciamiento génico………..29
4.2.1 Mecanismo de inhibición de la transcripción en células no-neuronales..29
4.2.2 Mecanismo de regulación en células troncales embrionarias…………..31
4.2.3 REST/NRSF y el estado de la cromatina desde progenitores neurales a
las neuronas diferenciadas………………………………………………….33
4.2.4 Función de REST/NRSF en neuronas diferenciadas…………………….36
4.3 Estudios de la función de REST/NRSF in vivo……………………………37
4.3.1 Estudios de promotores de genes neuronales estructurales usando
animales transgénicos……………………………………………………….37
4.3.2 Estudios de pérdida y ganancia de función de REST/NRSF durante el
desarrollo
embrionario……………………………………………………………….39

Hipótesis……………………………………………………………………………….43
Objetivo general………………………………………………………………………43
Objetivos específicos…………………………………………………………………43
MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………...45
Materiales……………………………………………………………………………...45
Animales……………………………………………………………………………….45
Reactivos para la obtención y mantención de embriones y explantes animales
………………………………………………………………………………………….45
Cultivo Celular………………………………………………………………………...45
Registros electrofisiológicos…………………………………………………………46
Biología Molecular…………………………………………………………………….46
Síntesis de ribosondas y mRNA…………………………………………………….46
Hibridación in situ……………………………………………………………………..47
Sistemas
Comerciales…………………………………………………………………………...49
Enzimas………………………………………………………………………………..49
Otros reactivos usados en biología molecular…………………………………….49
Cepas
Bacterianas……………………………………………………………………………50
Medios de cultivo Bacteriano………………………………………………………..50
Métodos………………………………………………………………………………..51
Animales……………………………………………………………………………….51
Obtención de embriones de Xenopus laevis mediante fertilización in vitro…….51
Microinyección de embriones e inducción con dexametasona………………….51
Recolección de embriones. …………………………………………………………54
Explantes animales. ………………………………………………………………….54
Cultivo celular. ………………………………………………………………………..54
Registros electrofisiológicos. ………………………………………………………..55
Técnicas de Biología Molecular. …………………………………………………...56
Aislamiento del cDNA de XREST/NRSF y zREST/NRSF y generación de
construcciones para la sobreexpresión…………………………………………….56
Analisis de PCR semicuantitativo (SQ-PCR) en explantes animales…………..57
Inmunodetección de histona H3 fosforilada………………………………………..57
Transcripción in vitro de mRNA……………………………………………………..58
Síntesis de ribosondas para hibridación in situ……………………………………60
Hibridación in situ (ISH)……………………………………………………………...62

RESULTADOS………………………………………………………………………..64
1. Clonamiento del cDNA codificante para XREST/NRSF de Xenopus laevis
y Danio rerio. …………………………………………………………………64
2. Patrón de expresión de XREST/NRSF durante el desarrollo embrionario
de Xenopus laevis. …………………………………………………………..66
3. Participación de XREST/NRSF durante la neurogénesis de Xenopus
laevis. ………………………………………………………………………….68
3.1 XREST/NRSF es necesario para la expresión de los genes neuronales
estructurales. …………………………………………………………………68
3.2 La interferencia de la función de XREST/NRSF perturba la neurogénesis
primaria y conduce a la expresión ectópica y prematura de Nav1.2……72
4. Participación de XREST/NRSF en la formación del patrón dorso-ventral
del ectodermo de Xenopus laevis…………………………………………..76
4.1 XREST/NRSF participa en el establecimiento del territorio neural……...76
4.2 La sobreexpresión de XREST/NRSF o de zREST/NRSF revierte los
fenotipos asociados a la interferencia de la función de XREST/NRSF…80
4.3 Los fenotipos ectodérmicos asociados a la interferencia de la función de
XREST/NRSF no son producto de alteraciones en la especificación del
mesodermo o de la proliferación de las células del ectodermo…………82
4.4 La sobreexpresión de XREST1 no altera el desarrollo neural…………..84
4.5 La interferencia de la función de XREST/NRSF resulta en la
neuralización de explantes animales y en la inhibición del destino
epidermal……………………………………………………………………....86
4.6 XREST/NRSF participa en la formación del patron dorso-ventral del
ectodermo a través de la modulación de la vía de señalización de BMP.
…………………………………………………………………………….…....88
5. XREST/NRSF regula la adquisición de la excitabilidad durante la
diferenciación neuronal………………………………………………..……..91
6. XCoREST participa en el establecimiento del destino neural…………...94
DISCUSIÓN…………………………………………………………………………...97
1. XREST/NRSF regula la expresión de los genes neuronales estructurales
durante la neurogénesis de Xenopus
laevis…………………………………………………………………………...98
2. La interferencia de la función de XREST/NRSF perturba el
establecimiento de los dominios
neurogénicos…………………...……………………………………………100
3. XREST/NRSF participa en el establecimiento del patrón dorsoventral del
ectodermo……………………………………………………………………101
4. XREST/NRSF participa en el establecimiento del patrón dorsoventral del
ectodermo a través de la modulación de la señalización de BMP…….105
5. XREST/NRSF modula la adquisición de la corriente de sodio
dependiente de potencial eléctrico en neuronas espinales de Xenopus.
………………………………………………………………………………..110

6. Función de XCoREST en el la especificación del neuroectodermo de
Xenopus………………………………………………………………………113
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS……………………………………………115
REFERENCIAS……………………………………………………………………...117

Índice de Tablas
Tabla 1. mRNAs sintetizados in vitro para la inyección en embriones de
Xenopus laevis. ……………………………………………………………………....59
Tabla 2. Morfolinos para la inyección en embriones de Xenopus laevis……….59
Tabla 3. Genes utilizados para la síntesis de ribosondas para ISH…………….61
Tabla 4. Efecto de la interferencia de la función de XREST/NRSF en la
expresión de los genes neuronales estructurales…………………………………71
Tabla 5. Porcentaje de embriones que presentan fenotipos asociados a la
interferencia de la función de XREST/NRSF. …………………………………….75
Tabla 6. Porcentaje de embriones con fenotipos asociados a la interferencia de
la función de XREST/NRSF. ………………………………………………………..79
Tabla 7. La interferencia de la función de dnXREST revierte parcialmente los
fenotipos asociados a la sobreexpresión de Bmp-4………………………………91
Tabla 8. XCoREST participa en el establecimiento del territorio neural e
interactúa geneticamente con XREST/NRSF……………………………………..95

Índice de figuras
Figura 1. Experimento de Spemann y Mangold repetido en Xenopus laevis…….5
Figura 2. El modelo por defecto……………………………………………………….8
Figura 3. Modelos de inducción neural basados en estudios en Xenopus y pollo.
…………………………………………………………………………………………...12
Figura 4. Modelo de doble gradiente para la inducción de las crestas neurales
(NC). ……………………………………………………………………………………16
Figura 5. Modelo de la cascada regulatoria de la diferenciación neural………...17
Figura 6. Selección de progenitores neurales a través del mecanismo de
inhibición lateral. ………………………………………………………………………20
Figura 7. Modelo de la cascada genética que controla la determinación y
diferenciación neuronal. ……………………………………………………………...22
Figura 8: Neurogénesis primaria en Xenopus laevis. ……………………………..24
Figura 9. Estructura función de REST/NRSF. ……………………………………..28
Figura 10. Mecanismo de silenciamiento de los genes neuronales estructurales
en células no-neuronales diferenciadas. …………………………………………...31
Figura 11. Mecanismo de represión mediado por REST/NRSF en células
troncales embrionarias y progenitores neurales. ………………………………….33
Figura 12. Mecanismo de regulación transcripcional de genes neuronales
involucrados en la plasticidad neuronal. ……………………………………………37
Figura 13. Estrategia de pérdida de función para el análisis del papel de
XREST/NRSF durante la neurogénesis de Xenopus laevis………………………53
Figura 14. Alineamiento de la secuencia aminoacídica predicha de
XREST/NRSF y ZREST/NRSF con los homólogos en rata, ratón y humano…..65
Figura 15. Patrón de expresión de XREST/NRSF durante el desarrollo
embrionario de Xenopus laevis..……………………………………………………..67
Figura 16. La interferencia de la función de XREST/NRSF resulta en la
disminución de la expresión de los genes neuronales estructurales y en defectos
morfológicos del tejido neural. ……………………………………………………….70
Figura 17. La interferencia de la función de XREST/NRSF inhibe la neurogénesis
y conduce a la expresión ectópica y prematura de Nav1.2……………………….74
Figura 18. La activación de dnXREST inhibe la expresión de XHes-1 y no altera
la expresión de Notch-1……………………………………………………………….76
Figura 19. La interferencia de la función de XREST/NRSF conduce a la
expansión de la placa neural sobre la región borde……………………………….78
Figura 20. La expansión de la placa neural asociada a la interferencia de la
función de XREST/NRSF es rescatada por la sobreexpresión de XREST/NRSF y
zREST/NRSF. …………………………………………………………………………81
Figura 21. La interferencia de la función de XREST/NRSF en el ectodermo no
altera la expresión de marcadores mesodérmicos ni el estado de proliferación de
las células del ectodermo. ……………………………………………………………83
Figura 22. La sobreexpresión de XREST1 no altera el patrón dorsoventral del
ectodermo. …………………………………………………………………………….85

Figura 23. A) La interferencia de la función de XREST/NRSF inhibe la
adquisición del destino epidermal en el ectodermo ventral. B) La interferencia de
la función de XREST/NRSF inhibe la expresión de msx-1 y vent2 en explantes
animales. ……………………………………………………………………………….87
Figura 24. Los fenotipos asociados a la interfer-encia de la función de
XREST/NRSF son revertidos parcialmente por la sobreexpresión de Bmp-4….90
Figura 25. XREST/NRSF modula la expresión de la corriente de sodio
dependiente de potencial eléctrico en neuronas espinales de Xenopus laevis...93
Figura 26. XCoREST participa en el establecimiento del territorio neural e
interactúa geneticamente con XREST/NRSF durante este proceso…………….96
Figura 27. Análisis de la expresión de marcadores moleculares de placodas en
embriones de Danio rerio y Xenopus laevis con pérdida de función de REST.103
Figura 28. Esquema simplificado de los mecanismos de antagonismo intracelular
de la vía de señalización de BMP. ………………………………………………...109
Figura 29. Modelo de la regulación de la expresión de NaV1.2 durante la
neurogénesis de Xenopus laevis…………………………………………………...112

Lista de publicaciones
- Olguín P, Oteiza P, Gamboa E, Gomez-Skarmeta J, Kukuljan M. (2006).
“REST/NRSF modulates ectodermal patterning during Xenopus development”. J. of
Neuroscience, 26(10):2820-9.
- Kukuljan M, Taylor A, Chouinard H, Olguín P, Rojas CV, Ribera AB. (2003). “Selective
regulation of xSlo splice variants during Xenopus embryogenesis. J Neurophysiology
90(5):3352-60”.
- Mendoza C., Olguín P., Lafferte G., Thomas G., Ebitsch S., Gundelfinger E.D.,
Kukuljan M., Sierralta J. (2003). “Novel isoforms of Dlg are fundamental for neuronal
development in Drosophila. J. Neuroscience. 23(6): 2093-2101”.
- Armisen R, Fuentes R, Olguín P, Cabrejos ME, Kukuljan M. (2002). “Repressor
element-1 silencing transcription/neuron-restrictive silencer factor is required for
neural sodium channel expression during development of Xenopus. J
Neuroscience. 22(19):8347-51”.

RESUMEN
El silenciador de la transcripción del elemento represor-1/factor
silenciador neuronal restrictivo (REST/NRSF) fue identificado como un represor
de los genes neuronales que contienen en su promotor un motivo conservado
de 23 pares de bases denominado RE-1/NRSE. El patrón de expresión del
mRNA de REST/NRSF y la caracterización molecular de su función en líneas
celulares son compatibles con la idea de que REST/NRSF es un factor que
silencia la expresión de los genes neuronales en células no neuronales y en
precursores neurales indiferenciados. Recientemente se ha mostrado que
REST/NRSF juega un papel fundamental en el tránsito de las células troncales
embrionarias a neuronas diferenciadas y que funciona como un gen supresor
de tumores, donde su ausencia se asocia a ciertos procesos neoplásicos en
humanos. Ratones homocigotos para una deleción nula de REST/NRSF
presentan letalidad alrededor del estadio embrionario 10 y expresión ectópica
de algunos genes neuronales en tejido no neuronal. En embriones de pollo la
sobreexpresión de REST/NRSF resulta en la represión de algunos genes
neuronales en neuronas espinales y en defectos en la navegación axonal. En
contraste, la interferencia de la función de XREST/NRSF en embriones de
Xenopus laevis desde etapas tempranas del desarrollo no conduce a letalidad,
resulta en la represión de los genes neuronales en la néurula y en la expansión
del tejido neural. Estos resultados se oponen en parte a la evidencia derivada
de estudios moleculares e indican que la función REST/NRSF es necesaria
para la expresión de los genes neuronales. Además, junto con los datos
observados en embriones de ratón y en células troncales embrionarias sugieren
que la función de REST/NRSF podría ser necesaria en etapas más tempranas
del desarrollo neural.
En esta tesis estudiamos el papel de XREST/NRSF durante el desarrollo
neural de Xenopus, desde el establecimiento del neuroectodermo a la
diferenciación neuronal. La inhibición de la función de REST/NRSF en
1

embriones de Xenopus desde la blástula tardia conduce a la alteración del
desarrollo del tubo neural, ganglios craneales y del ojo. Estos defectos se
originan en la alteración del patrón dorso-ventral del ectodermo durante la
gástrula y la néurula temprana. En Xenopus laevis el patrón dorso-ventral del
ectodermo se establece en la gástrula por la actividad en gradiente de la
señalización de BMP (Bone Morphogenetic Protein). Una alta actividad de la vía
de BMP determina el destino epidermal, una intermedia las crestas neurales y
una muy baja es necesaria para determinar la placa neural en la región dorsal.
La interferencia de la función de XREST/NRSF desde la blástula tardía conduce
a la expansión de marcadores neurales y complementariamente, al
desplazamiento lateral y disminución de la expresión de marcadores
epidermales y de las crestas neurales. Junto con esto, la expresión de los
genes proneurales, neurogénicos y neuronales se inhibe, lo que indica una
alteración del programa neurogénico. La interferencia de la función de
XREST/NRSF emula los efectos de la inhibición de la actividad de BMP en el
ectodermo y revierte los fenotipos asociados a la sobreexpresión de Bmp-4.
Estos resultados indican que la función de REST/NRSF es necesaria para la
especificación de los destinos de las células del ectodermo aparentemente a
través de la modulación de la vía de señalización de BMP. Además, mostramos
que la interferencia de la función XREST/NRSF durante la diferenciación de las
neuronas espinales se asocia a un aumento de la densidad de corriente de
sodio, lo que es compatible con la hipótesis de que este factor participa en la
regulación génica en neuronas posmitóticas.
En conclusión, en esta tesis determinamos que XREST/NRSF participa
en diferentes etapas del desarrollo neural. En etapas tempranas es necesario
para el establecimiento del patrón dorsoventral del ectodermo y más
tardiamente modula la adquisición de la excitabilidad durante la diferenciación
neuronal, probablemente a través de la regulación de la expresión de los
canales de sodio dependientes de potencial eléctrico.
2

ABSTRACT
The RE-1 silencer of transcription/neural restrictive silencer factor
(REST/NRSF) was initially identified as a repressor of neuronal genes
containing a 23 base pair conserved motif sequence known as RE-1/NRSE. The
expression pattern of the mRNA encoding REST/NRSF and an extensive
molecular characterization of its function, led to the view of REST/NRSF as a
factor that silences neuronal genes in non-neuronal cell types and immature
neuronal precursors. Recently it has been shown that REST/NRSF plays distinct
roles in the transit of embryonic stem cells to differentiated neurons, and has
also been identified as a tumor suppressor gene, which is deleted in human
neoplasias. Homozygous deletion of the REST/NRSF gene is lethal for mice
around embryonic day 10. Examination of these embryos reveals derepression
of some neuronal genes in non-neural tissues. Conversely, gain of function of
REST/NRSF in developing chick spinal neurons results in repression of the
expression of some neuronal genes and defects in axon navigation. In contrast,
in Xenopus laevis embryos the interference with XREST/NRSF function from
early stages of development does not lead to early lethality and results in
repression of neuronal genes at late neurula stage and in the expansion of
neural tissue. These results contrast with the body of knowledge that emerged
from molecular studies and indicates that XREST/NRSF function is necessary
for the expression of neuronal genes. Moreover, these data along with the
observed in mouse embryos and in neural stem cells, suggest that REST/NRSF
function could be required at early stages of neural development.
In this thesis we studied the role of XREST/NRSF during Xenopus
development, from the establishment of neuroectoderm to the neuronal
differentiation. We find that impairment of XREST/NRSF function in Xenopus
embryos from late blastula stage leads to the perturbation of neural tube, cranial
ganglia and eye development. The origin of these defects is the abnormal
patterning of the ectoderm during gastrulation and early neurulae. In Xenopus
3

laevis the ectoderm is patterned at gastrula stage by the gradient activity of BMP
signaling. A high activity of BMP determines epidermis at ventral side, an
intermediate neural crests and the lowest activity of BMP signaling at the dorsal
side is necessary to determine neural plate. Interference of XREST/NRSF
function during the late blastula stage leads to an expansion of the neural
markers concomitant with lateral displacement and decrease of the expression
of epidermal keratin and neural crest markers. Further, neurogenesis proceeds
abnormally, with loss of the expression of proneural, neurogenic and neuronal
genes. The interference of REST/NRSF mimics several features associated to a
decreased BMP function in the ectoderm and counteracts some effects of Bmp-
4 misexpression. These results indicate that REST/NRSF function is required in
vivo for the specification of ectodermic cell fates at least in part through the
modulation of BMP signaling. Moreover, we showed that interference of
XREST/NRSF function during differentiation of spinal neuronal is associated to
an increase in the density of sodium currents; this observation is compatible with
a role of this factor in the regulation of gene expression in post mitotic neurons.
In conclusion in this thesis we have been able to show that XREST/NRSF
participates in different stages of neural development in vivo. At early stages it is
required to pattern the dorsal-ventral axis of the ectoderm and later, during
neuronal differentiation, it modulates the acquisition of neuronal excitability
probably by the regulation of neuronal voltage gated sodium channels.
4

ANTECEDENTES
1. Establecimiento del territorio neural de Xenopus laevis.
1.1 Inducción Neural.
La formación del sistema nervioso de los vertebrados se inicia en el
estadio embrionario de gástrula donde la interacción de un grupo especializado
de células de la región más dorsal del mesodermo sobre las células del
ectodermo gatilla el desarrollo neural de este tejido. Este proceso, denominado
inducción neural, fue descrito por primera vez en 1924 por Hans Spemann y
Hilde Mangold, quienes usando embriones de salamandra de diferente
pigmentación observaron que el transplante de la región más dorsal de un
embrión en estadio de gástrula (labio dorsal del blastoporo) a la región más
ventral (vientre presuntivo) de un embrion de distinto pigmento genera un
segundo eje, donde la mayor parte de las células que forman el nuevo sistema
nervioso son derivadas del ectodermo del huesped (Spemann, 1921; Spemann
y Mangold, 1924) (Figura 1).
5
Figura 1. Experimento de
Spemann y Mangold repetido en
Xenopus laevis. Arriba se
muestra un renacuajo control.
Abajo a la izquierda, se muestra
en una vista vegetal un embrión
en estadío de gastrula temprana
donde se ha injertado el
organizador de un embrión albino
en la región ventral. A la derecha
se muestra el renacuajo resultante
con dos ejes, donde el sistema
nervioso está constituido
principalmente por tejido del
huesped (extraido de De Robertis
y Kuroda, (2004)).

Posteriormente, en otros vertebrados se identificaron regiones equivalentes al
“organizador” de anfibios (denominado organizador de Spemann), que
comparten la capacidad de inducir tejido neural: el escudo embrionario en
teleostos (Luther, 1935; Oppenheimer, 1936b) y el nodo de Hensen en aves y
mamiferos (Waddington, 1932, 1933, 1936, 1937). La capacidad inductiva de
cada uno de estos tejidos no sólo se restringe a transplantes realizados entre
embriones de la misma especie, sino también a transplantes entre embriones
pertenecientes a diferentes clases (Waddington, 1934; Oppenheimer 1936a;
Kintner and Dodd, 1991; Blum et al., 1992; Hatta and Takahashi, 1996), lo que
indica que el mecanismo de inducción neural es conservado entre los
vertebrados.
1.2 El modelo por defecto.
Si bien estaba claro que tejidos con las propiedades del organizador de
Spemann se encontraban presente en varias especies, la naturaleza de la señal
emitida desde esta estructura y que daría cuenta de la inducción de un nuevo
sistema nervioso no fue descubierta sino hasta seis decadas despues. A inicios
de los noventa, diferentes grupos de investigadores observaron que las células
disociadas de explantes de la región más animal de embriones de Xenopus
laevis en estadio de gástrula temprana adquieren el destino neural (Born et al.,
1989; Godsave y Slack, 1989; Grunz y Tacke, 1989; Sato y Sargent, 1989;
Saint-Jeannet et al., 1990) (Figura 2). Luego, se determinó que la
sobreexpresión de una forma dominante negativa del receptor de activina en
embriones de Xenopus bloquea la formación de mesodermo y además,
sorprendentemente, induce tejido neural ectópico (Figura 2). El receptor de
activina no se expresa en el ectodermo, sin embargo, el receptor truncado de
activina es capaz de inhibir la señalización mediada por TGFβ (Transforming
Growth Factor β) y por BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) (Hemmati-
Brivanlou y Melton, 1992; Wilson y Hemmati-Brivanlou, 1995). Estos hallazgos
en conjunto sugirieron por primera vez la idea de que el tejido neural sería
6

inducido por la remoción de una sustancia inhibitoria desconocida que estaría
presente en el ectodermo (Hemmati-Brivanlou y Melton, 1994). Esta idea fue
reforzada por la evidencia de que Bmp-4 o la sobreexpresión de sus efectores
directos, tales como msx-1, Smad1 o Smad5, inhiben la inducción neural y
restauran el destino epidermal en las células disociadas de explantes animales,
lo que indicó que las BMPs funcionan en el ectodermo inhibiendo la
neuralización (Wilson y Hemmati-Brivanlou, 1995; Suzuki et al., 1997a; Suzuki
et al., 1997b; Wilson et al., 1997) (Figura 2). De acuerdo con este modelo, que
más tarde se denominaría “modelo por defecto” (Hemmati-Brivanlou y Melton,
1997), el destino neural sería el estado que por defecto adoptan las células del
ectodermo en ausencia de una señal inductora del destino epidermal o
epidermalizante (Figura 2).
El mRNA de Bmp4 se expresa en todo el ectodermo durante la gástrula
temprana, para posteriormente desaparecer en la placa neural presuntiva justo
cuando el organizador es completamente especificado (Fainsod et al., 1994). La
interferencia de la señalización mediada por las BMPs, mediante la expresión
de un dominante negativo de su receptor (Sasai et al., 1995; Xu et al., 1995) o
de formas no procesables de BMP4 o BMP7 (Hawley et al., 1995) , o bien a
través de la inyección de un antisentido dirigido contra el mRNA de BMP4
(Sasai et al., 1995), conduce a la adquisición del destino neural de las células
de los explantes animales. Estas evidencias confirmaron la hipótesis de que la
señal epidermalizante que habita en el ectodermo corresponde a la señal
mediada por las BMPs.
7

1.3 Inductores neurales y vías de señalización que participan en
la inducción neural.
Paralelamente, fueron aislados tres genes que codifican para proteínas
secretadas con actividad neuralizante que se expresan en el organizador:
Noggin (Smith and Harland, 1992; Lamb et al., 1993; Smith et al., 1994),
Follistatin (Hemmati-Brivanlou et al., 1994) y Chordin (Sasai et al., 1994; Sasai
et al., 1995). La sobreexpresión de estos factores emula las dos actividades
propias del organizador de Spemann: neuralizar el ectodermo y dorsalizar el
mesodermo (Smith and Harland, 1992; Hemmati-Brivanlou et al., 1994; Sasai et
al., 1994; Sasai et al., 1995) (Figura 3A). Estos factores, denominados
“inductores neurales”, unen e inactivan a los BMPs en el espacio extracelular y
esta inactivación daría cuenta de su actividad en el ectodermo como en el
mesodermo (Piccolo et al., 1996; Zimmerman et al., 1996). La pérdida de
función de los tres antagonistas de BMP (Chordin, Noggin y Follistatin) en
embriones de Xenopus tropicalis, usando antisentidos modificados (morfolinos),
resulta en una dramática ventralización del embrión, que incluye la pérdida casi
total de la placa neural (Khokha et al., 2005). En Drosophila y el pez cebra se
han aislado al menos siete mutantes (para cada uno) que presentan defectos
8
Figura 2. El modelo por defecto.
Caracterización de un embrión de
estadio de blástula tardía donde se
grafica la excisión de un explante de
la región animal. El explante intacto
adquiere el destino epidermal,
mientras que los explantes que
expresan el dominante negativo del
receptor de activina adquieren el
destino neural. La disociación de las
células del explante resulta en la
adquisición del destino neural.
Mientras que la incubación de las
células disociadas con BMPs
conduce a la adquisición del destino
epidermal (extraido de Muñoz-San
Juan y Hemmati-Brivanlou, (2002)).

en la formación de patrones en el eje dorsoventral; los genes correspondientes
a estas mutaciones forman parte de la vía de señalización de BMP. Esto indica
que tanto en vertebrados, al menos en anuros y teleostos, como en
invertebrados se aplica el mismo principio para el establecimiento del eje
dorsoventral durante el desarrollo embrionario (revisado en Hammerschmidt y
Mullins, 2002; DeRobertis y Sasai, 1996; Lall y Patel, 2001). Sin embargo,
ratones con una mutación nula (“knockout”) para del homólogo de chordin o
noggin no presentan defectos asociados al establecimiento del patrón
dorsoventral (Bachiller et al., 2003; McMahon et al., 1998). Los mutantes dobles
para estos genes presentan pérdida de la vesícula prosencefálica, de la
notocorda anterior y aleatoriedad en la asimetría izquierda-derecha del corazón
(Bachiller et al., 2000). Junto con esto, embriones de ratón mutantes para
HNF3β, en los cuales el nodo no se desarrolla y por lo tanto no expresa chordin
y noggin, aun forman placa neural (Klingesmith et al., 1999). Estos datos
indican que los antagonistas de BMP, Chordin y Noggin poseen funciones
redundantes, que podrían ser también necesarios antes de la formación del
nodo y que juegan un papel fundamental en el establecimiento de los tres ejes
embrionarios del raton. Junto a estos antecedentes, las siguientes evidencias
indican que la disminución de la señalización de BMP parece no ser suficiente
para la inducción del tejido neural.
En el pez cebra se ha reportado que mutantes para chordin o embriones
en que se ha escindido quirurgicamente el escudo embrionario aún forman
sistema nervioso (Shih and Fraser, 1996; Driever et al., 1997). De manera
semejante, mutantes para la via de Nodal donde el organizador y sus derivados
estan ausentes también forman sistema nervioso (Feldman et al., 1998; Zhang
et al., 1998; Gritsman et al., 1999). En embriones de pollo el patrón de
expresión de las BMPs y de sus antagonistas no se ajustan al “modelo por
defecto”. La expresión del mRNA de Bmp-4 y la presencia de Smad1 fosforilado
disminuyen en la placa neural en estadios del desarrollo posteriores a los
correspondientes en Xenopus. La sobreexpresión de BMP no inhibe la
9

formación de la placa neural y la expresión de chordin en el epiblasto
competente no induce tejido neural, aunque luego de la inducción temprana,
chordin es capaz de mantener el carácter neural del tejido (Streit et al., 1998;
Streit and Stern 1999a; Streit and Stern 1999b). Estos antecedentes sugieren
que otras señales además de las que resultan en la inhibición de la via de BMP
son necesarias para la inducción neural (Figura 3).
En Xenopus la interferencia de la señalización de FGF inhibe la
capacidad de Chordin y Noggin de inducir tejido neural en explantes animales
(Sasai et al., 1996; Launay et al., 1996). Se ha propuesto que la activación de
las MAP quinasas (MAPK) por FGF o por otros factores tales como IGF y Nodal
(a través de los cofactores EGF-CFC) pueden inhibir los blancos que se
encuentran rio abajo de la señalización de las BMPs tales como Smad1
(revisado en DeRobertis y Kuroda, 2004) (Figura 3A). Se ha reportado que con
solo herir embriones de anfibios se puede activar la via de las MAPK (LaBonne
y Whitman, 1997; Christen y Slack, 1999), lo que daría cuenta de la suficiencia
de la inhibición de BMP para neuralizar caps animales. De acuerdo con estos
resultados, la inhibición de la via de señalización de BMP en Xenopus, en
conjunto con la activación de la via de FGF, resulta en la inducción de tejido
neural en ectodermo ventral, el cual en condiciones normales da origen a la
epidermis (Delaune et al., 2005). Estos antecedentes indican que la
señalización mediada por FGFs es necesaria para inducir tejido neural junto con
la inhibición de la vía de señalización de las BMPs por sus antagonistas (Figura
3A).
En el ectodermo más dorsal de embriones de Xenopus en etapa de
blástula la señal polarizada de β-catenina induce la expresión de chordin y
noggin, esta región ha sido denominada centro BCNE, por centro de expresión
de chordin y noggin en la blástula (Kuroda et al., 2004) (Figura 3A). Explantes
de BCNE en cultivo forman tejido neural de carácter anterior, lo que indica que
la especificación del neuroectodermo anterior toma lugar en etapas previas a la
gastrulación. De esta manera, la diferenciación del sistema nervioso central
10

anterior en ausencia de mesodermo y por lo tanto del organizador es
completamente dependiente de la señalización materna de β-catenina y puede
ser bloqueada por la inhibición de chordin y noggin mediante el uso de
antisentidos modificados (morfolinos); de manera opuesta la formación del
sistema nervioso central posterior no es afectada y requiere de la actividad de
FGF. Estos resultados son compatibles con los reportados por Kudoh et al.
(2004) en el pez cebra e indican que la actividad de β-catenina en el ectodermo,
independiente del las señales inductivas del organizador, activa la expresión de
los antagonistas de BMP noggin y chordin en el futuro sistema nervioso central
del embrion en el estadio de blástula. Baker et al., (1999), muestran que la
sobreexpresión de wnt-8 y de otros constituyentes de la vía de señalización de
Wnt, tales como, Xfrz, Xdsh y β-catenina conducen a la neuralización de caps
animales de Xenopus, la cual es acompañada por la disminución de la
expresión de Bmp-4. Esta neuralización puede ser inhibida por la coexpresión
de una forma constitutivamente activa del receptor de BMP de tipo I. Estos
antecedentes muestran que la via de señalización de Wnt es necesaria para el
proceso de inducción neural en Xenopus (Figura 3).
11

Figura 3. Modelos de inducción neural basados en estudios en Xenopus (A) y
pollo (B). (A, derecha) En estadio de blástula tardía/gástrula temprana, la señalización
de FGF coopera con la inhibición de BMP para inducir el destino neural (azul)
reprimiendo la transcripción de BMP, inhibiendo la fosforilación de Smad1 e induciendo
la expresión de chordin y noggin. A bajos niveles, FGF parace inducir el destino neural
directamente. Una alta actividad de BMP induce epidermis (amarillo), mientras una alta
actividad de FGF junto con factores relacionados a Nodal (XNRs) inducen mesodermo
(rojo). (A, izquierda) En estadios tempranos (pre-blástula), la distribución de FGFs,
Xnrs, Bmp, chordin y noggin son determinados por la localización nuclear y dorsal de
β-catenina (puntos naranjos) y la localización vegetal del factor de transcripción T-box
VegT (puntos purpuras). (B) Modelo de inducción neural en pollo en base a estudios en
explantes (Wilson y Edlund, 2001). (Izquierda) En estadío de blástula, las células del
epiblasto medial (células neurales presuntivas) expresan FGF pero no Wnts. La
señalización de FGF activa dos vias de transducción: la represión de la expresión de
BMP y la inducción de destino neural a través de una vía independiente de BMP (línea
punteada). (Derecha) Las células del epiblasto lateral (células epidermales presuntivas)
expresan FGF y Wnts. A altos niveles Wnt bloquea la capacidad de las células del
epiblasto de responder a FGFs, así BMP se expresa y su señalización promueve el
destino epidermal y reprime el neural. Cuando la señalización de Wnt es atenuada,
Wnts aun bloquea la capacidad de FGF de reprimir la expresión de BMP, sin embargo,
la vía independiente (línea punteada) se mantiene activa. Bajo estas condiciones los
antagonistas de BMP son capaces de inducir el destino neural (extraido de Stern,
2005).
12

2. Especificación del borde de la placa neural e inducción de las
crestas neurales.
El modelo por defecto propone que una alta actividad de la vía de BMP
define epidermis, mientras que la ausencia de esta señal especifica la placa
neural. En Xenopus y pez cebra, numerosos trabajos apoyan la idea de que
concentraciones intermedias de BMPs especifican el borde de la placa neural,
región que da origen a las crestas neurales y a las placodas sensoriales
(revisado en Aybar y Mayor, 2002; Marchant et al., 1998; Barth et al., 1999;
Tríbulo et al., 2003).
2.1 Posicionamiento del borde de la placa neural.
Se ha propuesto un modelo donde el borde de la placa neural es
posicionado por la acción conjunta de las señales del organizador y el
endodermo sobre el ectodermo, éstas establecen un dominio de expresión de
Bmp-4 en el límite del ectodermo no neural con la placa neural (Pera et al.,
1999; Streit y Stern., 1999). En Xenopus, la manipulación de la señalización de
BMP modifica la posición del borde y se asocia a la expansión o a la reducción
del tamaño de la placa neural (LaBonne y Bronner-Fraser, 1998). Los genes
blanco de BMP, Dlx-3 y Dlx-5, participan activamente en el posicionamiento del
borde de la placa neural y su actividad es necesaria pero no suficiente para
inducir crestas neurales en Xenopus y pollo (Luo et al., 2001; Woda et al., 2003;
McLarren et al., 2003).
2.2 Inducción de las crestas neurales.
Las crestas neurales son una población de células de carácter transitorio,
que inicialmente se localizan en el borde de la placa y luego en la región dorsal
del tubo neural. Estas células antes de adoptar su destino final, migran y
colonizan diferentes regiones del embrión donde dan origen a gran parte del
sistema nervioso periférico, melanocitos, músculo liso y cartilago craniofacial
(Le Douarin, 1982). Las células de las crestas neurales (CN) adoptan diferentes
13

destinos dependiendo de su localización en el eje antero-posterior. Estos
dominios solapados se dividen en: CN craneales o cefálicas, CN del corazón,
CN vagales y sacras y CN del tronco.
En aves y anfibios las CN pueden ser inducidas experimentalmente a
través de la interacción entre la placa neural y el ectodermo no neural (Selleck
and Bronner-Fraser, 1995; Dickinson et al., 1995; Liem et al., 1995). En aves, la
señalización de BMP participa principalmente en la mantención de las crestas
neurales mas que en su inducción (Liem et al., 1997; Liem et al., 1995; Selleck
et al., 1998). En embriones de pollo se ha propuesto que FGF induce la
expresión inicial de msx-1 en el borde de la placa neural, el que a su vez activa
la expresión de Bmp4, la retroalimentación positiva entre estos genes
mantendría su expresión en el borde promoviendo la mantención del destino de
cresta neural (Streit y Stern, 1999; Suzuki et al., 1997; Bei y Maas, 1998; Tucker
et al., 1998; Tríbulo et al., 2003). En Xenopus se ha sugerido que msx-1 inicia la
cascada genética que da cuenta de la especificación de las CN (Tríbulo et al.,
2003). La actividad de msx-1 es necesaria para la expresión de los
especificadores tempranos Snail, Slug y FoxD3 y su sobreexpresión conduce a
la expansión del territorio endógeno de las CN, no observándose expresión
ectópica de marcadores de cresta neural en otras regiones (Tríbulo et al.,
2003). Lo que indica que otras señales presentes en el borde tales como FGF
contribuyen a la actividad de msx-1. Sin embargo, aun no se ha establecido si
FGF es necesario in vivo para la expresión de msx-1 en el borde de la placa
neural (LaBonne y Bronner-Fraser, 1999).
Experimentos de pérdida y ganancia de función sugieren que la vía de
señalización de Wnt es necesaria y suficiente para la inducción de las CN en
embriones de pollo (Garcia-Castro et al., 2002). En Xenopus las evidencias
experimentales sugieren un modelo en que niveles reducidos de BMP en el
borde de la placa neural conducen a una especificación débil de las CN, la cual
sería aumentada y mantenida por señales derivadas del ectodermo no-neural
circundante Wnt, mesodermo para-axial FGF o de la región posterior acido
14

etinoico (RA) (Chang y Hemmati-Brivanlou, 1998; LaBonne y Bronner-Fraser,
1998; Saint-Jeannet et al., 1997; Villanueva et al., 2002) (Figura 4). Las
evidencias presentadas indican que el proceso de inducción de las crestas
neurales es diferente en amniotes y anamniotes y que cuenta al menos de dos
pasos distinguibles. En el primero, las células de una región del ectodermo
definida recibe señales instructivas que las especifican como precursores de
cresta neural. En el segundo, la integración del patrón inicial de expresión
génica de estas células con la actividad de diferentes vías de señalización
mantienen la identidad del tejido y especifica los diferentes destinos celulares
de la cresta neural (Figura 4).
15

16
Figura 4. Modelo de doble
gradiente para la inducción de las
crestas neurales (NC). (a) El
establecimiento de la gradiente
mediolateral de BMP (rojo) en el
ectodermo especifica el borde de la
placa neural como pliegue neural de
carácter anterior (purpura pálido) a
una concentración específica. (b) las
señales posteriorizantes (curva
verde), correspondientes a las
actividades de Wnt, FGFs y RA,
transforman la parte posterior del
borde de la placa neural en células
presuntivas de las NC (púrpura
oscuro). Estas señales son
establecidas en forma de gradiente
con niveles altos en la parte
posterior del ectodermo y bajos en la
región anterior. Estos niveles bajos
de señalización son determinados
por las señales antiposteriorizantes,
tales como Dickkopf y Cerberus
(curva verde). (c) Una vez que el
tubo neural se ha cerrado, algunas
señales inductivas iniciales, tales
como BMPs y Wnts, se expresan en
las regiones dorsales del embrión,
que incluyen la epidermis, NC y la
parte más dorsal del tubo neural.
Estas señales son necesarias para
mantener la especificación de las
células de las NC.
A, anterior; P, posterior; M, medial;
L, lateral; D, dorsal; V, ventral
(extraido de Aybar y Mayor, (2002)).

3 Neurogénesis embrionaria de Xenopus laevis.
3.1 Genes que conectan la inducción neural con la neurogenesis.
En el ectodermo ventral la actividad de las BMPs promueve la expresión
de al menos tres clases de genes: los genes homeobox específicos ventrales
(ej. PV.1 y Xvent1), GATA1 y msx-1. Estos genes promueven directamente la
epidermogenesis en el ectodermo y bloquean la neuralización inducida por la
inhibición de la señalización de las BMPs (Ault et al., 1997; Suzuki et al., 1997;
Xu et al., 1997) (Figura 5). De manera opuesta, inmediatamente rio abajo de la
inducción neural se activa un grupo de genes que promueven el destino neural
en las células del ectodermo dorsal. Estos efectores neurales o genes
neuralizantes incluyen a miembros de las familias de factores transcripcionales
Iroquois, Sox y Zic; los factores transcripcionales de dedos de zinc XSIP1/ZEB y
Kheper; y la proteína coiled-coil, Geminin. Los transcritos de estos genes son
detectados desde la gástrula media en el neuroectodermo presuntivo y su
sobreexpresión es suficiente para neuralizar el ectodermo no-neural
competente (revisado en Sasai, 1998; Bainter et al., 2001) (Figura 5).
17
Figura 5. Modelo de la
cascada regulatoria de
la diferenciación
neural. Los genes con
actividad neuralizante se
indican en naranjo. Los
genes epidermalizantes
son regulados positivamente
por la
señalización de BMP-4,
se muestran en celeste
(modificado de Sasai,
1998).

3.2 Neurogénesis primaria en Xenopus laevis.
Una vez que la placa neural se ha establecido, el siguiente paso es la
especificación de los dominios neurogénicos, donde un subgrupo específico de
células mitoticamente activas de la capa profunda del neuroepitelio dejará el
ciclo proliferativo y se diferenciará hacia el destino neuronal o glial. Estas
células constituyen el sistema nervioso central del renacuajo de Xenopus
(Hartestein, 1989; Chitnis, 1999, Chalmers et al., 2002). En el embrión de
vertebrado como en la mosca, este paso se lleva acabo principalmente por la
actividad de los genes proneurales, los cuales se expresan en tres columnas
simétricas y bilaterales con respecto al eje mediolateral del embrión de Xenopus
(revisado en Chitnis, 1999; Diez del Corral y Storey, 2001). En los dominios
interneurogénicos la expresión de los genes del prepatrón definen las regiones
de la placa donde la neurogenesis no es permitida hasta etapas más tardías del
desarrollo, donde otra onda de diferenciación da origen a gran parte del sistema
nervioso central del adulto, este proceso se denomina neurogénesis
secundaria. En esta sección me referiré principalmente al proceso de
neurogénesis primaria, desde los mecanismos asociados al establecimiento de
los dominios neurogénicos, hasta la diferenciación neuronal terminal.
3.2.1 Determinación y diferenciación neuronal en Drosophila,
genes proneurales.
Hacia 1970 se identificó en Drosophila un complejo de genes que
participan en los primeros pasos del desarrollo neural, el análisis genético y
molecular condujo al aislamiento de cuatro genes de este complejo: achaete
(ac), scute (sc), lethal of scute (lsc) y asense (as) (Garcia-Bellido, 1979; Villares
y Cabrera, 1987). Más recientemente se aislaría atonal (ato) el cual junto a
amos y cato define otra familia de genes proneurales. Las proteínas de las
familias achaete/scute (asc) y ato comparten características que las definen
como proneurales. En primer lugar, los genes proneurales se expresan en
grupos de células ectodermales denominadas “clusters proneurales”, los cuales
18

se distribuyen en un patrón que precede a la distribución de los progenitores
neurales en el sistema nervioso periférico y central (Campuzano y Modolell,
1992). En segundo lugar, el análisis genético ha revelado que la actividad de los
genes de las familias asc y ato son suficientes y necesarios para promover la
generación de progenitores neurales desde el ectodermo (Jan y Jan, 1994;
Jimenez y Modolell, 1993). Finalmente, todos los genes proneurales conocidos
pertenecen a la clase de factores de transcripción del tipo bHLH (basic helixloop-helix),
los cuales se unen al DNA como complejos heterodiméricos
formados con proteínas bHLH de expresión ubicua, denominadas proteínas E,
las cuales son codificadas en Drosophila por el gen daugtherless y en
vertebrados por los genes E2A, HEB y E2-2 (Cabrera y Alonso, 1991; Massari y
Murre, 2000; Bertrand et al., 2002).
3.2.2 Selección de progenitores neurales, genes neurogénicos y el
mecanismo de inhibición lateral.
Los genes neurogénicos regulan negativamente la actividad de los genes
proneurales del complejo asc a través de un proceso denominado inhibición
lateral. Este proceso es una forma local de interacción célula-célula que
funciona dentro de un cluster proneural para limitar el número de células que
dan origen a los neuroblastos (Muskavitch, 1994). Los neuroblastos nacientes
expresan Delta, el cual codifica para un ligando de membrana que une y activa
al receptor Notch en las células vecinas del cluster (Figura 6). La activación de
Notch induce a los genes del complejo hairy/Enhancer of split E(spl), en
vertebrados Hes, Her y Esr, los cuales inhiben la transcripción de los genes
proneurales (Chen et al., 1997; Ohsako et al., 1994; Van Doren et al., 1994) y
aparentemente interfieren con la formación del complejo proneural-proteína-E
(Davis y Turner, 2001; Kageyama y Nakanishi, 1997) (Figura 6). La inhibición de
los genes proneurales via Notch no sólo inhibe a la célula de adoptar el destino
neural, sino que también reduce la expresión de Delta. Así estas interacciones
amplificarían las pequeñas diferencias entre el potencial de las células de
19

adoptar el destino neural para finalmente restringir la actividad proneural a una
sola célula del cluster (Figura 6).
Figura 6. Selección de progenitores neurales a través del mecanismo de
inhibición lateral. En Drosophila las células de los cluster proneurales y en Xenopus
las células de los dominios neurogénicos expresan tempranamente niveles similares de
genes proneurales y del ligando de Notch, Delta. La expresión de Delta es inducida por
la actividad proneural y señaliza a la célula vecina a través de Notch a la inhibición de
la expresión y de la actividad de los genes proneurales. A través del mecanismo de
inhibición lateral, las pequeñas diferencias de actividad proneural entre las células es
amplificada y una célula del cluster proneural adquiere el destino neuronal. Los genes
proneurales activan la expresión de Hes6, XCoe2 en vertebrados y de Senseless en
Drosophila, estos forman un loop autoregulatorio con los genes proneurales. Senseless
y Hes6 interfieren con el mecanismo de inhibición lateral, el primero reprimiendo a los
genes del complejo E(spl) y el segundo inactivando a nivel postranscripcional a Hes1.
En vertebrados, los genes proneurales activan la expresión de Myt-1, el que confiere a
la célula la capacidad de escapar a la inhibición lateral (extraido de Bertrand et al.,
2002).
3.2.3 Determinación y diferenciación neuronal en Xenopus, genes
proneurales y neurogénicos.
Se ha descrito que las proteínas de la familia bHLH funcionan como
factores de determinación de tipos celulares en diferentes tejidos y organismos
(Weintraub, 1993; Jan y Jan 1994). Dentro de un linaje dado, estos factores
usualmente funcionan en cascadas, por ejemplo, al menos cuatro proteínas
bHLH se expresan secuencialmente durante el desarrollo del músculo de raton:
MyoD/myf5, myogenin y MRF4 (Olson y Klein, 1994). De manera similar, en la
neurogenesis de los organos sensoriales periféricos de Drosophila, la expresión
20

de ac y sc es seguida por la de as (Brand et al., 1993; Dominguez y
Campuzano, 1993; Jarman et al., 1993).
En Xenopus la activación de la cascada genética que da cuenta de la
diferenciación neuronal en los dominios neurogénicos se inicia con la expresión
del gen perteneciente a la familia de proteínas bHLH neurogenin-related 1 (Xngnr-1)
(Figura 7). La expresión X-ngnr-1 se detecta desde la gástrula temprana
(estadio 10.5) en la placa neural presuntiva de manera difusa mientras que la
expresión de X-Delta-1 aun no es detectada. En estadío 11.5 ambos genes se
expresan manera punteada en tres parches bilaterales con respecto al eje
mediolateral del embrión, lo que indica que la expresión de X-ngnr-1 prefigura la
expresión de X-Delta-1 (Bellefroid et al., 1996; Ma et al., 1996). Estos parches
definen los territorios medial, intermedio y lateral, desde donde posteriormente
se diferenciarán las motoneuronas, interneuronas y neuronas sensoriales
primarias, respectivamente (Ma et al., 1996) (Figura 8). En este estadio aún no
se detecta la expresión de XNeuroD, que tambien pertenece a la familia bHLH,
ni de N-tubulin, que es un marcador de neuronas recién diferenciadas
(Oschwald et al., 1991; Lee et al. 1995). En estadío 13.5 el mRNA de XNeuroD
es detectado en finas bandas de células solapándose con el dominio de
expresión más amplio de X-ngnr-1. La misma secuencia de expresión es
detectada en la placoda trigeminal. La sobreexpresión de X-ngnr-1 resulta en la
expresión ectópica y prematura de X-Delta-1, XNeuroD y N-tubulin en el
ectodermo neural y no neural, con un patrón menos punteado que el normal. De
manera semejante, la sobreexpresión de XNeuroD resulta en neurogénesis
ectópica y prematura, sin activar la expresión de X-ngnr-1 (Lee et al., 1995; Ma
et al., 1996). El fenotipo neurogénico asociado a la sobreexpresión de X-ngnr-1
y XNeuroD junto con su patrón de expresión secuencial sugieren que estos
genes forman una cascada unidireccional en la cual X-ngnr-1 induciría la
expresión de XNeuroD y este a su vez la de N-tubulin (Figura 7). La activación
constitutiva de la vía de Notch, a través de la expresión de su dominio
intracelular (Notch ICD ), inhibe la expresión de X-ngnr-1 y su capacidad de inducir
21

neuronas ectópicas cuando es sobreexpresado. De manera opuesta, el bloqueo
de la inhibición lateral mediante la expresión de una forma dominante negativa
de X-Delta-1 (X-Delta-1 stu ) incrementa la densidad de celulas X-ngnr-1 positivas
en los dominios neurogénicos (Ma et al., 1996). Estos datos junto al patrón de
expresión punteado de X-ngnr-1, XNeuroD y N-tubulin en los dominios
neurogénicos indican que al igual que en Drosophila la expresión de los genes
proneurales es regulada por el mecanismo de inhibición lateral (Figura 6 y 7).
Figura 7. Modelo de la cascada genética que controla la determinación y
diferenciación neuronal. Los genes neuralizantes y la actividad de los genes del
prepatrón inducén la expresión de X-ngnr-1 y el inicio de la cascada neurogénica. En
rojo se representan los genes proneurales de la familia bHLH, en amarillo los genes
neurogénicos, en naranja los efectores de los proneurales y moduladores de la
cascada y en azul los genes neuronales estructurales. A la derecha se representa una
célula vecina donde la neurogénesis ha sido inhibida por el mecanismo de inhibición
lateral.
3.3 Posicionamiento de los cluster proneurales, genes del
prepatrón.
En Drosophila la expresión de los genes del complejo asc en cada
cluster proneural es dirigida por elementos reguladores en cis (enhancers) que
22

se encuentran en regiones de DNA no transcrito aledañas a las unidades
trancripcionales del complejo. Estos enhancer responden a una combinación de
factores trancripcionales codificados por los genes denominados del prepatrón,
cuya expresión precede a los del complejo asc y es controlada por la
combinación de señales secretadas desde diferentes regiones del tejido. Entre
estas se encuentran Decapentaplegic (Dpp, el homólogo de Bmp en
Drosophila) y Wingless (Wg, una proteína Wnt) (Gomez-Skarmeta et al., 2003).
3.3.1 Establecimiento de los dominios neurogénicos en Xenopus
laevis.
En Xenopus, el mecanismo que da cuenta del establecimiento de los
dominios neurogénicos durante la neurogénesis primaria aún no ha sido
claramente dilucidado. Sin embargo, existen evidencias que indican que las
vías de señalización de Sonic hedgehog (Shh) (Brewster et al., 1998), ácido
retinoico (RA) (Franco et al., 1999; Sharpe y Goldstone, 2000) y Wnt (Gomez-
Skarmeta et al., 1998; Bellefroid et al., 1998) dirigen la expresión de un puñado
de factores transcripcionales que participan en el establecimiento del prepatrón.
Shh se expresa en la notocorda y en la placa del piso y se ha descrito
que especifica el destino de las células de la región ventral del tubo neural
(Ekker et al., 1995). Junto con esto, la sobreexpresión de Shh conduce a la
expansión de la placa neural y a la inhibición de la neurogénesis (Franco et al.,
1999). Shh activa la expresión de Zic2 en la placa neural como bandas
longitudinales que se alternan a los dominios neurogénicos, además, Zic2 se
expresa en los pliegues neurales y en anterior adyacente a la placoda trigeminal
(Brewster et al., 1998) (Figura 8). Zic2 codifica para un represor transcripcional
de dedos de zinc perteneciente a la superfamilia de proteínas Gli, las cuales
son la contraparte en vertebrados del gen de Drosophila Cubitus interruptus (Ci)
el cual media la señalización de hedgehog (Alexandre et al., 1996; Dominguez
et al., 1996), controla la expresión de ato en el ojo de Drosophila (Baker y Yu,
1997) y de araucan y caupolican en algunos dominios del disco de ala (Gomez-
23

Skarmeta et al., 1996) . Zic2 suprime la neurogénesis a través de la inhibición
de la expresión y actividad de X-ngnr-1 en los dominios interneurogénicos
mientras que los genes Gli1-3 inducen la diferenciación neuronal (Figura 8).
Los retinoides endógenos forman una gradiente que va de posterior a
anterior en embriones tempranos de Xenopus (Chen et al., 1994), esta
gradiente participaría en la especificación del eje anteroposterior (Durston et al.,
1989). En la placa neural, el tratamiento con RA inhibe la expresión de Shh y
Zic2 e induce la expansión de los dominios de expresión de Gli3, X-ngnr-1, X-
Myt1, X-Delta-1 y N-tubulin a través de un mecanismo independiente de la
inhibición de la actividad de Notch . Además se determinó que el tratamiento
con RA no es capaz de contraarrestar el efecto antineurogénico de Shh o Zic2
(Franco et al., 1999; Sharpe y Goldstone, 2000). Estos resultados sugieren que
la vía de RA se encuentra rio arriba de la vía de Shh.
24
Figura 8: Neurogénesis
primaria en Xenopus laevis.
Caracterización de un embrión en
estadio de placa neural desde
una vista dorsal. Las primeras
neuronas (círculos) que aparecen
en la placa neural se organizan
bilateralmente en tres bandas
longitudinales las cuales son
determinadas por la expresión de
X-ngnr-1 (amarillo). Desde la
línea media (flechas) la
señalización de Shh contribuye a
la formación del patrón mediolateral.
La expresión de X-ngnr-1
es inducida por Gli1, 2 y 3, y es
reprimida por Zic2 que se
expresa en bandas longitudinales
intercaladas (purpura). m,
motoneuronas; i, interneuronas; l,
neuronas sensoriales; tg, ganglio
trigémino. (extraido de Diez del
Corral y Storey, 2001),

Al igual que en Drosophila los genes regulados por la via de Wnt, Xiro1,
Xiro2 y Xiro3, contribuyen al posicionamiento de los dominios neurogénicos en
Xenopus (Gomez-Skarmeta et al., 1998; Bellefroid et al., 1998) (Figura 7). La
expresión de los genes Xiro en la placa neural precede a la de los genes
proneurales X-ngnr-1, Xash3 y Xath3 e incluye parcialmente sus dominios de
expresión. Junto con esto se ha mostrado que los genes Xiro inducen la
expresión de los genes proneurales en combinación con factores presentes en
el tejido neural, inhiben directamente la expresión de X-Delta-1 y promueven la
mantención del ciclo proliferativo en los precursores neurales mediante la
inhibición de XGadd45-γ (Gomez-Skarmeta et al., 1998; de la Calle-Mustienes
et al., 2002), el cual codifica para una proteína reguladora del ciclo celular que
promueve la detención del ciclo en la transición G2/M (Wang et al., 1999) o
G1/S (Zhang et al., 2001). Estos antecedentes en conjunto sugieren que los
genes Xiro participan en el posicionamiento de los dominios neurogénicos.
Xdbx pertenece a la familia de genes hlx que codifican para factores
transcripción que poseen homeodominio, se expresa en el dominio
interneurogénico medio adyacente al dominio de expresión de N-tubulin. Su
expresión se solapa con la de Xash3, un homólogo en Xenopus de los genes
pertenecientes al complejo asc de Drosophila con actividad proneural (Gershon
et al., 2000; Zimmerman et al., 1993; Chitnis y Kintner, 1996) (Figura 7). Xdbx
inhibe la determinación y diferenciación neuronal en el dominio interneurogénico
más medial a través de la inhibición la función neurogénica de Xash3 sin alterar
su expresión (Gershon et al., 2000) (Figura 7).
Si bien el mecanismo de control y posicionamiento de la neurogénesis en
la región posterior de la placa neural comienza a revelarse, mucho menos se
sabe acerca de los factores que controlan la diferenciación neuronal en la placa
neural anterior. Las células de esta región inician la diferenciación neuronal en
estadios posteriores a las células de la placa neural posterior (Hartenstein,
1989; Eagleson et al., 1995). Se ha aislado un grupo de genes que participarían
en el posicionamiento de la neurogénesis en la placa neural anterior, los cuales
25

etrasan la diferenciación neuronal y/o promueven la proliferación. Entre estos
genes se encuentran XBF-1, Xanf-1, Xsix3, Xoptx2 y Xrx1 (Bourguinon et al.,
1998; Ermakova et al., 1999; Zuber et al., 1999; Bernier et al., 2000; Hardcastle
and Papalopulu 2000, Andreazzoli et al., 2003)
3.4 Factores que modulan la actividad proneural de las proteínas
bHLH.
Los genes que se encuentran rio abajo de neurogenin, NKL, X-Myt1,
Hes6 y Xebf2/Xcoe2 modulan el proceso de neurogénesis (Figura 7). NKL
funciona como un regulador positivo de la neurogénesis rio abajo de X-ngnr-1
activando Xath3 y X-Myt1 y que facilita el tránsito de precursor determinado a
neurona posmitótica (Lamar et al., 2001) (Figura 7). Se ha sugerido que X-MyT1
interactúa con los genes proneurales para conferir a la célula la capacidad de
escapar a la inhibición lateral y promover el compromiso hacia el destino
neuronal (Bellefroid et al., 1996) (Figura 7). Finalmente, Hes6 y Xebf2/Xcoe2
promueven la diferenciación neuronal incrementando los niveles de X-ngnr-1
durante la fase de determinación de la neurogénesis a través de la formación de
un loop de retroalimentación positiva con X-ngnr-1 (Koyano-Nakagawa et al.,
2000; Dubois et al., 1998) (Figura 7).
Una vez que los progenitores neuronales han sido determinados y
seleccionados, la actividad de XNeuroD induce la expresión de otro grupo de
genes entre los cuales se encuentran Xebf3 y XETOR, los cuales que
promueven la diferenciación neuronal terminal y la expresión de los genes
neuronales estructurales (Pozzoli et al., 2001; Logan et al., 2005; Koyano-
Nakagawa y Kintner, 2005). La activación de estos reguladores
transcripcionales que participan en la regulación de la neurogénesis en pasos
anteriores sugiere que durante la neurogenesis se establece un fino control a
través de la formación de loops de retroalimentación (Figura 7).
26

4. REST/NRSF y la regulación de la expresión de los genes
neuronales que codifican para proteínas estructurales.
El último paso de la diferenciación neuronal conduce a la adquisición de
las características genéricas de las neuronas, tales como la conectividad y la
excitabilidad eléctrica. Este proceso depende tanto de la culminación de la
cascada neurogénica articulada por los genes proneurales como también de la
extinción de la expresión y/o de la inhibición de la actividad de reguladores
negativos de la transcripción de los genes neuronales estructurales. Se ha
propuesto que el Silenciador de la Transcripción del Elemento Represor o
Factor Silenciador Neuronal Restrictivo (REST/NSRF) juega un rol central en
este proceso.
REST/NRSF es una proteína que pertenece a la familia de represores
transcripcionales Gli-Krüppel; REST/NRSF se une al elemento represor-
1/elemento silenciador neuronal restrictivo (RE-1/NRSE) presente en el
promotor de numerosos genes neuronales estructurales silenciando su
expresión en líneas celulares no neuronales y en precursores neurales
indiferenciados (Chong et al., 1995; Schoenherr y Anderson., 1995). RE-
1/NRSE es una secuencia de 23 pb ubicada en la región reguladora de
alrededor de 1000 genes de expresión neural que fue descubierto por su
capacidad de silenciar la expresión del canal de sodio dependiente de voltaje
Nav1.2 y de la molécula asociada al citoesqueleto SCG10 en líneas celulares
no neuronales y neuronales indiferenciadas (Kraner et al., 1992; Mori et al.
1992; Schoenherr et al., 1996; Lunyak et al., 2002). REST/NRSF (humana) es
una proteína de 1097 aminoácidos que contiene un grupo de 8 dedos de zinc
del tipo C2H2 entre los aminoácidos 106 y 357, un noveno en el extremo
carboxilo terminal entre los aminoácidos 1062 y 1082, y una señal de
localización nuclear 485 aminoácidos río arriba del codón de término (Figura 9).
La expresión de REST/NRSF es suficiente para silenciar la transcripción de
27

genes reporteros (ej. lacZ) que contienen un RE-1/NRSE en su promotor
(Chong et al., 1995; Schoenherr y Anderson., 1995).
Figura 9. Estructura función de REST/NRSF. REST/NRSF une al RE-1/NRSE
presente en el promotor o en regiones reguladoras de los genes neuronales
estructurales a través de los primeros ocho dedos de zinc (bandas rojas). El noveno
dedo de zinc es necesario para reclutar a CoREST. El primer dominio sant de CoREST
es necesario para su unión a REST/NRSF (rosado claro). REST/NRSF interactúa con
mSin3 a través del dominio amino terminal. Los dominios PAH 1 y 2 (purpura claro) de
mSin3 son necesarios para su unión a REST/NRSF. Tanto CoREST como mSin3
reclutan HDACs 1 y 2 (extraido de Ballas et al., 2001)
4.1 Estructura función de REST/NRSF.
El análisis de estructura-función de REST/NRSF muestra que los
primeros ocho dedos zinc participan en la unión a RE-1/NRSE (Chong et al.,
1995; Tapia–Ramírez et al., 1997) y que posee dos dominios represores con
actividad independiente, uno localizado en la región amino terminal (aa 43-83) y
el otro en el carboxilo terminal (989-1097) cuya actividad requiere de la
conservación del noveno dedo de zinc (Tapia–Ramirez et al., 1997; Thiel et al.,
1998) (Figura 9). REST/NRSF interactúa con los corepresores mSin3a (Huang
et al., 1999; Naruse et al., 1999; Grimes et al., 2000; Roopra et al., 2000) y
CoREST (Andrés et al., 1999; Ballas et al., 2001) a través de los dominios
amino-terminal y carboxilo-terminal, respectivamente (Figura 9). Éstos a su vez
reclutan multiples cofactores y reguladores negativos de la transcripción los
cuales se pueden dividir funcionalmente en los que se asocian a un modo
dinámico de represión, es decir, que pueden alternar entre represión y
activación en el corto plazo, y los que se asocian al silenciamiento génico de
28

largo plazo (revisado en Ballas y Mandel, 2005). Uno de los mecanismos de
regulación transcripcional de corto plazo es la modulación del nivel de
acetilación de las colas aminoterminales de las histonas del “core” del
nucleosoma. Esta modulación ocurre a través de la acción opuesta de las
acetilasas (HATs) y desacetilasas de histonas (HDACs), las que establecen
patrones específicos de hiper o hipoacetilación, los cuales se asocian a la
activación y represión transcripcional, respectivamente (Narlikar et al., 2002).
Tanto mSin3 como CoREST reclutan desacetilasas de histonas (HDACs) del
tipo 1 y 2, las cuales son necesarias para la actividad represora de REST/NRSF
en contextos celulares y genes específicos (Grimes et al., 2000; Roopra et al.,
2000; Naruse et al., 1999; Huang et al., 1999; Ballas et al., 2001; Humphrey et
al., 2001; You et al., 2001) (Figura 9).
4.2 Mecanismos moleculares de represión y silenciamiento
génico .
4.2.1 Mecanismo de inhibición de la transcripción en células noneuronales.
A diferencia de mSin3, CoREST está presente sólo en organismos que
poseen sistema nervioso, lo que sugiere un mayor nivel de especialización para
este corepresor en el contexto neural (Dallman et al., 2004). El complejo
REST/NRSF-CoREST puede formar inmunocomplejos con la metiltransferasa
de lisina 9 de la histona H3 (H3-K9), G9a (Roopra et al., 2004) y la demetilasa
de la lisina 4 de la histona H3 (H3-K4) LSD1 (Shi et al., 2004), ambos de los
cuales median modificaciones de la cromatina asociadas con el silenciamiento
génico de largo plazo y son necesarias para el silenciamiento mediado por
REST/NRSF-CoREST en células no neuronales diferenciadas (Roopra et al.,
2004; Shi et al., 2004) (Figura 10). Junto con esto CoREST recluta al sitio RE-1
otro tipo de maquinaria silenciadora, que incluye a la proteína de unión a DNA
metilado MeCP2 y otra metiltransferasa (H3-K9) denominada SUV39H1
(Lunyak et al., 2002). Los efectos de estas modificaciones en conjunto se
29

manifiestan en la desacetilación de histonas, en la ausencia de metilación en
H3-K4, y en la presencia de metilación en H3-K9, lo que crea sitios de unión a
la proteína heterocromática 1 (HP1) y a la condensación de la cromatina blanco
(Figura 10) (Ballas y Mandel, 2005). Luniak et al., (2002), proponen que el
reclutamiento de esta maquinaria silenciadora a través del complejo
REST/NRSF-CoREST conduce al silenciamiento de largos intervalos
cromosómicos que incluyen a genes neuronales que no poseen RE-1/NRSE.
La metilación del DNA en los residuos citosina de los dinucleotidos CpG
del genoma representa otra modificación epigenética con la cual REST/NRSF-
CoREST interactuaría (Lunyak et al., 2002; Ballas et al., 2005). La metilación
del DNA puede interferir con la transcripción por la repulsión o atracción de
proteínas que unen DNA. El RE-1/NRSE contiene un dinucleótido CpG y
estudios recientes han revelado que este sitio como la región reguladora
circundante de los genes neuronales se encuentran metilados en células noneuronales
diferenciadas (Ballas et al., 2005) (Figura 10). Junto con esto
Chenoweth y Mandel (datos no publicados), poseen datos que indican que la
DNA metitransferasa DNMT1, la cual interactúa con la histona metiltransferasa
H3-K9 (Fuks et al., 2003), se encuentra asociada a la región RE-1/NRSE en la
cromatina de genes neuronales (Figura 10). Es importante recalcar que la unión
de REST/NRSF al RE-1/NRSE es independiente del estado de metilación del
DNA (Ballas et al., 2005). El represor MeCP2 une DNA metilado y recluta
modificadores adicionales con actividad HDAC e histona metiltransferasa H3-K9
(Jaenisch y Bird, 2003). Lo que sugiere, como se ha demostrado en otros
modelos, que la metilación de histona H3-K9 regula la metilación del DNA y
viceversa (Ballas y Mandel, 2005) (Figura 10).
30

Figura 10. Mecanismo de silenciamiento de los genes neuronales estructurales
en células no-neuronales diferenciadas. REST-CoREST recluta un complejo
modificador de la cromatina que incluye HDACs 1y 2, demetilasa de histona en K4, y la
metiltransferasas de histonas en K9 (HMTasesK9). La metilación en los residuos de
lisina 9 (mK9) forma sitios de unión para la proteína de heterocromatina 1 (HP1) la que
promueve la condensación de la cromatina. El RE-1/NRSF y las regiones adyacentes
se encuentran metiladas en CpG (m) las que se asocian a MeCP2. MeCP2 también se
asocia al complejo Sin3-HDAC. La metiltranferasa de DNA (DNMT1) es reclutada a los
sitios metilados adyacentes al RE-1/NRSF. Junto con esto REST/NRSF recluta a la
SCP la que bloquearía la actividad de la RNA pol II (extraido de Ballas y Mandel,
2005).
4.2.2 Mecanismo de regulación en células troncales embrionarias.
El silenciamiento de la cromatina de los genes neuronales estructurales
en células no-neuronales diferenciadas es estable, heredable y se conserva a a
lo largo de la vida del animal. En contraste, las células troncales embrionarias,
que también son no-neuronales, aun poseen la capacidad de proliferar y la
competencia para dar origen a distintos destinos celulares. Esto sugiere que el
mecanismo de silenciamiento en las células troncales embrionarias (ESCs) y en
progenitores neurales (NPs) podría ser diferente al de las células no-neuronales
diferenciadas (DNNCs) (Ballas y Mandel., 2005). Al igual que en las DNNCs,
REST/NRSF está unido al RE-1/NRSE junto a los cofactores CoREST, mSin3,
HDACs y MeCP2 en las ESCs, y a diferencia de las DNNCs la región genómica
circundante al RE-1 no se encuentra metilada en CpG, ni en K9 de la histona
H3 y se observa una disminución en los niveles de la metiltransferasa G9
31

(Ballas et al., 2005) (Figura 11). La cromatina de los genes neuronales en ESCs
está enriquecida en di- y trimetilación de K4 en la histona H3 (Ballas et al.,
2005), modificación que está asociada normalmente con genes en transcripción
activa (Sims et al., 2003). Junto con esto, en ESCs y no en DNNCs la RNA
polimerasa II se encuentra presente en los sitios RE-1 de la región 5’ no
traducida de numerosos genes neuronales (Ballas et al., 2005) (Figura 11). Yeo
et al., (2005), muestran que REST/NRSF reclutaría a la fosfatasa pequeña 1 del
carboxilo terminal de la RNA Pol II (SCP1) a los promotores de genes
neuronales que poseen RE-1. SCP1 fosforila el dominio carboxilo terminal de la
RNA Pol II e inhibe su actividad. Al igual que REST/NRSF se expresa en tejido
no neuronal y progenitores neurales de la medula espinal. La pérdida de función
de SCP1 conduce a la activación de genes neuronales blancos de REST/NRSF.
La pérdida de función de REST/NRSF en conjunto con la de SCP1 resulta en
una mayor activación de genes neuronales en células troncales P19. Aunque la
evidencia experimental no descarta que SCP1 sea reclutada a los promotores
de genes neuronales o de genes que promueven la diferenciación neuronal por
otros factores de unión a DNA. Los resultados expuestos sugieren que
REST/NRSF funciona como un andamio molecular para SCP1 y de esta
manera es compatible con la idea de que SCP1 forma parte del mecanismo por
el cual REST/NRSF inhibe la actividad de la RNA Pol II en los genes neuronales
de ESCs (Yeo et al., 2005) (Figura 11). Junto con la modulación de la RNA Pol
II, la actividad de HDACs y las modificaciones epigenéticas de la cromatina de
genes neuronales en células troncales mediada por REST/NRSF es compatible
con un estado inactivo, pero permisivo a una activación subsecuente.
Claramente existen diferencias en el estado de represión de los genes
neuronales en células troncales y en células no-neuronales diferenciadas. Si
bien en ambos estados se encuentra presente la actividad HDAC, la inhibición
de esta actividad sólo libera la represión de los genes neuronales en ESCs y en
células troncales neurales de adultos (Ballas et al., 2005). Estos datos son
concordantes con la evidencia que muestra que la expresión de una quimera
32

que consta de el dominio de unión a DNA de REST/NRSF fusionado a dominio
de activación de VP16 en células troncales neurales o en progenitores
musculares induce la diferenciación neuronal (Su et al., 2004; Watanabe et al.,
2004).
Figura 11. Mecanismo de represión mediado por REST/NRSF en células troncales
embrionarias y progenitores neurales. REST-CoREST-mSin3 recluta un complejo
represor que consta principalmente de HDACs 1 y 2. La RNA pol II se encuentra
asociada a la cromatina de los genes neuronales, probablemente debido a la laxitud
del estado de compactación de la cromatina en comparación con la que se encuentra
en células no-neuronales diferenciadas. El RE-1/NRSE y la región adyacente no se
encuentra metilada y las histonas están metiladas en K4 (mK4). La metilación de las
histonas en K4 sugiere que la metiltransferasa H3-K4 (HMTase K4) se encuentra
presente en el RE-1/NRSE. La presencia de SCP1 no ha sido confirmada, pero los
estudios funcionales sugieren que estaría presente sobre el RE-1. SCP1 podría
mantener la RNA Pol II en un estado de mínima actividad (extraido de Ballas y Mandel,
2005).
4.2.3 REST/NRSF y el estado de la cromatina desde progenitores
neurales a las neuronas diferenciadas.
Se ha propuesto que el transito de células troncales embrionarias a
progenitores neurales está asociado a la degradación postraduccional de
REST/NRSF (Ballas et al., 2005). ESCs de raton tratadas durante 3 dias con
acido retinoico (RA) presentan una tasa de transcripción constante y los niveles
del mRNA de REST/NRSF detectados representan el 50% de los detectados en
ESCs no tratadas. En contraste, luego de 24 horas con RA la proteína
REST/NRSF es degradada vía proteosoma. El análisis de progenitores
33

corticales aislados y tratados con RA durante 3 dias en presencia de FGF
confirma los resultados observados en ESCs. Sorprendentemente, REST/NRSF
permanece unido al RE-1 de genes neuronales en los progenitores corticales.
Luego, durante la diferenciación de los progenitores hacia neuronas maduras,
REST/NRSF se desplaza de los RE-1 y además en neuronas posmitóticas es
regulado negativamente a nivel transcripcional aparentemente a través de la
acción directa del complejo represor asociado al receptor de ácido retinoico
(Ballas et al., 2005).
Se han propuesto otros mecanismos asociados a la modulación de
REST/NRSF durante el transito hacia neuronas diferenciadas.
BRAF35/HMG20b es un miembro de la familia de proteínas con una caja HMG
que une cromosomas en mitosis y que ha sido relacionado con la progresión del
ciclo celular (Marmorstein et al., 2001). BRAF35 es un componente del
complejo BRAF35-HDAC (BHC), este complejo multiprotéico cuenta con la
demetilasa de histonas LSD1, HDACs 1 y 2 y CoREST. BHC interactúa con
REST/NRSF a través de CoREST y participa en la represión de los genes
neuronales con RE-1 en tejido no neuronal y progenitores neurales (Hakimi et
al., 2002). Consistente con su actividad BRAF35 se expresa en progenitores
corticales indiferenciados, mientras que iBRAF, la cual es otra proteína de la
familia que posee la capacidad de inhibir la función de BRAF35, se expresa de
manera extendida en el cerebro de ratón, especialmente en la región más
externa de la corteza de embriones de estadio E16.5, donde se encuentran las
neuronas maduras. La expresión ectópica de iBRAF en líneas celulares de
carcinoma embrionario P19, libera la represión medida por REST/NRSF e
induce la expresión de sinapsina y NeuroD2, el cual es un blanco de
REST/NRSF (Bruce et al., 2004). El incremento de la expresión de sinapsina en
progenitores que han sido inducidos a la diferenciación se correlaciona con una
disminución de la ocupación de BRAF35 en su promotor y con un aumento de
la ocupación de iBRAF. Junto con esto, se observó aumento de tri-metilación
de K4 de la histona H3, pero no de acetilación. El aumento en la metilación
34

estaría dado por el reclutamiento de la metiltransferasa MLL al promotor de
sinapsina por iBRAF. Finalmente se demostró que la depleción de iBRAF de los
progenitores inducidos a diferenciarse inhibe la diferenciación neuronal y el
aumento de la metilación en K4-H3 (Wynder et al., 2005).
En contraste a la diferenciación durante la embriogénesis, el mecanismo
asociado a la diferenciación de células troncales neurales hipocampales parece
ser diferente. Recientemente se aisló desde hipocampo un RNA de doble hebra
con homología al RE-1/NRSE (NRSEdsRNA) que modularía la actividad de
REST/NRSF (Kuwabara et al., 2004). El análisis de su expresión durante la
diferenciación de los progenitores in vitro muestra que los niveles de
NRSEdsRNA aumentan progresivamente hasta la maduración de las neuronas,
donde empieza a decaer. La expresión ectópica de NRSEdsRNA en cultivos de
progenitores conduce a la adquisición del destino neuronal y no al de astrocitos
u oligodendrocitos. La hipótesis de que NRSEdsRNA funciona como un
miRNA/siRNA queda practicamente descartada ya que el mensajero de
REST/NRSF no posee una secuencia semejante al NRSE. Junto con esto, la
expresión de NRSEdsRNA no altera los niveles del mRNA de NRSF/REST.
Tanto en progenitores como en oligodendrocitos y astrocitos, los promotores de
SCG10 y mGluR2 permanecen unidos a NRSF/REST y HDAC1. Además, en el
caso del promotor de mGluR2 se detectó MECP2 y MBD1, las cuales son
reclutadas por REST/NRSF (Lunyak y cols., 2002). La expresión de
NRSEdsRNA en progenitores conduce a la disminución de la asociación de las
proteínas represoras MeCP2, MBD1 y HDAC1 con RE-1/NRSE y a la activación
de los genes neuronales. Sin embargo, NRSF/REST permanece unido al RE-
1/NRSE lo que sugiere que NRSEdsRNA posee una función activadora
(Kuwabara et al., 2004). Estos resultados en conjunto sugieren que: (1)
NRSF/REST funciona como un represor en ausencia de NRSEdsRNA, (2)
NRSF/REST se convierte en un activador en presencia de NRSEdsRNA y que
(3) la función activadora de REST/NRSF requiere un RE-1/NRSE silvestre y la
expresión de NRSEdsRNA. (Kuwabara et al., 2004).
35

4.2.4 Función de REST/NRSF en neuronas diferenciadas.
Durante la diferenciación neuronal terminal REST/NRSF se desplaza del
RE-1/NRSE, su transcripción es regulada negativamente y la cromatina
circundante al RE-1/NRSE transita hacia un estado activo que se caracteriza
por la hipermetilación de K4 de la histona H3 (Ballas et al., 2005). En neuronas
el nivel de HDAC1 asociada al RE-1/NRSE de mGluR2 y SCG10 está
disminuido con respecto a los progenitores, lo que indica un estado
desreprimido de cromatina o susceptible de ser regulado en un corto plazo.
Junto con esto, se observa asociación de factores que promueven la activación
transcripcional (CBP/p300, SWI/SNF, BRG1 y BAF170) a los promotores de
ambos genes (Kuwabara et al., 2005). En neuronas diferenciadas la
perturbación de la actividad HDAC resulta en un incremento de la expresión de
algunos genes neuronales, lo que sugiere la existencia de plasticidad de la
cromatina dependiente de actividad HDAC en este estado de diferenciación. El
factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) es uno de los genes
representativos de esta clase. La expresión de BDNF puede ser regulada por la
interferencia de la actividad HDAC (Ballas et al., 2005) o por depolarización
mediante la exposición de las células a cloruro de postasio 50mM (Ballas et al.,
2005; Chen et al., 2003; Martinowich et al., 2003) (Figura 12). El tratamiento con
cloruro de potasio se correlaciona con la fosforilación de MeCP2 lo que conduce
a su disociación (Chen et al., 2003) junto con mSin3 y HDAC de los sitios
metilados (Martinowich et al., 2003). Sin embargo, CoREST sigue unido al
promotor de genes del tipo BDNF, por lo que ha sido propuesto que en este
estado de diferenciación CoREST provee una plataforma para el ensamble y
desensamble de complejos moleculares requeridos para la plasticidad neuronal
(Ballas et al., 2005) (Figura 12).
36

Progenitor neural/célula troncal neurona cortical neurona despolarizada
Figura 12. Mecanismo de regulación transcripcional de genes neuronales
involucrados en la plasticidad neuronal. En progenitores neurales y ESCs, el
complejo represor asociado a REST/NRSF se encuentra junto a los complejos
corepresores de CoREST y MeCP2, los que se localizan en una región vecina rica en
dinucleótidos CpG metilados (m en círculos amarillos). En el tránsito hacia neurona
cortical, el complejo asociado a REST/NRSF se desliga del RE-1/NRSE, mientras que
los de CoREST y MeCP2 permanecen unidos a la región mCpG. La despolarización de
estas neuronas conduce a la salida de MeCP2, HDACs y mSin3 del complejo, sin
embargo CoREST queda unido (extraido de Ballas et al., 2005).
4.3 Estudios de la función de REST/NRSF in vivo.
4.3.1 Estudios de promotores de genes neuronales estructurales
usando animales transgénicos.
La función de REST/NRSF in vivo ha sido estudiada en tres modelos de
vertebrados: ratón, pollo y Xenopus. Se han generado ratones transgénicos que
poseen genes reporteros (ej. lacZ) bajo el control de promotores de genes
neuronales que contienen un RE-1/NRSE (Kallunki et al., 1997; Kallunki et al.,
1998; Bessis et al., 1997; Timmusk et al., 1999) y ratones con una deleción
genómica de REST/NRSF (knock-out) (Chen et al., 1998). En ratones
transgénicos donde lacZ se encuentra bajo el control del promotor del gen que
codifica para la subunidad β2 del receptor nicotínico de acetilcolina (β2nAChR)
el transgén se expresa en el sistema nervioso periférico y en parte del SNC
embrionario (Bessis et al., 1997). El transgén con una mutación puntual en el
RE-1/NRSE se expresa ectopicamente en la corteza, pero no en en tejidos no
neurales, y sorprendentemente se observa disminución de su expresión en
áreas de expresión normotópica (Bessis et al., 1997). La expresión del transgén
con el promotor silvestre en animales adultos se detecta unicamente en
subpoblaciones neuronales hipotalámicas, mientras que el transgén con el RE-
37

1/NRSE mutado se expresa en gran parte de las neuronas del SNC.
Finalmente, se muestra que el RE-1/NRSE se puede comportar tanto como un
enhancer como un silenciador en células de neuroblastoma dependiendo de la
distancia a la que se encuentra de la caja TATA (Bessis et al., 1997). En
estudios similares utilizando lacZ bajo el control transcripcional del promotor del
gen que codifica para la proteína de adhesión L1 (L1lacZ) se muestra que el
patrón de expresión de lacZ se restringe al sistema nervioso central (SNC). La
deleción del RE-1/NRSE del transgén (L1lacZDN) resulta en la expresión
precoz de lacZ en algunas áreas del sistema nervioso central y en la expresión
ectópica en el mesodermo y ectodermo no neural (Kallunki y cols., 1997). De
manera semejante a lo observado en embriones, en estadios del desarrollo
postnatal se observa expresión de L1lacZDN aumentada en el cerebro y
ectópica en tejido no neural. Más importante aún y similar a los resultados de
Bessis et al., (1997), se observa disminución de la expresión de L1lacZDN con
respecto a L1lacZ en varias estructuras neurales que incluyen la retina,
cerebelo, corteza, estriado e hipocampo. Sin embargo, a diferencia de lo que
ocurre con β2nAChR, donde la distancia del RE-1/NRSE del promotor
determina si se comporta como un silenciador o un enhancer, en este caso la
distancia no es un factor ya que el RE-1/NRSE se encuentra a 10 Kb rio abajo
del promotor de L1 y aparentemente depende del contexto celular (Kallunki et
al., 1998). Estos datos sugieren que RE-1/NRSE no sólo participaría en el
silenciamiento de L1 en tejido no neural durante el desarrollo temprano, sino
que también puede funcionar como un un enhancer de la expresión de L1 en el
sistema nervioso de animales en estadios postnatales y adultos. Finalmente, el
análisis de la expresión de un gen reportero bajo el control del promotor de
BDNF, que contiene un RE-1/NRSE en el primer intrón, muestra que el
transgén se expresa en el hipocampo, cerebro medio, tálamo, timo y pulmón. La
mutación del RE-1/NRSE correspondiente conduce a un aumento de 10 a 100
veces de la expresión del transgén en estos tejidos, no observándose expresión
ectópica (Timmusk et al., 1999).
38

Los datos obtenidos a través del uso de transgénicos indican que: 1) la
mutación en el RE-1/NRSE de diversos genes neuronales no es suficiente para
activar su expresión en todos los tejidos no neuronales, 2) RE-1/NRSE es
necesario para regular la expresion basal de genes neuronales en el sistema
nervioso central y 3) RE-1/NRSE no sólo funciona como un silenciador de
ciertos genes neuronales (L1 y β2nAChR) en tejido no neural durante el
desarrollo temprano, sino que también puede funcionar como un enhancer de la
expresión de estos genes en el sistema nervioso de animales en estadios
postnatales y adultos.
Los resultados contrapuestos de estos análisis son compatibles con otros
estudios que han sugerido que la contribución relativa de REST/NRSF a la
regulación transcripcional de un gen reportero en particular, depende de otros
elementos reguladores presentes en su promotor además de RE-1/NRSE
(Mieda y cols., 1997; Lonnerberg y cols., 1996) y también del contexto celular,
lo que explicaría una regulación diferencial para diferentes genes en el mismo
tejido. Sin embargo, este tipo de aproximación experimental no permite analizar
los efectos de la pérdida de función de REST/NRSF en el control de la
expresión de múltiples genes endógenos en su contexto cromosómico normal,
ni tampoco analizar su efecto en el desarrollo embrionario. De esta manera, el
diseño de estrategias que permitan obtener pérdida de función de REST/NRSF
in vivo, es fundamental para determinar su papel funcional en el desarrollo
neural.
4.3.2 Estudios de pérdida y ganancia de función de REST/NRSF
durante el desarrollo embrionario.
En ratón REST/NRSF se expresa de manera ubicua en estadio E8.5 y
E9.5. Ratones homocigotos para una mutación nula (knock-out) mueren (100%
penetrancia) en el dia embrionario (E) 11.5, mientras que los ratones
heterocigotos son aparentemente normales. Hasta E9.25 (20 somitos) no se
observan diferencias morfológicas entre los homocigotos y sus hermanos
39

silvestres. Sin embargo, en estadio 9.5 (25 somitos) cerca del 80% de los
embriones mutantes son más pequeños y presentan vesículas telencefálicas
malformadas, en estadio E10.5 todos presentan retardo del crecimiento. El
análisis histológico en embriones de estadio E9.25-9.5 reveló desorganización
celular en el mesénquima de la cabeza, en somitos y en el miotomo, el cual se
encuentra separado del dermomiotomo. Junto con estos defectos, la letalidad
embrionaria es precedida por muerte celular (apoptosis) desde E 9.5-10. El
análisis de la expresión de genes neuronales indica un aumento de la expresión
de βIII-tubulin (tubulina neuronal) en regiones de expresión transiente
normotópica tales como el miotomo, ectodermo de las extremidades y en la
región que rodea las placodas olfatorias. Se observa expresión ectópica en el
ectodermo de la cabeza al nivel del cerebro profundo y en el epicardio. Sin
embargo, otros genes que contienen el RE-1/NRSE en su promotor, tales como
SCG10, synapsin, calbindin y NFM no son desreprimidos, resultado que es
compatible con los descritos usando animales transgénicos. No se observa
expresión prematura en el sistema nervioso central. La muerte de los embriones
knock-out para REST/NRSF no permiten discriminar con certeza si los efectos
observados durante la neurogénesis son en parte producto de los defectos en el
desarrollo temprano (Chen et al., 1998).
Una aproximación alternativa es el estudio de la función de REST/NRSF
en otros modelos. En pollo y Xenopus se ha interferido con la función de
REST/NRSF mediante la expresión de una forma dominante negativa que
consiste sólo del dominio de unión a DNA (REST-DBD) (Chen et al., 1998;
Armisen et al., 2002). La expresión de REST-DBD en somitos de pollo conduce
a diferentes patrones de desrepresión de βIII-tubulin, NgCAM y SCG10 (Chen
et al., 1998). La expresión de REST-DBD en el tubo neural causa la expresión
prematura de genes neuronales estructurales blancos de RESTNRSF tales
como SCG10 y NgCAM. Complementariamente, la expresión constitutiva de la
isoforma murina en neuronas de embriones de pollo se asocia a la represión de
tubulina neuronal y NgCAM y a defectos en la navegación axonal, sin embargo,
40

no se observa represión de SCG10 y NFM que también poseen un RE-1 en su
región reguladora (Paquette et al., 2000).
Recientemente establecimos que XREST/NRSF se expresa
tempranamente durante la neurogénesis en la región dorsal del embrión de
Xenopus laevis, para posteriormente restringirse al sistema nervioso central del
renacuajo. Mediante RT-PCR de neuronas espinales primarias aisladas,
demostramos la coexpresión de XREST/NRSF y N-tubulin. La sobreexpresión
de la isoforma humana causa la muerte de la totalidad de los individuos durante
la gastrulación, fenotipo que es rescatado por la coexpresión de XREST-DBD.
En tanto, la expresión de XREST-DBD resulta en el aparente silenciamiento de
la expresión de los genes neuronales estructurales Nav1.2, N-tubulin y SCG10
(Armisen et al., 2002). Estos resultados contrastan notablemente con la función
descrita para REST/NRSF y sugieren que esta proteína funcionaría como un
activador, o al menos como un factor permisivo de la expresión de este tipo de
genes. Ya que la inyección del mensajero de XREST-DBD en estadío de dos
células conduce a la expresión de la proteína desde etapas tempranas del
desarrollo, los fenotipos observados podrían ser el producto de perturbaciones
en procesos previos a la diferenciación neuronal. En Xenopus, una de las
estrategias experimentales empleadas para el estudio de la función de
proteínas nucleares en etapas específicas del desarrollo embrionario, es la
generación de quimeras compuestas por la proteína en cuestión, o de dominios
de ésta, fusionada al dominio regulatorio del receptor de glucocorticoides (GR).
Se ha descrito que estas fusiones una vez traducidas permanecen unidas a la
hsp90 en ausencia de glucocorticoides y que el tratamiento con dexametasona
de embriones inyectados con el mRNA que codifica para ellas, libera las
fusiones proteicas de la hsp90 destinándolas al núcleo (Kolm et al., 1995). De
esta manera, la expresión de una forma dominante negativa inducible que
consta del dominio de unión a DNA de XREST/NRSF fusionado al GR
(dnXREST), inducida en la blástula tardía resulta en una aparente expansión de
la placa neural, en la expresión ectópica del canal de sodio Nav1.2 tanto en
41

tejido neural, como también en la placa neural expandida y en el silenciamiento
de la expresión de N-tubulin (Olguín y Kukuljan, datos preliminares). Los
antecedentes recopilados en ratón, pollo y Xenopus son compatibles con la idea
de que REST/NRSF contribuye al proceso de diferenciación neuronal regulando
la expresión de genes neuronales estructurales en los precursores neurales, y
que además juega un papel importante durante el desarrollo embrionario
temprano, el que puede incluir su participación en el establecimiento de la placa
neural.
42

Hipótesis
XREST/NRSF contribuye al establecimiento del territorio neural y regula
la expresión de los genes neuronales estructurales durante la neurogénesis de
Xenopus laevis.
Objetivo General
Determinar la participación de XREST/NRSF en el establecimiento del
territorio neural y en la regulación de la expresión de genes neuronales
estructurales durante la neurogénesis de Xenopus laevis.
Para probar esta hipótesis se propone los siguientes objetivos específicos:
Objetivos específicos.
1.- Determinar la participación de XREST/NRSF en la neurogénesis de X.
laevis.
1.1 Analizar el patrón de expresión de XREST/NRSF. Se analizará el patrón
de expresión del mRNA de XREST/NRSF mediante hibridación in situ durante
el desarrollo embrionario.
1.2 Determinar la participación de XREST/NRSF en la neurogénesis. Este
objetivo pretende definir en que etapas específicas y en que procesos del
desarrollo neural XREST/NRSF participa activamente.
2.- Analizar el papel de XREST/NRSF en las vías involucradas en el
establecimiento de la placa neural. Si bien el objetivo 1 identificará los procesos
en que participa XREST/NRSF, y por consiguiente permitirá inferir las vías
conocidas que se pueden relacionar con la función de XREST/NRSF, los
antecedentes ya disponibles permiten plantear que XREST/NRSF podría
43

participar en la neurogénesis a través de su relación con las vias promotoras de
epidermis y neuralizantes.
3.- Determinar la participación de XREST/NRSF en la regulación de la
expresión de genes neuronales estructurales durante la diferenciación neuronal.
En Xenopus la interferencia de la función de XREST/NRSF, conduce a la
inhibición de la expresión de genes neuronales estructurales. Este objetivo
pretende reevaluar este fenómeno y analizar el mecanismo asociado.
3.1 Probar el papel de XREST/NRSF en la regulación de la expresión de
genes neuronales estructurales in vivo. A partir de los resultados obtenidos en
1.2 se analizará detalladamente los fenotipos asociados a la ganancia o
interferencia de la función de XREST/NRSF en la diferenciación neuronal.
3.2 Probar que la adquisición de las características funcionales neuronales
es regulada por XREST/NRSF. La adquisición de las características funcionales
neuronales tales como la morfología y la excitabilidad, está en directa relación
con la expresión de los genes neuronales estructurales durante la diferenciación
neuronal. Este objetivo pretende determinar específicamente si XREST/NRSF
regula la expresión de la corriente de sodio dependiente de potencial eléctrico
durante la diferenciación de las neuronas espinales.
4.- Probar que la participación de XREST/NRSF en la neurogénesis es
dependiente de la interacción con XCoREST. Gran parte de los mecanismos de
represión y silenciamiento mediados por REST/NRSF involucran la participación
de CoREST. En Xenopus, el patrón de expresión de XREST/NRSF es muy
similar al de XCoREST durante la diferenciación neural. Este objetivo pretende
analizar si XCoREST participa junto a XREST/NRSF en la neurogénesis a
través de experimentos de pérdida de función y de interacción genetica.
44

MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
Animales
- Se mantuvo un vivero con Xenopus laevis silvestres adultos, hembras y
machos, alimentados con corazón de vacuno tres veces por semana y con un
ciclo luz-oscuridad de 12 horas.
Reactivos para la obtención y mantención de embriones y explantes
animales:
-Cisteína (Merck, Darmstadt, Alemania).
-Ficoll (Polisacarosa 400, Calbiochem, La Jolla, CA, EE.UU.).
-Hormona Gonadotrofina Coriónica Humana (hHGC) (Chorulon, Intervet,
Boxmeer, Holanda).
-MBS 10x (Modified Barth´s Saline): NaCl 880 mM, KCl 10mM, MgSO4 10 mM,
HEPES 50 mM pH 7,8, 25mM NaHCO3, pH 7,8 ajustado con NaOH 5M.
-MBS 1x/Ca: MBS1x, CaCl2 0,7 mM.
-MBS 0,1x: MBS 1x/Ca 0,1x
-MBS 0,5x: MBS 1x/Ca 0,5x
-MBS High-Salt: MBS1x/Ca, NaCl 108 mM.
Cultivo Celular:
-Medio de disección: MBS 0.5x
-Medio de disociación: NaCl 116 mM, KCl 0,67 mM, EDTA 0,4 mM y Tris 4,6
mM, pH 7,8 ajustado con HCl.
-Medio de cultivo: NaCl 116 mM, KCl 0,67 mM, MgSO4 1,31 mM, CaCl2 10 mM
y Tris 4,6 mM, pH 7,8 ajustado con HCl.
-Placas de cultivo Petri de plástico 35 mm de diametro (Falcon Primaria, Falcon,
EE.UU.).
45

-Pinzas nº 5 (A. DUMONT y FILS, Suiza).
Registros electrofisiológicos:
-Capilares de vidrio para determinación de microhematocrito (BLU-TIP,
OXFORD, St. Louis, EE.UU.).
-Medio de registro extracelular para el registro de la corriente de sodio
dependiente de potencial eléctrico (INa): 40 mM NaCl, 10 mM CoCl2, 3mM KCl,
80mM TEACl, 5mM HEPES, pH 7,4 ajustado con NaOH.
-Solución del electrodo para el registro de la corriente de sodio dependiente de
potencial eléctrico (INa): 100 mM CsCl, 10 mM TEACl, 10 mM EGTA, 10 mM
HEPES, pH 7,4 ajustado con CsOH.
Biología Molecular
Síntesis de ribosondas y mRNA:
-Acetato de sodio (Merck, Darmstadt, Alemania).
-Agarosa (Sigma, St. Louis, EE.UU.).
-Cloroformo (Merck, Darmstadt, Alemania).
-DEPC, Dietilpirocarbonato (Sigma, St. Louis, EE.UU.).
-DTT (Promega, Madison, EE.UU.).
-Etanol (Merck, Darmstadt, Alemania).
-Fenol (Merck, Darmstadt, Alemania).
-ATP, adenosina trifosfato (Roche, Alemania).
-CTP, citosina trifosfato (Roche, Alemania).
-GTP, guanosina trifosfato (Roche, Alemania).
-UTP, uridina trifosfato (Roche, Alemania).
-DIG-11-UTP, uridina trifosfato conjugado a digoxigenina (Roche, Alemania).
-RNAsin, inhibidor de RNAsas (Roche, Alemania).
-Amortiguador TE (TrisHCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4).
46

-Amortiguador de Transcripción (TrisHCl pH 7,6 200 mM, MgCl2 30 mM,
espermidina 20mM) (Roche, Alemania).
Hibridación in situ:
-Agua DEPC (DEPC 0,1% v/v en agua).
-Ácido maleico (Merck, Darmstadt, Alemania).
-Amortiguador de hibridación (formamida 50%, SSC 5X, RNA de levadura 1
mg/mL, heparina 100 mg/mL, Denhardt 1X, Tween 20 0, 1%, 10 mM EDTA,
CHAPS 0, 1%).
-Anhídrido acético (Sigma, St. Louis, EE.UU.).
-Anticuerpo anti-digoxigenina conjugado a fosfatasa alcalina (Roche, Alemania).
-BCIP, 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato, 4-sal de toluidina (50 mg/mL en
dimetilformamida) (Roche, Alemania).
-BMBR, Boehringer Mannheim Blocking Reagent (Roche, Alemania).
-Citrato de sodio (Merck, Darmstadt, Alemania).
-CHAPS, (3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propanosulfonato) (Sigma, St.
Louis, EE.UU.).
-Cloruro de magnesio (Merck, Darmstadt, Alemania).
-Cloruro de sodio (Merck, Darmstadt, Alemania).
-Denhardt 50X (Ficoll 0, 1%, polivinilpirrolidona 0, 1% y BSA 0, 1%).
-Deoxicolato de sodio (Sigma, St. Louis, EE.UU.).
-EDTA, ácido etilendiaminotetraacético (Merck, Darmstadt, Alemania).
-Formamida (Merck, Darmstadt, Alemania).
-Heparina (Sigma, St. Louis, EE.UU.).
-H2O2 30% (Sigma, St. Louis, EE.UU.).
-K3Fe(CN)6 (Merck, Darmstadt, Alemania)
-K4Fe(CN)6*3H2O (Merck, Darmstadt, Alemania)
-MAB, Tampón de ácido maleico (ácido maleico 100 mM, NaCl 150 mM, pH
7,5).
-MAB/BMBR (BMBR 2% (p/v) en MAB).
47

-MEMPFA (MOPS 0,1 M pH 7,0 EGTA 2 mM, MgSO4 1 mM, paraformaldehido
4%).
-Metanol (Merck, Darmstadt, Alemania).
-MgCl2 (Merck, Darmstadt, Alemania).
-MOPS, ácido 3-[N-morfolino] propanosulfónico (Sigma, St. Louis, EE.UU.).
-NBT, Cloruro de 4-nitro blue tetrazolium (100 mg/mL en dimetilformamida)
(Boehringer Mannheim, Alemania).
-Paraformaldehido (Sigma, St. Louis, EE.UU.).
-PBS 1X (Na2HPO4 10 mM, NaH2PO4 1,7 mM, NaCl 200 mM, pH 7,4).
-PTw (Tween 20 0,1% (v/v) en PBS 1X).
-RNA de levadura (Sigma, St. Louis, EE.UU.).
-Trietanolamina (Sigma, St. Louis, EE.UU.).
-TRIS (Merck, Darmstadt, Alemania).
-Tween 20 (Sigma, St. Louis, EE.UU.).
-Solución AP (TRIS 100 mM, MgCl2 50 mM, NaCl 100 mM, Tween 20 0,1%
(v/v), pH 9,5).
-Solución de blanqueo: H2O2 1,5%, PBS 1X, 30 mL sol. de hibridación por 10
mL solución).
-Solución de lavado de sonda 1 (formamida 50%, SSC 2X, Tween 20 0,1% v/v).
-Solución de lavado de sonda 2 (formamida 25%, SSC 2X, Tween 20 0,1% v/v).
-Solución de lavado de sonda 3 (formamida 12,5%, SSC 2X, Tween 20 0,1%
v/v).
-Solución de lavado de sonda 4 (SSC 2X, Tween 20 0,1% v/v).
-Solución de lavado de sonda 5 (SSC 0,2X, Tween 20 0,1% v/v).
-SSC 20X (NaCl 3 M, citrato de sodio 0,3 M pH 7,4).
-Solución revelado β-gal (K3Fe(CN)6 20 mM, K4Fe(CN)6*3H2O 20 mM, X-gal
0.1% en PBS 1x libre de ribonucleasas)
48

Sistemas Comerciales:
-pGEM-T Vector System, (Promega, Madison, EE.UU.), utilizado para el
clonamiento de productos de PCR.
-TOPO-TA Cloning Kit for Sequencing, (Invitrogen, EE.UU.), utilizado para
clonar productos de PCR.
-mMessage mMachine Kit (Ambion, Austin, EE.UU.), utilizado para la
transcripción in vitro.
-mini Quick RNA Spin Columns, (Roche, Alemania), utilizado para purificar las
ribosondas.
-QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Stanford, EE.UU.), utilizado para purificar
plasmidios desde bacterias.
-QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Stanford, EE.UU.), utilizado para
purificar, productos de PCR y de digestión desde geles de agarosa.
-RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Stanford, EE.UU.), utilizado para purificar RNA
desde embriones.
Enzimas:
RNA polimerasas de Sp6, T3, T7, DNasa I (Ambion, Austin, EE.UU.); BamHI,
EcoRI, EcoRV, XbaI, XhoI, HindIII, DNA polimerasaTaq (Boehringer Mannheim,
Alemania);. T4 DNA ligasa, ScaI, ScaII, NcoI, NotI, ClaI (New England Biolabs,
EE.UU.). DNA Polimerasa Taq, DNA Polimerasa Platinum, Superscript II,
RNAseOUT (GIBCO BRL, California, EE.UU.). DNasa I (Ambion, Austin,
EE.UU.)
Otros reactivos usados en biología molecular:
-Agarosa ultrapura (GIBCO BRL, California, EE.UU.).
-Amortiguador de electroforesis TAE 1X (Tris-acetato/EDTA): tris-acetato
40mM, EDTA 1mM.
-Amortiguador de PCR 10x con magnesio (Roche, Alemania).
-Amortiguador de PCR 10x sin magnesio (Invitrogen, EE.UU.).
49

-Bromuro de Etidio (GIBCO BRL, California, EE.UU.).
-dNTPs, deoxinucleotidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (Boehringer
Mannheim, Alemania).
-DTT 0,1 M (Invitrogen, EE.UU.).
-1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, EE.UU.).
-MgCl2 50mM (Invitrogen, EE.UU.).
Cepas Bacterianas:
-E. Coli INVαF’ (Invitrogen, San Diego, California, EE.UU.)
-E. Coli DH5α (GIBCO BRL, California, EE.UU.)
Medios de cultivo Bacteriano:
-Medio Luria Bertani (LB): Triptona 1,0%, extracto de Levadura 0,5%, NaCl
1,0%, pH 7,0 ajustado con NaOH 5M. Autoclavado y almacenado a 4ºC. Adición
opcional de ampicilina 50 μg/ml (Boehringer Mannheim, Alemania).
-Medio LB solido (para cultivo de bacterias en placa): Medio LB más 15 g/L de
agar antes de autoclave.
-Medio LB solido/X-Gal/IPTG (para cultivo y selección de bacterias en placa):
LB sólido más 40 μl, en la superficie de la placa, de una solución de X-Gal 40
mg/ml en dimetilformamida y 100μl de una solución 100 mM de IPTG.
-Medio SOC: bactotriptona 20 g/l, extracto de levadura 5 g/l, glucosa 20mM,
NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgSO4.7H2O 10 mM y MgCl2.6H2O 10 mM.
50

Animales
Métodos
Obtención de embriones de Xenopus laevis mediante fertilización in vitro.
La ovulación se indujo por la inyección de 800 UI de gonadotrofina coriónica
humana en el saco dorsal linfático de la rana hembra. Luego de 15 horas, se
recolectaron oocitos, los que fueron inmediatamente fecundados con un
macerado de testículo. La remoción de este órgano se realizó luego del
sacrificio del animal mediante sección medular, previa anestesia por inmersión
en agua a 4ºC durante 30 minutos. Cinco minutos después de la fecundación,
los embriones se cubrieron MBS 0.1x por al menos 30 minutos. A continuación,
se removió la gelatina con una solución de cisteína al 2% pH 8, ajustada con
NaOH, y se lavaron 10 veces con MBS 0,1x para posteriormente mantenerlos
en este mismo medio a 14º C. Aroximadamente 2 horas después, los
embriones en estadío de dos células fueron traspasados a un medio de Ficoll
4% en MBS 0.1x para ser inyectados. Para la identificación de los estadíos del
desarrollo embrionario se utilizó la clasificación de Nieuwkoop y Faber (1967) (N
y F).
Microinyección de embriones e inducción con dexametasona. Se realizó la
sobreexpresión de los genes indicados en la Tabla 1 o de los antrisentidos
modificados (morfolinos, Tabla 2) mediante inyección del mRNA transcrito in
vitro en embriones de Xenopus laevis junto con el mRNA de β-galactosidasa o
de la proteína fluorescente verde (GFP), los que se utilizaron como marcadores
de linaje. Para el análisis de expresión génica en embriones completos y del
electrofisiológico en cultivos de placa neural, se inyectó el polo animal de uno
de los blastómeros en estadio de 2 y/ó 4 células (de acuerdo al experimento, se
eligió los blastómeros ventrales o dorsales). En el caso del analisis de expresión
génica en caps animales, ya sea mediante ISH o RT-PCR, se inyecto el polo
animal de los 4 blastomeros en embriones de estadio de cuatro células. La
51

concentración de mRNA a inyectar se determinó para cada experimento (ver
resultados). Como control, se usó embriones no inyectados o inyectados sólo
con el trazador de linaje β-galactosidasa en iguales concentraciones (Lombardo
y Slack, 1997). La activación de dnXREST se llevó a cabo mediante adición de
Dexametasona disuelta en etanol 95%, al medio de cultivo en una
concentración final de 10mg/ml (Kolm y Sive, 1995) en estadio 6, 9 y 12 según
N y F (Figura 13). Se probó la expresión de la quimera mediante western blot
usando extractos totales de embriones en estadio de néurula y un anticuerpo
monoclonal que reconoce los epitopos myc de la proteína de fusión (Figura 13).
52

Figura 13. Estrategia de pérdida de función para el análisis del papel de
XREST/NRSF durante la neurogénesis de Xenopus laevis. En un blastómero de
embriones en estadío de dos células se inyecta el mRNA correspondiente al dominio
de unión al DNA de XREST/NRSF (dn XREST) fusionado al dominio regulatorio del
receptor de glucocorticoides (GR) y a epítopes Myc. Al mismo tiempo se coinyecta el
mRNA de β-galactosidasa como marcador de linaje celular (arriba). El dominio GR
permite inducir la translocación nuclear de la construcción haciendo funcional al
dominante negativo de XREST/NRSF en diferentes etapas del desarrollo mediante la
adición de Dexametasona al medio de cultivo. Los epítopes Myc permiten a su vez
controlar la expresión de la proteína exógena (arriba a la derecha). El modelo
propuesto sugiere que la pérdida de función de XREST/NRSF mediante la expresión
de su dominante negativo activaría la expresión de sus genes blanco.
53

Recolección de embriones. Para el procedimiento de hibridación in situ se
recolectaron embriones de estadios de néurula temprana (13.5-14.5, N y F),
media (15-16, N y F), tardía (18-19, N y F) y organogénesis (24-27, N y F), los
cuales fueron devitelinizados manualmente. A continuación se incubaron en
MEMFA durante 1 hora a temperatura ambiente en tubos de microcentrífuga
dispuestos horizontalmente sobre la plataforma de un rotador de 3 dimensiones.
Los embriones ya semifijados, se lavaron dos veces por 10 minutos en PBS1x
libre de ribonucleasas y se realizó la detección de la actividad β-galactosidasa,
mediante incubación en la solución de revelado de β-gal de 30 minutos a dos
horas. Finalmente, se incubaron nuevamente en MEMFA por 30 minutos, se
deshidrataron en etanol absoluto dos veces por 30 minutos y se almacenaron a
-20º Celsius (C) hasta la hibridación in situ. Para la realización de cultivos
celulares primarios se recolectaron embriones en estadio 15.
Explantes animales. Los explantes fueron realizados utilizando cuchillas de
cejas y pinzas en MBS 1x. Se removió explantes de ectodermo animal en
estadío 9 (blástula tardía), los que fueron cultivados en MBS 0.5x hasta el
equivalente de estadio 11 para los experimentos de RT-PCR, y néurula para los
estudios de hibridación in situ según se indica en la sección de los resultados.
Cultivo celular. Los cultivos se prepararon a partir de la mitad posterior de la
placa neural de embriones únicos en estadio de néurula temprana. La
separación de la placa neural de la notocorda y del mesodermo paraxial, se
realizó mediante disección manual utilizando pinzas en el medio de disección
(ver Materiales). La placa neural se disoció mediante aspiracion y expulsión del
tejido en el medio de disociación utilizando una pipeta Pasteur de vidrio estirada
hasta un diámetro de 100 μm. Luego las células disociadas se plaquearon en
placas de cultivo de 35mm de diámetro y cultivaron en el medio de cultivo (ver
Materiales). Finalmente se realizaron los registros electrofisiológicos sobre
células cultivadas entre 14-16 hrs. (Fig. 2). Los cultivos poseen una población
54

heterogénea de células: gliales, neuronas secundarias indiferenciadas y
neuronas primarias. Entre de éstas últimas se distinguen tres subtipos:
neuronas sensitivas, motoras e interneuronas (Hartenstein, 1993).
Registros electrofisiológicos. El registro de la corriente de sodio dependiente
de potencial eléctrico (INa) en las neuronas espinales en cultivo se realizó
utilizando la técnica de patch clamp en su configuración de célula completa
descrita por Hamill y cols. (1981). Se diseñaron pipetas de registro con una
resistencia entre 2-3 MΩ en la solución de registro extracelular. Los datos se
adquirieron con un amplificador de patch clamp (Axopatch 200-A, Axon
Instruments), conectado a un computador personal donde se almacenaron y
analizaron con el programa Clampex contenido en pClamp 8.0 (Axon
Instruments). Se utilizó un protocolo de 7 pulsos cuadrados de voltaje de 40 ms
de duración desde un potencial de mantención de –90 mV hasta 40 mV. La
densidad de corriente de cada célula se determinó a través de la medición del
pico de la corriente registrada a –10 mV sobre el área de la superficie celular I/A
(pA/μm2). Para el análisis de significancia se utilizó el test t de Student’s de dos
colas. El área de la célula se determinó a traves de la medición de la
capacitancia celular de cada célula en el amplificador (la capacitancia de una
célula puede ser convertida en área considerando que la capacidad específica
de una membrana biológica es 1μF/cm2).
55

Técnicas de Biología Molecular.
Aislamiento del cDNA de XREST/NRSF y zREST/NRSF y generación de
construcciones para la sobreexpresión. Para aislar el cDNA de
XREST/NRSF se purificó RNA total de embriones de estadio de gástrula
temprana utilizando Trizol (Invitrogen), el cDNA fue sintetizado utilizando
Superscript II (Invitrogen) y un partidor específico diseñado en base a la región
3’ no traducida del clon EST XL066i17 (http://xenopus.nibb.ac.jp). La región
codificante de XREST/NRSF se amplificó por PCR utlizando el sistema
comercial Expand Long Template PCR System (Roche). El partidor directo
CGCTCGAGATGGCCACTCAAATGGTCAAC fue diseñado en base a la
secuencia parcial de un clon de XREST/NRSF (Gene Bank accession
AF096301) y el reverso GCTCTAGATTATCTATGTCTT-
TTGCTGCTTTTTTAAG fue diseñado en base al clon EST XL066i17. El
producto de PCR obtenido fue clonado en pGEMT-easy (Promega), escindido
con XhoI y XbaI (indicado en negrita en la secuencia de los partidores), clonado
en pCS2+NLS/MT (Turner y Weintraub, 1994) y secuenciado. El dominio de
unión a DNA de XREST/NRSF fue amplificado con los partidores
GCGAATTCTAATACACTTGAGGTGGAGG y
CGCTCGAGTTTTACTTTGGAAACATCCATTGTG, el producto de PCR fue
digerido con EcoRI y XhoI y ligado junto con el fragmento codificante para el
dominio de unión a hormona del receptor de glucocorticoides humano digerido
con XhoI y XbaI, el cual fue obtenido del fragmento clonado en pBluescript KS
(Gómez-Skármeta et al., 2001), al vector pCS2+MT digerido con EcoRI y XbaI.
Para aislar el cDNA de zREST/NRSF se purificó RNA total de embriones de 24
horas postfertilización usando Trizol (Invitrogen). El cDNA se sintetizó usando
Superscript II (Invitrogen) y un partidor reverso específico diseñado en base a la
unidad transcripcional de zREST/NRSF predicha en el genoma de Danio rerio
por el análisis de Genescan disponible en www.ensembl.org. Esta secuencia se
obtuvo por una búsqueda por similitud de secuencias codificantes para
56

REST/NRSF en el genoma anotado de Danio rerio usando como sujeto de
comparación las secuencias aminoacídicas conservadas de REST/NRSF de
ratón, humano y Xenopus, usando el programa TBLASTX. Con esta información
se amplificó el cDNA de zREST/NRSF usando el sistema comercial Expand
Long Template PCR System (Roche) y los partidores directo
CGCTCGAGCCGGTGTTTCCCACTGCC y reverso
GCTTCTAGAGCTGCCGCCCCTTCTAG diseñados en base a la secuencia
codificante de inicio y término. El producto de PCR se clonó en pCR4-TOPO
(Invitrogen), se escindió con XhoI y XbaI (indicados en negrita en la secuencia
de los partidores), se ligó al pCS2+NLS/MT (Turner y Weintraub, 1994) digerido
con estas mismas enzimas y finalmente fue secuenciado.
Analisis de PCR semicuantitativo (SQ-PCR) en explantes animales. Se
purificó RNA total de 15 explantes animales de estadio 10.5 usando Trizol
(Invitrogen) para cada condición experimental tal como se indica en la sección
de resultados. El cDNA fue sintetizado usando Superscript II (Invitrogen) y
partidor oligo(dT). El SQ-PCR se realizó tal como se indica en Gawantka et al.,
(1998). Los partidores utilizados fueron: Msx-1F (GCTAAAAATGGCTGCTAA),
Msx-1R (AGGTGGGCTGTGTAAAGT), Vent2F (CATCATCATCCCCTGGAG),
Vent2R (TAGAGTTGGATCGACTCGT), ODCF
(GTCAATGATGGGTGTATGGATC) y ODCR
(TCCATTCCGCTCTCCTGAGCAC).
Inmunodetección de histona H3 fosforilada. Se recolectaron embriones en el
estadio de néurula temprana, se fijaron en MEMFA, se deshidrataron en
metanol absoluto con dos lavados de 30 minutos y se almacenaron a –20 o C.
Antes de proceder al protocolo de inmunohistoquímica, los embriones se
blanquearon con solución de blanqueo (materiales) y se lavaron cuatro veces
por 10 minutos en PBS1x. Se bloqueó con MAB/BMBR por 30 minutos. Luego
se retiró el bloqueador y se agregó una dilución 1/1000 del anticuerpo anti-
57

histona H3 fosforilada (Upstate) en MAB/BMBR, en la que los embriones fueron
incubados 14-18 horas a 4°C. Luego se lavaron los embriones con MAB 4
veces por 30 minutos y se agregó el anticuerpo secundario anti-IgG de conejo
conjugado a peroxidasa de rában (Jackson) en una dilución 1/5000 en
MAB/BMBR el cual se incubó por 6 horas. Completado el tiempo de incubación
del anticuerpo secundario se procedió a lavar con PBS 1x 4 veces por 30
minutos y se incubaron los embriones en DAB por 15 minutos a 4 o C, seguido,
se adicionó 1 μl de peróxido de hidrógeno (3%). Se siguió la reacción bajo lupa
hasta obtener la tinción deseada. La reacción fue detenida lavando 2 veces por
5 minutos con PBS 1x y posterior fijación con solución de formaldehído en PBS
1x.
Transcripción in vitro de mRNA. Se transcribió mRNA a partir de los cDNA
linearizados de los clones donados y de los producidos en el transcurso de esta
tesis. Dependiendo de la orientación del inserto se usó la enzima de restricción
y polimerasa adecuadas (Tabla 1).
La transcripción de los mRNA para la inyección en embriones se realizó
utilizando al sistema comercial mMessage mMachine Kit (Ambion), según se las
instrucciones del fabricante. Se mezcló 1 μg de plásmido linearizado, 2 μL de
amortiguador de transcripción 10x, 10 μL de mezcla de nucleótidos (2x
NTP/CAP), agua DEPC hasta completar 20 μL y 2 μL de la RNA polimerasa
respectiva. Esta mezcla se incubó a 37°C durante 2 horas. Luego, se agregó 1
μL de DNAsa I y se continuó la incubación a 37°C durante otros 15 minutos. La
reacción se detuvo agregando 115 μl de agua DEPC y 15 μl de una solución de
acetato de amonio 5 M y EDTA 100 mM. El mRNA sintetizado se extrajo con un
volumen de una mezcla fenol, cloroformo, alcohol isoamílico 25:24:1 y se
agregó 2,5 volúmenes de etanol absoluto. El mRNA se centrifugó durante 20
minutos a 12000g para luego eliminar el sobrenadante, lavar con etanol 70% y
volver a centrifugar a 12000g durante 5 minutos, luego de los cuales se eliminó
58

el líquido y secó el mRNA para finalmente resuspenderlo en 20 μL de agua
DEPC. La concentración y pureza del mRNA se determinó por lectura
espectrofotométrica a 260 y 280 nm.
Gen Enzima de
restricción
RNA
polimerasa
referencia
β-gal XhoI Sp6 Cedido
Turner
por Dr. David
Bmp-4 XbaI Sp6 Schmidt et al., 1995
GFP Not Sp6 Cedido
Ribera.
por Dra. Angie
XCoREST NcoI Sp6 de la Calle Mustienes et al.,
2002
dnXREST NotI Sp6 Esta tesis
XREST/NRSF NotI Sp6 Esta tesis
zREST/NRSF NotI Sp6 Esta tesis
Tabla 1. mRNAs sintetizados in vitro para la inyección en embriones de Xenopus
laevis. Se indica el gen o construcción templado, la enzima de restricción utilizada y la
RNA polimerasa correspondiente.
Morfolino Gen blanco Secuencia
MoXREST XREST/NRSF ACTGGTTGACCATTTGAGTGGC
MoCoREST XCoREST CTGCTCCCTTCTCGATCATGGCTGG
MoControl Control TTTCAGACGGACCACTGTCAGTGCG
Tabla 2. Morfolinos para la inyección en embriones de Xenopus laevis. Los
antisentidos fueron diseñados contra la secuencia que incluye el codon de inicio, se
indica el gen blanco y la secuencia nucleotídica.
59

Síntesis de ribosondas para hibridación in situ. Se usaron sondas de RNA
antisentido modificadas por la incorporación de DIG-UTP (Harland, 1991), las
cuales se generaron a partir de los plasmidios que contienen los cDNAs
codificantes para los genes en estudio (Tabla 1). Cada plasmidio se linearizó
con una enzima de corte único río arriba de la secuencia de interés. De manera
de sintetizar la hebra antisentido complementaria al mensajero endógeno que
se pretende detectar, se utilizó el promotor ubicado río abajo de la secuencia de
interés en el vector. La reacción de transcripción in vitro se realizó adicionando
1 μg del plasmidio linearizado en una solución que contiene: 2 μL de
amortiguador de transcripción 10x, 2 μL de mezcla de nucleótidos (ATP 10 mM,
CTP 10 mM, GTP 10 mM, UTP 6,5 mM, DIG-UTP 3,5 mM), 1 μL (20 U) de
inhibidor de RNasas, agua DEPC para completar 20 μL y 1 μL de la RNA
polimerasa correspondiente. La reacción se incubó durante al menos dos horas
a 37°C; luego se agregó 20 U de DNAsa I y se continuó la incubación durante
15 minutos adicionales. Pasado este período, se verificó la eliminación del DNA
analizando una alícuota de la reacción en un gel de agarosa al 1% teñido con
bromuro de etidio. Finalmente, se agregaron 20 μL de agua DEPC adicionales y
se filtró en una columna Sephadex G20 (mini Quick RNA Spin Columns, Roche)
equilibrada en TE pH 7,5 con el fin de eliminar los nucleótidos no incorporados
al RNA sintetizado. Los transcritos se analizaron en geles de agarosa 1%,
formaldehído 2,2% en amortiguador MOPS, teñidos con bromuro de etidio. La
concentración y pureza de los ácidos nucléicos se determinó por lectura
espectrofotométrica a 260 y 280 nm.
60

Gen Enzima de RNA Territorio de referencia
restricción polimerasa expresión
Chordin EcoRI T7 mesodermo Sasai et al.,
dorsal
1994
X-Delta-1 XhoI T7 neuronas Chitnis et al.,
primarias 1995
Hes-1 EcoRI T7 dominios Clon EST
neurogénicos XL036f10
Keratin EcoRI Sp6 ectodermo no Jonas et al.,
neural
1985.
msx-1 EcoRI T3 borde y crestas Suzuki et al.,
neurales 1997.
MyoD BamHI Sp6 mesodermo Hopwood y
paraxial Gurdon,
1990.
NaV1.2 XhoI Sp6 neuronas Armisen et
primarias al., 2002.
X-ngnr-1 BamHI T3 neuronas Ma et al.,
primarias 1995.
Notch-1 ClaI Sp6 placa neural Chitnis et al.,
1995
XREST/NRSF EcoRI T3 ver resultados esta tesis
SCG10 BamHI T7 neuronas Armisen et
primarias al., 2002.
SoxD ClaI T7 placa neural Mizuseki
al., 1998a
et
Sox2 XbaI T7 placa neural Mizuseki
al., 1998b
et
Slug BglII Sp6 crestas Mayor et al.,
neurales 1995.
N-tubulin SacI T3 Neuronas Chitnis et al.,
primarias 1995.
Zic2 SacII Sp6 dominios inter- Brewster et
neurogénicos al., 1998
Tabla 3. Genes utilizados para la síntesis de ribosondas para ISH. Se indica la
enzima de restricción utilizada para linearizar el plasmidio que contiene el inserto; la
RNA polimerasa utilizada en la transcripción in vitro, el territorio asociado a la detección
del mensajero mediante hibridación in situ y la referencia bibliográfica.
61

Hibridación in situ (ISH). Los embriones, almacenados en etanol, se
rehidrataron con tres lavados, de cinco minutos cada uno, en metanol 75%,
50% y 25% v/v, para posteriormente lavarlos 3 veces durante 5 minutos en PTw
(todos los lavados e incubaciones se realizaron a temperatura ambiente en
tubos de microcentrífuga dispuestos horizontalmente sobre la plataforma de un
rotador de 3 dimensiones, a menos que se indique otra condición). Luego se
hicieron dos lavados, de cinco minutos cada uno, con TEA 0,1 M pH 7,5. Al
último lavado de TEA se le agregaron 1,5 mL de anhídrido acético por cada 0,5
mL de TEA y se lavó durante otros cinco minutos, al final de los cuales se
agregaron 1,5 mL adicionales de anhídrido acético y se lavó durante cinco
minutos más. A continuación, los embriones se sometieron a tres lavados de
cinco minutos cada uno con PTw. Posteriormente, se retiró el PTw y se agregó
amortiguador de hibridación suficiente para cubrir los embriones, el cual se
cambió por amortiguador fresco luego que los embriones sedimentaron en el
tubo. La prehibridación consistió en la incubación a 60°C durante seis horas en
este amortiguador, con los tubos dispuestos en posición vertical sobre el rotador
de 3 dimensiones. Luego, el amortiguador de hibridación se reemplazó con la
ribosonda correspondiente marcada con DIG-UTP, en una concentración de 1
mg/mL en el amortiguador de hibridación. La hibridación con las ribosondas se
realizó durante 16 horas en las mismas condiciones descritas para la
prehibridación. A continuación, los embriones se sometieron a lavados
sucesivos de 10 minutos cada uno con las soluciones de lavado 1, 2, 3 y 4 (ver
Materiales: soluciones) y de 30 minutos en la solución de lavado 5 (ver
Materiales: soluciones). Todos los lavados se realizaron a 60º C y con los tubos
en posición vertical sobre el rotador de 3 dimensiones. Después de esta
operación, los lavados e incubaciones se efectuaron a temperatura ambiente:
tres lavados de 5 minutos cada uno con PTw, dos lavados de 5 minutos cada
uno en MAB e incubación durante 2 horas en MAB/BMBR. A continuación se
incubó a 4° C durante la noche con rotación en 3 dimensiones con el anticuerpo
62

anti-digoxigenina conjugado a fosfatasa alcalina en una dilución de 1/3.000 en
MAB/BMBR. Finalmente, se retiró el anticuerpo en exceso con seis lavados con
MAB de media hora cada uno. Para la detección de los RNA mensajeros de
interés, los embriones se ambientaron en solución AP con dos lavados de cinco
minutos cada uno, luego se agregaron los sustratos BCIP y NBT 35% y 45%
respectivamente en solución AP y se incubaron en oscuridad a 37°C durante al
menos una hora o hasta que el color púrpura del precipitado fuese visible (BCIP
es sustrato de la fosfatasa alcalina y NBT funciona como un aceptor de
electrones, ambos forman precipitados). Una vez realizada la detección, los
embriones se fijaron en una solución 4% formaldehído en PBS 1x durante una
hora. Posteriormente, se hicieron tres lavados de 5 minutos y un lavado de una
hora en PBS 1x, para finalmente blanquear los embriones durante 3 horas
expuestos a luz fluorescente en solución de blanqueo (ver Materiales). Los
embriones enteros se observaron y fotografiaron con luz incidente (lupa
estereoscópica Leica MZ12) y una cámara digital Nikon Coolpix 5000, Japón.
Las imágenes fueron procesadas con el programa Adobe Photoshop 7.0.
63

RESULTADOS
1. Clonamiento del cDNA codificante para XREST/NRSF de
Xenopus laevis y Danio rerio.
Se aislaron cDNAs codificantes para los homólogos de REST/NRSF en
Xenopus laevis (XREST/NRSF) y Danio rerio (zREST/NRSF) mediante RT-
PCR. Para aislar XREST/NRSF se utilizó RNA total de embriones de Xenopus
de estadio de gástrula (10.5) y partidores diseñados en base a la secuencia de
un clon parcial correspondiente al extremo 5’ codificante de XREST/NRSF
(númerode acceso en genbank AF096301) y a la de un clon EST (XL066i17)
que codifica para el extremo carboxilo terminal y la región 3’ no traducida de
XREST/NRSF. Se aisló un producto de PCR único de 4503 pares de bases (pb)
que codifica para una proteína de 1501 aminoácidos de alta similitud a
REST/NRSF de mamíferos en el dominio de unión a DNA, que incluye los
primeros ocho dedos de zinc, y en los dominios corepresores: el de unión a
Sin3 en el extremo aminoterminal y el de unión a CoREST, en el carboxilo
terminal, donde se conserva el noveno dedo de zinc (Figura 14). En el caso de
zREST/NRSF se utilizó RNA total de embriones de 24 horas postfertilización y
partidores que fueron diseñados flanqueando la región codificante de
zREST/NRSF predicha a partir de la secuencia genómica anotada de Danio
rerio (www.ensembl.org) (Figura 14). Se obtuvo un producto de PCR único de
2565 pb que codifica para una proteína de 855 aminoácidos. Al igual que
XREST/NRSF, la proteína predicha conserva los nueve dedos de zinc y
presenta un alto grado de similitud en los dominios represores y de unión a
DNA de REST/NRSF (Figura 14). No se detectaron otras unidades
transcripcionales codificantes para proteínas similares a REST/NRSF mediante
el análisis del genoma de Danio rerio. Estos datos indican que tanto el genoma
de Xenopus laevis como el de Danio rerio, se encuentran presentes unidades
64

transcripcionales que codifican para proteínas homólogas a REST/NRSF de
mamíferos.
65

Figura 14. Alineamiento de la secuencia aminoacídica predicha de XREST/NRSF
y ZREST/NRSF con los homólogos en rata, ratón y humano. En fondo negro se
presentan los aminoácidos conservados, en cajas rojas se indican los dedos de zinc.
2. Patrón de expresión de XREST/NRSF durante el desarrollo
embrionario de Xenopus laevis.
Analizamos el patrón de expresión del mRNA de XREST/NRSF desde la
etapa de blástula tardía / gástrula temprana hasta la etapa de organogénesis
mediante hibridación in situ. Se utilizó una sonda que corresponde a 1300 pares
de bases (pb) de secuencia codificante río abajo del octavo dedo de zinc y de
205 pb de la región 3` no traducida de XREST contenida en el clon EST
XL066i17.
Previamente informamos que el transcrito de XREST/NRSF es detectado
mediante RT-PCR desde antes de la transcripción cigótica hasta después de su
inicio en la blástula media (Armisen et al., 2002). En la gástrula temprana el
transcrito de XREST/NRSF se detecta fuertemente en la región animal que da
origen a ectodermo embrionario y levemente en las regiones marginales dorsal
y ventral (Figura 15). En la néurula temprana (estadio 15) XREST/NRSF se
expresa en ectodermo, principalmente en la región del borde de la placa neural
anterior, para en la néurula tardía (est. 20) restringirse a las crestas neurales
cefálicas migratorias, circunscribiendo el sistema nervioso central anterior y
hacia posterior en el mesodermo presomítico (Figura 15). En estadio de
organogénesis (est. 25) y de organogénesis tardía (est. 31) el mensajero de
XREST/NRSF es detectado unicamente en los somitos y no en tejidos
derivados del ectodermo (Figura 15). Estos resultados son compatibles con las
funciones descritas para XREST/NRSF en otros modelos animales, tales como
su participación en el desarrollo neural y en el control transcripcional en el tejido
muscular de algunos genes neuronales que contienen RE-1/NRSE (Chen et al.,
1998, Paquette et al., 2000).
66

Figura 15. Patrón de expresión de XREST/NRSF durante el desarrollo
embrionario de Xenopus laevis. a, b) Embriones de estadio 10.5 en una vista lateral
con dorsal hacia la derecha. b) En un corte sagital se indica con puntas de flecha la
expresión de XREST/NRSF (tinción azul) en la región animal. c) Embrión de estadio 15
en una vista anterodorsal, la punta de flecha indica la expresión del mensajero en el
borde de la placa neural anterior. En d), e) y f) se muestran embriones de estadio 20 en
vistas dorsal, de un corte transversal (indicado en d) y anterior, respectivamente. La
flecha en d) y la punta de flecha en e) muestra la expresión en el el mesodermo
presomítico, en f) la punta de flecha indica la expresión circunscribiendo el cerebro
anterior y la flecha en la crestas neurales cefálicas. g) y h) muestran vistas laterales de
embriones de estadío 25 y 31, respectivamente. La punta de flecha indica la expresión
en somitos..
67

3. Participación de XREST/NRSF en la neurogénesis de Xenopus
laevis.
3.1 XREST/NRSF es necesario para la expresión de los genes
neuronales estructurales.
Previamente mostramos que la interferencia de la función de
XREST/NRSF desde estadios previos a la transcripción cigótica mediante la
expresión de un dominante negativo, conduce a la disminución de la expresión
de los genes neuronales estructurales durante la diferenciación neuronal
(Armisen et al., 2002). En este trabajo reexaminamos la función de
XREST/NRSF en la neurogénesis utilizando un dominante negativo inducible de
XREST/NRSF que denominamos dnXREST. dnXREST es una proteína
quimérica que consta del dominio de unión a DNA de XREST/NRSF fusionado
a la región reguladora del receptor de glucocorticoides. Se inyectaron en un
blastomero embriones de estadio de dos células con el mRNA codificante de
dnXREST y lacZ, el que se utiliza como marcador de linaje. La activación de
dnXREST en estadío de blástula tardía (est. 9), mediante la adición de
dexametasona en el medio de cultivo, resulta en la disminución de la expresión
de N-tubulin, XNav1.2 y SCG10 en el tubo neural y en la placoda trigeminal de
embriones de estadio de néurula (est. 18) (Figura 16). Este fenotipo es similar al
observado con el dominante negativo de expresión constitutiva (Armisen et al.,
2002). La activación de dnXREST en estadio de gástrula tardía (est. 12) resulta
en fenotipos de menor expresividad y penetrancia (Figura 16) (Tabla 4).
Los cortes histológicos transversales de los embriones, revelan que
además de la disminución de la expresión de los genes neuronales analizados,
la interferencia de la función de XREST/NRSF desde estadio de blástula
conduce al engrosamiento o expansión del tejido neural (Figura 16). Este
defecto morfológico enmascara la señal de la hibridación in situ cuando los
embriones son observados completos (Figura 16).
Para confirmar estos resultados inhibimos la función de XREST/NRSF
disminuyendo los niveles de la proteína a través de la inyección de un
68

antisentido morfolino que está diseñado en base a la secuencia del inicio de la
traducción de XREST/NRSF, el cual fue previamente utilizado por Armisen et
al., (2002) y que denominamos MoXREST. Los embriones inyectados con
MoXREST presentan una disminución más acentuada de la expresión de los
genes neuronales analizados y defectos morfológicos similares a los
observados al activar dnXREST en estadio 9 (Figura 16). Concordante con
esto, el análisis de la morfología de larvas tempranas en las cuales se interfirió
con la función de XREST/NRSF desde la blástula tardía revela severos defectos
mórfológicos en el sistema nervioso, que incluye defectos en el desarrollo del
ojo (Figura 16). Estos datos confirman los resultados previamente descritos en
nuestro laboratorio y sugieren que XREST/NRSF es necesario durante la
especificación del tejido neural para su morfogénesis y para la expresión de los
genes neuronales estructurales.
69

Figura 16. La interferencia de la función de XREST/NRSF resulta en la disminución de la expresión de los genes
neuronales estructurales y en defectos morfológicos del tejido neural. A) Vistas anterodorsales y cortes transversales
de embriones de Xenopus laevis de estadio de néurula (est. 18) inyectados con 500 pg de dnXREST o 40 ng de
MoXREST (indicado arriba). El estadio de activación de dnXREST se indica arriba y los genes analizados mediante
hibridación in situ a la izquierda de cada fila. Las flechas indican la región del tubo neural y las puntas de flecha indican la
placoda trigeminal. Los cortes transversales confirman la disminución de la expresión de N-tubulin, SCG10 y NaV1.2
(flechas) y muestran la alteración de la morfología del tubo neural. No se observan alteraciones en los embriones
inyectados con dnXREST no inducidos.
B) Vistas laterales de una larva temprana inyectada unilateralmente con dnXREST, el cual fue activado en estadío de
blástula tardía. Abajo se muestra el lado inyectado y se indica con flecha roja el defecto en el desarrollo del ojo. Arriba se
muestra el lado no inyectado el cual no presenta alteraciones aparentes.
70

Moléculas
dnXREST MoXREST
inyectadas Dex (+) st. 9 Dex (+) st.
Genes
Analizados
12
N-tubulin 88% (n=35) 70% (n=20) 88% (n=23)
XNav1.2 51% (n=45) 46% (n=35) 79% (n=19)
SCG10 95% (n=22) 49% (n=35) 80% (n=20)
Tabla 4. Efecto de la interferencia de la función de XREST/NRSF en la expresión
de los genes neuronales estructurales. La tabla muestra el porcentaje de embriones
que presentan disminución y desorganización de la expresión de los genes neuronales
estructurales señalados a la derecha. Arriba se indica la moléculas inyectadas y el
estadio de inducción de dnXREST.
71

3.2 La interferencia de la función de XREST/NRSF perturba la
neurogénesis primaria y conduce a la expresión ectópica y prematura de
Nav1.2.
La expresión de los genes neuronales estructurales se inicia en la
néurula temprana durante la neurogénesis primaria y es detectable en la placa
neural posterior como tres bandas longitudinales de expresión a cada lado de la
línea media y anteriormente en la placoda trigeminal. Ya que la disminución de
la expresión de estos genes en la néurula tardía puede ser debida a una
alteración en la mantención de su expresión o a la inhibición del destino
neuronal, analizamos si este fenotipo tardío se reproduce en etapas más
tempranas.
La interferencia de la función de XREST/NRSF mediante la activación de
dnXREST en la blástula tardía conduce a la pérdida de expresión de N-tubulin
en la placa neural y en la placoda trigeminal de embriones de néurula temprana
(estadio 15), lo que es coincidente con lo observado en embriones de néurula
tardía (Figura 17; Tabla 2). Sorprendentemente, esta misma maniobra resulta
en la expresión ectópica y prematura en la placa neural y en el ectodermo no
neural del canal de sodio dependiente de potencial eléctrico Nav1.2 en
embriones de estadio 13-14 (Figura 17; Tabla 2). Este resultado se ajusta al
modelo clásico de la función de REST/NRSF como un regulador negativo de la
expresión de genes neuronales estructurales en tejido no neuronal y
progenitores neurales, y además indica que este fenotipo es transitorio. La
activación de dnXREST en la gástrula tardía produce fenotipos más leves que
los observados con la activación en la blástula temprana para ambos genes, lo
que también es concordante con los resultados obtenidos del análisis en la
néurula tardía (Figura 16). Estos resultados sugieren que XREST/NRSF podría
participar en etapas más tempranas de la neurogénesis, ya sea en la
determinación neuronal, modulando el mecanismo de inhibición lateral o más
tempranamente, en el establecimiento de los dominios neurogénicos.
72

X-ngnr-1 induce X-Delta-1 e inicia la cascada genética que conduce a la
expresión de los genes neuronales estructurales. La activación de dnXREST en
la blástula tardía resulta en la disminución o pérdida de expresión de X-ngnr-1 y
X-Delta-1 en la placa neural y promueve el desplazamiento hacia lateral de los
dominios neurogénicos (Figura 17; Tabla 5). Junto con esto, el análisis de la
expresión de Zic2, el cual se expresa en los dominios interneurogénicos y
además inhibe la expresión y actividad de X-ngnr-1, muestra que la
interferencia de la función de XREST/NRSF se asocia a la expansión de su
territorio de expresión (Figura 17).
73

74
Figura 17. La interferencia de
la función de XREST/NRSF
inhibe la neurogénesis y
conduce a la expresión
ectópica y prematura de
Nav1.2. Vistas antero-dorsales
de embriones de Xenopus en
estadio de néurula temprana
inyectados unilateralmente con
dnXREST en estadio de dos
células. A la izquierda de cada
fila se muestran los genes
analizados y arriba el estadio
en que dnXREST fue activado.
Nótese la disminución de la
expresión de N-tubulin en (b)
comparado con (a) (puntas de
flecha). Nav1.2 no se expresa
en estadio de neurula temprana
(d), la activación de dnXREST
resulta en la expresión ectópica
y prematura de Nav1.2 (e y f,
puntas de flecha). La inhibición
X-ngnr-1 en la placoda
trigeminal (h) y de X-Delta-1 (k
y l) en los dominios
neurogénicos medial e
intermedio se señala con
puntas de flecha. En (n) se
muestra la expansión de Zic2
en el dominio reurogénico
medial (guías), al análisis de X-
Delta-1 (k) también revela la
expansión de este dominio.

Moléculas
dnXREST
inyectadas Dex (+) st. 9 Dex (+) st. 12
Genes
Analizados y fenotipo asociado
N-tubulin (Disminución de la expresión) 100% (n=23) 30% (n=20)
Nav1.2 (expresión ectópica) 52% (n=58) 40% (n=35)
X-ngnr-1 (Disminución de la expresión) 77% (n=62) 40% (n=15)
X-Delta-1 (Disminución de la expresión) 96% (n=24) 92% (n=13)*
Zic2 (expansión dominio de expresión) 87% (n=23) 8% (n=12)
Tabla 5. Porcentaje de embriones que presentan fenotipos asociados a la
interferencia de la función de XREST/NRSF. Los fenotipos de los embriones
expuestos a dexametasona en estadio 12 son de menor intensidad.
* efecto debil.
El patrón de expresión de Notch-1 no presenta alteraciones significativas
asociadas a la activación de dnXREST en la blástula tardía (Figura 18). Sin
embargo, la expresión de XHes-1, el cual es un blanco directo de la vía de
Notch, es inhibida al interferir con la función de XREST/NRSF, lo que es
concordante con la inhibición de la expresión de X-Delta-1 (Figura 17). Estos
resultados indican que la interferencia de la función de XREST/NRSF altera el
programa neurogénico inhibiendo la expresión de X-ngnr-1 de manera
independiente del mecanismo de inhibición lateral y aparentemente a través de
modulación de la expresión de Zic2.
75

4. Participación de XREST/NRSF en la formación del patrón
dorso-ventral del ectodermo de Xenopus laevis.
4.1 XREST/NRSF participa en el establecimiento del territorio
neural.
El desplazamiento de los dominios neurogénicos de embriones donde se
ha interferido con la función de XREST/NRSF es compatible con nuestros
resultados preliminares que muestran que la expresión de dnXREST y su
activación en estadio de blástula temprana conducen a la expansión de la placa
neural. Estos antecedentes sugieren que XREST/NRSF podría estar
participando en la especificación del ectodermo durante la inducción neural.
Para probar esta idea, analizamos la expresión de genes efectores de la
inducción neural en embriones inyectados unilateralmente con dnXREST o
MoXREST. La Figura 19 muestra que la interferencia de la función de
XREST/NRSF desde estadio 9 resulta en la expansión lateral del patrón de
expresión de SoxD y Sox2 en embriones de néurula temprana, el mismo efecto
es observado en embriones inyectados con MoXREST (Tabla 6). De manera
76
Figura 18. La activación de
dnXREST inhibe la expresión de
XHes-1 y no altera la expresión de
Notch-1. Vistas anterodorsales de
embriones en estadio de néurula
inyectados con dnXREST. Arriba se
indica el estadio de activación de
dnXREST y a la izquierda los genes
analizados.
La activación de dnXREST en la
blástula tardía resulta en la inhibición
de la expresión de XHes-1 (90%,
n=29) en el dominio neurogénico
intermedio (punta de flecha) (b), y no
altera la expresión de Notch-1 (n=44)
(d).

complementaria la expresión de keratina epidermal se desplaza lateralmente y
disminuye. El análisis de la expresión de msx-1, el cual es un gen regulado
directamente por la señalización de BMP que promueve el destino epidermal y
de cresta neural, muestra que la activación de dnXREST en estadio 9 o la
inyección de MoXREST resulta en el desplazamiento hacia ventral y en la
disminución de su expresión (Tabla 3). Consistente con esto, el análisis de la
expresión del marcador de crestas neurales Slug arroja resultados similares
(Figura 19). La activación de dnXREST en la gástrula tardía resulta en efectos
de menor intensidad para todos los genes analizados (Tabla 3). Estos
resultados en conjunto indican que la interferencia de la función de
XREST/NRSF en el ectodermo durante el proceso de inducción neural y de las
crestas neurales, conduce a la expansión de la placa neural sobre la región
límite entre el ectodermo neural y no neural y sugieren que XREST/NRSF es
necesario para la adquisición del destino de cresta neural y epidermis.
77

Figura 19. La interferencia de la función de XREST/NRSF conduce a la expansión
de la placa neural sobre la región borde. Cortes transversales (a-c, e-g), vistas
dorsales (d, h-j, m- t) y anteriores (k y l) de embriones inyectados con 0.5 ng de
dnXREST o 40ng de MoXREST (indicado arriba). Los marcadores analizados se
indican a la izquierda de cada fila. Los embriones inyectados con MoXREST y con
dnXREST, inducidos en la blástula tardía (Dex(+) st. 9), presentan expansión de los
marcadores neurales SoxD y Sox2 (a-h, guías) y disminución de la expresión de
queratina epidermal (j,l), msx-1 (n,p) y Slug (r,t) (flechas). Los embriones inducidos en
la gástrula tardía (Dex(+) st. 12) presentan efectos más débiles: SoxD (c), Sox2 (g),
keratin (k), msx-1 (o) and Slug (s).
78

Moléculas
inyectadas
Genes
Analizados
dnXREST MoXREST
Dex (+) st. 9 Dex (+) st. 12
SoxD 73% (n=79) 42% (n=36) 100% (n=22)
Sox2 77% (n=51) 57% (n=21) 76% (n=21)
Keratin 71% (n=52) 57% (n=21) 93% (n=14)
msx-1 90% (n=29) 36% (n=44) 56% (n=16)
Slug 82% (n=38) 66% (n=29) 63% (n=22)
Tabla 6. Porcentaje de embriones con fenotipos asociados a la interferencia de la
función de XREST/NRSF. Se muestra el porcentaje de embriones con expansión de
los marcadores neurales SoxD y Sox2, con desplazamiento lateral e inhibición de la
expresión de queratina epidermal, msx-1 y Slug.
79

4.2 La sobreexpresión de XREST/NRSF o de zREST/NRSF revierte
los fenotipos asociados a la interferencia de la función de XREST/NRSF.
La expansión del tejido neural y el desplazamiento lateral del ectodermo
epidermal asociados a la activación de dnXREST en estadio de blástula tardía
fueron revertidos parcialmente al coexpresar cantidades equimolares de
dnXREST y del cDNA codificante para XREST/NRSF (Sox2 50%, n=24; keratin
51, n=20) (Figura 20). Junto con esto, los embriones coinyectados con estas
moléculas y no expuestos a dexametasona no muestran alteraciones
aparentes, lo que indica que la sobreexpresión de XREST/NRSF no conduce a
defectos en la especificación del ectodermo (Figura 20). De manera semejante
los efectos observados en los embriones inyectados con MoXREST o con
dnXREST fueron rescatados por la coexpresión del cDNA codificante para
zREST/NRSF (64%, n=28), el cual no contiene la secuencia contra la cual está
dirigido el morfolino (Figura 20). La expresión de XREST/NRSF no revirtió el
efecto de MoXREST (dato no mostrado), lo que confirma la especificidad del
morfolino. Finalmente embriones inyectados con un morfolino control o con el
mRNA de lacZ y tratados con dexametasona no presentan defectos (Figura 22).
Estos resultados muestran que las estrategias utilizadas para interferir con la
función de XREST/NRSF son específicas y que zREST/NRSF es funcional en
Xenopus laevis.
80

A
B
Figura 20. La expansión de la placa neural asociada a la interferencia de la
función de XREST/NRSF es rescatada por la sobreexpresión de XREST/NRSF y
zREST/NRSF. Vistas anteriores de embriones de estadio de néurula tardía inyectados
con 200 pg de dnXREST (A: a,b.e.f; c), 200 pg dnXREST y 1 ng de XREST (A: c,d,g,h)
o 1ng de zREST (B: d), 40ng MoXREST (B: a) y 40 ng MoXREST junto con 1ng de
zREST (B: d). A la izquierda se indican los marcadores analizados. Nótese que la
expansión de Sox2 en A: b (flechas blancas) y B: a, c (guias y puntas de flecha) y la
inhibición de queratina en A: f (flecha blanca) es revertida por la coexpresión de
XREST (flechas rojas) o zREST (guías, punta de flecha).
81

4.3 Los fenotipos ectodérmicos asociados a la interferencia de la
función de XREST/NRSF no son producto de alteraciones en la
especificación del mesodermo o de la proliferación de las células del
ectodermo.
Ya que estos fenotipos podrían ser efecto de alteraciones en la
especificación del mesodermo analizamos la expresión de chordin, el cual se
expresa en el mesodermo dorsal en la gástrula y posteriormente en el
mesodermo axial, y de MyoD, el cual es un gen que determina el destino
muscular y se expresa en el mesodermo paraxial o presomítico. La activación
de dnXREST en la blástula temprana o tardía no altera el patrón de expresión
de chordin (n=25), ni de MyoD (n=30), el cual tampoco se ve afectado cuando
dnXREST es activado en la gástrula tardía (Figura 21).
La expansión de la placa neural podría estar asociada a un aumento de
la proliferación de las células del ectodermo neural presuntivo. Para analizar
esta posibilidad monitoreamos el número de células en división en estadío de
néurula temprana con un anticuerpo que marca histona H3 fosforilada. La
interferencia de la función de XREST/NRSF desde estadío de blástula temprana
o tardía no condujo a diferencias aparentes en el número de células teñidas con
el anticuerpo (n=40) (Figura 21).
Los resultados en conjunto sugieren que la expansión de la placa neural
observada en los embriones con función disminuida de XREST/NRSF ocurre a
través de la alteración del patrón de especificación dorso-ventral del ectodermo
y no a alteraciones de la especificación del mesodermo dorsal o del ciclo
proliferativo de las células del ectodermo.
82

Figura 21. La interferencia de la función de XREST/NRSF en el ectodermo no
altera la expresión de marcadores mesodérmicos ni el estado de proliferación de
las células del ectodermo. Vistas dorsales y cortes sagitales de embriones de estadio
de gástrula temprana (a, b) y vista dorsal y corte transversal de un embrión de estadio
de néurula (c) donde se muestra que la activación de dnXREST en estadio 6 o 9 no
altera el patrón de expresión de chordin (flechas), ni resulta en la expresión ectópica en
el ectodermo (a y b, puntas de flecha). (d-i) Vistas dorsales de embriones de estadio de
neurula donde se muestra (flechas) que la activación de dnXREST no altera la
expresión de MyoD en el mesodermo paraxial (d-f) ni el patrón de histona H3
fosforilada en el ectodermo (g-i).
83

4.4 La sobreexpresión de XREST1 no altera el desarrollo neural.
En celulas PC12, rata y en un tipo de células tumorales de pulmón se
han aislado variantes de procesamiento de REST/NRSF que codifican para
proteínas que constan del dominio aminoterminal y de los primeros de cuatro y
cinco dedos de zinc del dominio de unión a DNA, respectivamente (Shimojo et
al., 1999; Coulson et al., 2000; Palm et al., 1998). Se ha propuesto que estas
variantes de procesamiento alternativo, que carecen del dominio de unión a
CoREST y que presentan incompleto el dominio de unión a DNA, funcionan
como dominantes negativos de XREST/NRSF.
En Xenopus, previamente aislamos una variante de procesamiento
alternativo de XREST/NRSF que consta del dominio aminoterminal y de los
primeros 4 dedos de zinc y que por su homología a la variante REST1 de rata y
humano, la denominamos XREST1 (Armisen y Kukuljan, datos no publicados,
Palm et al., 1998). XREST1 se expresa en Xenopus desde la gástrula tardía, a
diferencia de transcrito de XREST/NRSF que se expresa antes y después del
inicio de la transcripción cigótica (Armisen y Kukuljan, datos no publicados).
Para probar la idea de que XREST1 regula la actividad de XREST/NRSF
durante el desarrollo, sobreexpresamos XREST1 en embriones de Xenopus. No
detectamos alteraciones morfológicas en embriones de estadio de néurula ni en
los patrones de expresión de N-tubulin, Sox2 y Slug, lo que indica que el patrón
dorsoventral del ectodermo no es alterado por la sobreexpresión de XREST1 y
sugiere que esta variante de procesamiento no modula negativamente la
actividad de XREST/NRSF (Figura 22).
84

Figura 22. La sobreexpresión de XREST1 no altera el patrón dorsoventral del
ectodermo. Vistas antero-dorsales de embriones en estadio de néurula (estadio 18)
inyectados en estadio de dos células unilateralmente con el mRNA indicado arriba y
con un morfolino control (control Mo, columna central). Los marcadores analizados se
muestran a la izquierda. La columna de la derecha muestra que la sobreexpresión de
XREST1 no altera el patrón de expresión de N-tubulin, Sox2 y Slug. De manera
semejante, la inyección del morfolino control (columna central) y la adición de
dexametasona a embriones inyectados sólo con el mRNA de lacZ (columna de la
izquierda), no resulta en la alteración de los marcadores analizados.
85

4.5 La interferencia de la función de XREST/NRSF resulta en la
neuralización de explantes animales y en la inhibición del destino
epidermal.
La expansión del ectodermo neural en embriones donde se ha interferido
con la función de XREST/NRSF sugiere que una de las funciones de este gen
en el ectodermo es contribuir a la adquisición del destino epidermal. Para
probar este razonamiento, analizamos la expresión de Sox2 y queratina
epidermal en explantes animales y en el ectodermo ventral de embriones con
pérdida de función de XREST/NRSF. El análisis de embriones en estadio de
néurula, donde la expresión de dnXREST se dirigió al ectodermo ventral,
muestra que la activación del dominante negativo en estadío 9 no conduce a la
expresión ectópica de Sox2 y resulta en la inhibición de la expresión de
queratina epidermal (Figura 23). A diferencia de los embriones completos,
explantes animales correspondientes a estadio de néurula, escindidos en
estadio 9 y donde dnXREST se activó en esta misma etapa, presentan
expresión ectópica de Sox2 y de manera similar a los embriones completos
presentan inhibición de la expresión de queratina epidermal (Figura 23). Estos
resultados indican que XREST/NRSF es requerido para la adquisición del
destino epidermal y que la disminución de su función no conduce a la
neuralización del ectodermo ventral en embriones completos. Este último dato
muestra que el efecto neuralizante asociado a la interferencia de la función de
XREST/NRSF no ocurre a través de la desrepresión de Sox2 o de SoxD, el cual
puede neuralizar el ectodermo por si solo. Más bien, estos resultados junto con
el fenotipo de inhibición de la expresión de msx-1 son compatibles con la idea
de que la interferencia de la función de XREST/NRSF altera la señalización de
BMP en el ectodermo.
86

Figura 23. A) La interferencia de la función de XREST/NRSF inhibe la adquisición
del destino epidermal en el ectodermo ventral. (a-c; g-i) Grupos de embriones de
estadío néurula inyectados con dnXREST en la región ventral en vistas laterales y
ventrales. Se muestra con puntas de flecha que la activación de dnXREST en estadio 9
no resulta en la expresión ectópica de Sox2 (b), pero si en la inhibición de keratin en
parches colocalizados con el marcador de linaje (h). (d-f; j-l) Explantes animales de
embriones inyectados con dnXREST y escindidos en estadio 9. La activación de
dnXREST en estadio 9 resulta en la expresión ectópica de Sox2 (e) y en la inhibición
de keratin (k). La activación en estadio 12 resulta en fenotipos mas débiles y menos
penetrantes (f,i,l). B) La interferencia de la función de XREST/NRSF inhibe la
expresión de msx-1 y vent2 en explantes animales. Análisis mediante RT-PCR de
explantes animales de estadio 11, de embriones inyectados con dnXREST. La adición
de dexametasona en estadio 9 resulta en la inhibición de la expresión de msx-1 y vent2
en relación al control de carga (ornitina decarboxilasa, odc).
87

4.6 XREST/NRSF participa en la formación del patron dorsoventral
del ectodermo a través de la modulación de la vía de señalización
de BMP.
La actividad de la via de señalización de BMP es necesaria para la
especificación de la epidermis, mientras que la inhibición de su actividad es un
requisito para la adquisición del destino neural (revisado en Stern, 2005). La
inhibición de la función de XREST/NRSF emula los resultados obtenidos al
disminuir la actividad de BMP en el ectodermo dorsal y ventral (ver
introducción).
Para poner a prueba la hipótesis de que XREST/NRSF modula la
actividad de la vía de BMP en el ectodermo, en primer lugar comparamos los
niveles de abundancia relativa de los transcritos de msx-1 y vent2, los cuales
son regulados directamente por BMP, entre explantes animales de estadio 11
que expresan dnXREST expuestos y no expuestos a dexametasona desde
estadío 9.5. Los explantes donde se indujo dnXREST presentan niveles
reducidos de msx-1 y vent2 en comparación al control no inducido (Figura 23).
El análisis comparativo de los niveles de abundancia relativa de los transcritos
de Bmp-4 y de los inhibidores de la vía de BMP Smad6, Smad7 y Smurf1, no
arrojó diferencias aparentes (no mostrado). Estos resultados sugieren que la
interferencia de la función de XREST/NRSF conduce a la disminución de la
señalización de BMP y que aparentemente no se debe a la inhibición de la
expresión de Bmp-4 o a un aumento de la expresión de Smad6/7 o Smurf1.
En base a estos resultados, en segundo lugar probamos si la
interferencia de la función de XREST/NRSF era capaz de revertir los fenotipos
asociados a la sobreexpresión de Bmp-4 y viceversa. La adición de
dexametasona a embriones coinyectados unilateralmente con el mRNA de
Bmp-4 y dnXREST revierte la contracción del tejido neural que presentan los
embriones no expuestos a dexametasona (Figura 24, Tabla 7). Concordante
con ésto, la activación de dnXREST resulta en la reversión del desplazamiento
dorsal de queratina epidermal msx-1 y Slug que experimentan los embriones
88

que sobreexpresan Bmp-4 (Figura 24, Tabla 7). La contracción del territorio
correspondiente a las crestas neurales presuntivas en embriones que
sobreexpresan Bmp-4 tambien es revertida por la activación de dnXREST, sin
embargo la inhibición de Slug asociada a la interferencia de dnXREST es
parcialmente rescatada por la sobreexpresión de Bmp-4 (Figura 24, Tabla 7).
Finalmente, la disminución de la expresión de msx-1 en el borde del tejido
neural y de Krox20 en los rombomeros 3 y 5 asociada a la activación de
dnXREST, es parcialmente rescatada por la sobreexpresión de Bmp-4 (Figura
24, Tabla 7). Estos resultados en conjunto sugieren que XREST/NRSF participa
en el establecimiento del patrón dorsoventral del ectodermo a través de la
modulación de la vía de señalización de BMP.
89

Figura 24. Los fenotipos
asociados a la interferencia
de la función de
XREST/NRSF son
revertidos parcialmente
por la sobreexpresión de
Bmp-4. Vistas anteriores
en detalle (a-l) y vistas
dorsales (m-t) de
embriones de estadio 18
inyectados unilateralmente
en estadio de 2 células
con 250 pg del mRNA de
lacZ más 500 pg de
dnXREST o con 500 pg
dnXREST más 500 pg
mRNA de Bmp4, tal como
se indica arriba. La
activación de dnXREST en
estadio de blástula tardía
se asocia a la expansión
de Sox2 (b), al desplazamiento
lateral e
inhibición de la expresión
de keratin (f, guías), Slug
(j, guías), inhibición de
msx-1 (n, flecha) e
inhibición de Krox20 en los
rombomeros 3 y 5 (r,
punta de flecha) y
desplazamiento y disminución
de la expresión en
el territorio que marca las crestas neurales (r, flecha). La sobreexpresión de Bmp-4
resulta en embriones inyectados con dnXREST no expuestos a dexametasona resulta
en la inhibición de Sox2 (c, flecha), desplazamiento dorsal de keratin (g, flecha) y Slug
(k, guías), donde tambien se observa disminución de su expresión (punta de flecha).
Junto con esto se muestra que la sobreexpresión de Bmp-4 resulta en el aumento de
expresión de msx-1 (o, flecha), en el desplazamiento dorsal y contracción del territorio
de las crestas neurales que es delimitado por la expresión de este gen (o, puntas de
flecha) y en la contracción de la marca de Krox20 en los rombomeros 3 y 5 (s, puntas
de flecha) y disminución de su dominio de expresión en las crestas neurales (s). La
activación de dnXREST en embriones que sobreexpresan Bmp-4, revierte la inhibición
de Sox2 (d, flecha y guías), el desplazamiento dorsal de keratin (h, guías), Slug (l,
guías) y msx-1 (p) y la contracción del dominio de expresión neural de Krox20 (t, punta
de flecha). Aunque dnXREST rescata la contracción de el territorio de cresta neural
delimitado por msx-1 (p, puntas de flecha) y la expresión de Krox20 sobre este tejido (t,
flecha), aun se observa inhibición de keratin (h, flecha) en la epidermis y de Slug (l,
flecha).
90

Moléculas
Inyectadas
dnXREST + Bmp-4
Genes
Analizados
Efecto observado
Dex (-) Dex (+) st. 9
Sox2 inhibición de la
expresión
92% (n=50) 27% (n=37)
Keratin desplazamiento dorsal 100% (n=41) 13% (n=37)
Slug desplazamiento dorsal 93% (n=14) 30% (n=10)
msx-1 desplazamiento dorsal
y aumento de
expresión
Krox20 inhibición de la
expresión sobre el
pliegue neural
69% (n=13) 11% (n=18)
86% (n=22) 41% (n=22)
Tabla 7. La interferencia de la función de dnXREST revierte parcialmente los
fenotipos asociados a la sobreexpresión de Bmp-4. Se muestra el porcentaje de
embriones con fenotipos asociados a la sobreexpresión de Bmp-4 en embriones
inyectados unilateralmente con el mRNA de dnXREST y Bmp-4. La activación de
dnXREST en estadio de blástula tardia (Dex (+) st. 9) revierte parcialmente los efectos
observados en embriones no expuestos a dexametasona (Dex (-)).
5. XREST/NRSF regula la adquisición de la excitabilidad durante
la diferenciación neuronal.
Los datos mostrados por Armisen et al., (2002), muestran que el
transcrito de XREST/NRSF es detectado en neuronas espinales en
diferenciación mediante RT-PCR de célula única. Por otra parte, nuestro
análisis del patrón de expresión de XREST/NRSF mediante hibridación in situ,
muestra que el transcrito es detectado debilmente en el neuroectodermo
durante la diferenciación de las neuronas primarias (estadio 15) y que no es
detectado posteriormente en el tubo neural (estadio 18) ni en la médula espinal
(etapas larvarias). Estos datos indican que los niveles del mRNA de
XREST/NRSF disminuyen en el neuroectodermo durante la neurogénesis y que
son mínimos en neuronas en diferenciación, lo que sugiere que XREST/NRSF
podría modular la adquisición de las características funcionales durante este
período a través de la regulación negativa de la transcripción de los genes
neuronales estructurales.
91

Para poner a prueba esta idea se compararon los niveles de expresión
de la corriente de sodio dependiente de potencial eléctrico, mediante el análisis
de la densidad de corriente usando patch clamp en configuración de célula
completa, entre cultivos primarios de neuronas espinales de embriones
inyectados con el mRNA de dnXREST y GFP, expuestos y no expuestos a
dexametasona (Figura 25). La activación de dnXREST, inmediatamente
después de realizado el cultivo (estadio 15), resulta en un aumento significativo
de la densidad de corriente de sodio de neuronas cultivadas por 14 horas
(estadio 24), las que corresponden a neuronas que aún no alcanzan la madurez
de sus características electrofisiológicas (Figura 25). Este resultado indica que
XREST/NRSF regula la adquisición de la corriente de sodio dependiente de
potencial eléctrico durante la diferenciación terminal de las neuronas espinales
primarias.
92

Figura 25. XREST/NRSF modula la expresión de la corriente de sodio
dependiente de potencial eléctrico en neuronas espinales de Xenopus laevis. A)
Estrategia experimental utilizada para interferir con la función de dnXREST en
neuronas espinales primarias de Xenopus. Se inyectó unilateralmente el mRNA de
dnXREST y de la proteína fluorescente verde (GFP) en la región animal de embriones
de estadio de dos células (izquierda). En estadio de néurula (st.15) se disectó la mitad
posterior de la placa neural, las células constituyentes fueron disociadas y cultivadas
en presencia de dexametasona (centro). Entre 12 y 14 horas de cultivo (estadio 24) se
analizó mediante patch clamp la densidad de corriente de sodio de células con neuritas
distinguibles. B) Análisis de la densidad de corriente de sodio en células con pérdida de
función de XREST/NRSF. A la izquierda se muestran registros electrofisiológicos
representativos de una neurona que no expresa GFP (control, arriba) y de otra que si
expresa GFP (dnXREST, abajo). A la derecha se muestra el análisis de la densidad de
corriente sodio dependiente de potencial eléctrico de neuronas con pérdida de función
de XREST/NRSF (dnXREST) y neuronas control.
93

6. XCoREST participa en el establecimiento del destino neural.
En embriones de Xenopus el patrón de expresión de XREST/NRSF es
muy similar al de XCoREST, el cual se expresa en la región lateral de la placa
neural en estadío 13 y posteriormente en los subdominios neurogénicos durante
la neurogénesis primaria (de la Calle-Mustienes y cols., 2001; Armisen y cols.,
2002). Estos antecedentes son compatibles con la idea de que la participación
de XREST/NRSF en la neurogénesis es dependiente de su interacción con
XCoREST. Para probar esta idea disminuimos los niveles de XCoREST a
través de la inyección de un morfolino antisentido (MoXCoREST) diseñado
contra la secuencia de inició de la traducción. Los embriones inyectados con 10
ng de MoXCoREST presentan expansión lateral de Sox2 y disminución de su
expresión en las células que expresan el marcador de linaje β-gal (Figura 26).
Complementariamente, se observó expansión lateral de los dominios de
expresión de msx-1 y XSlug, y a diferencia de los efectos observados al
inyectar 40 ng de MoXREST o 500 pg de dnXREST (inducido en la blástula
tardía), no se observó disminución de la expresión de estos marcadores (Figura
26).
Para probar si XREST/NRSF y XCoREST interactúan genéticamente,
coinyectamos MoXREST en una concentración subumbral (20 ng) junto con 10
ng de MoXCoREST. Los embriones inyectados sólo con MoXREST no
presentan alteraciones significativas, excepto alteraciones en el desarrollo del
primordio del ojo (Figura 26, Tabla 8). Mientras que los embriones inyectados
con ambos morfolinos, muestran una mayor expansión de Sox2 e inhibición de
su expresión en las células que expresan el marcador de linaje (Figura 26,
Tabla 8). Concordante esto, se observó un mayor desplazamiento de msx-1 y
Slug y no se observó disminución de su expresión (Figura 26, Tabla 8).
Estos resultados sugieren que XCoREST interactúa con XREST/NRSF en el
establecimiento del territorio neural y que la disminución de su función inhibe la
adquisición del destino neural y no altera el destino de las células del borde de
la placa neural.
94

Moléculas
inyectadas
Genes
Analizados
MoXREST MoXCoREST MoXREST/
MoXCoREST
Sox2 25% (n=16) 31% (n=19) 55% (n=11)
msx-1 0% (n=12) 64% (n=11) 82% (n=11)
Slug 21% (n=14) 55% (n=18) 69% (n=13)
Tabla 8. XCoREST participa en el establecimiento del territorio neural e interactúa
geneticamente con XREST/NRSF. Se muestra el porcentaje de embriones con
expansión de Sox2 y desplazamiento lateral de msx-1 y Slug. Los efectos son de
mayor intensidad en los embriones coinyectados con ambos morfolinos.
95

Figura 26. XCoREST participa en el establecimiento del territorio neural e
interactúa geneticamente con XREST/NRSF durante este proceso. Vistas
anteriores de embriones de estadio de néurula tardía inyectados unilateralmente en
estadio de dos células con 20 ng de MoXREST, 10 ng de MoXREST o la combinación
de ambos (indicado arriba). A la izquierda se indican los genes analizados. La
inyección de 10 ng de MoXCoREST resulta en una ligera expansión de Sox2 (b,
guías), y en el desplazamiento lateral de msx-1 y Slug (e, h, puntas de flecha). Nótese
que la inyección de concentraciones subumbrales de MoXREST no resulta en efectos
significativos en la expresión de Sox2, msx-1 y Slug. La coinyección de ambos
morfolinos resulta en un en una marcada expansión de Sox2 sobre la región borde (c,
guías) y en la inhibición de su expresión en las células que expresan el marcador de
linaje (c, punta de flecha). Junto con esto se observa mayor desplazamiento de msx-1
y Slug (f, i, puntas de flecha).
96

DISCUSIÓN
REST/NRSF fue descrito como un regulador negativo de los genes
neuronales estructurales en células no neuronales diferenciadas y en
progenitores neurales indiferenciados (Chong et al., 1995; Schoenherr y
Anderson., 1995). Sin embargo, embriones de ratón con una deleción nula de
REST/NRSF no presentan expresión ectópica de todos los genes neuronales
analizados que poseen el elemento de unión a REST (RE-1/NRSF) en su
promotor y además presentan retraso en el crecimiento y letalidad en estadio
embrionario 11 (Chen et al., 1998). Lo que sugiere que durante el desarrollo
embrionario REST/NRSF participa de otros procesos además de la regulación
de los genes neuronales estructurales. Recientemente se ha descrito que
REST/NRSF controla el tránsito de células troncales embrionarias a
progenitores neurales y finalmente a neuronas diferenciadas y que los
mecanismos moleculares asociados a la inhibición de la transcripción de los
genes blanco son diferentes entre precursores neurales y células no neuronales
diferenciadas (Ballas et al., 2005).
En esta tesis se determinó que durante el desarrollo embrionario de
Xenopus laevis, XREST/NRSF es necesario para la formación del patrón dorsoventral
del ectodermo, para la adquisición del fenotipo epidermal y para regular
la expresión del canal de sodio dependiente de potencial eléctrico Nav1.2. Junto
con esto, se muestra evidencia que indica que durante la diferenciación de las
neuronas espinales primarias XREST/NRSF modula la expresión de la corriente
de sodio dependiente de potencial eléctrico.
97

1. XREST/NRSF regula la expresión de los genes neuronales
estructurales durante la neurogénesis de Xenopus laevis.
Al reevaluar los efectos de la interferencia de la función de XREST/NRSF
desde etapas tempranas del desarrollo embrionario, observamos la inhibición
de la expresión de N-tubulin, SCG10 y NaV1.2 en embriones de néurula tardía,
lo que confirma los resultados reportados por Armisen et al., (2002). Sin
embargo, los cortes transversales de embriones en estadio de néurula y el
análisis morfológico de embriones completos en estadio de organogénesis
tardía revelaron que parte del efecto observado desde vistas dorsales es debido
a malformaciones del tubo neural, las cuales enmascaran la expresión
disminuida de N-tubulin, SCG10 y XNaV1.2. Junto con esto, los embriones con
interferencia de la función de XREST/NRSF desde la gástrula tardía presentan
disminución de la penetrancia y expresividad del fenotipo observado. Estos
datos sugieren que la inhibición de la expresión de los genes neuronales
estructurales en el tejido neural es un fenómeno que podría ser debido a
múltiples defectos asociados a la interferencia de XREST/NRSF durante el
desarrollo más temprano, al menos desde el proceso de inducción neural.
Para poner a prueba estos razonamientos analizamos si los fenotipos
observados en etapa de néurula tardía, cuando ya se ha formado el tubo neural,
se reproducían en estadio de néurula temprana, donde la placa neural aun está
desplegada y los dominios neurogénicos son facilmente distinguibles.
Observamos que la disminución de la función de XREST/NRSF resulta en la
inhibición de la expresión de N-tubulin en los dominios neurogénicos posteriores
y en la placoda trigeminal, lo que indica que el fenotipo observado en los
embriones de estadio de néurula tardía no sólo es producto de los defectos
morfológicos del tubo neural o de una alteración en la mantención de la
expresión de estos genes.
Al analizar la expresión de NaV1.2 observamos expresión ectópica y
prematura de su transcrito, un efecto en sentido opuesto al de N-tubulin. Este
dato se ajusta al modelo clásico de la función de REST/NRSF como un represor
98

de la transcripción de genes neuronales estructurales en tejido no neural
indiferenciado y en precursores neurales, y es concordante con la presencia del
mRNA de XREST/NRSF en el ectodermo neural durante las primeras etapas de
la neurogénesis, el cual disminuye su expresión en este territorio hacia etapas
más tardías.
Aunque este efecto es transiente, ya que en estadios posteriores el
efecto de la interferencia de la función de XREST/NRSF para N-tubulin y
NaV1.2 es semejante, es compatible con los datos que indican que al menos
durante la néurula temprana XREST/NRSF es necesario para controlar la
expresión de NaV1.2 en el ectodermo neural y no neural. Junto con esto, los
resultados muestran que el control de la expresión de diferentes genes
neuronales es dependiente de mecanismos regulatorios específicos para cada
uno de ellos, que son dependientes de la etapa del desarrollo y del contexto
celular, pero que también comparten el control impuesto por los genes
proneurales y neurogénicos en los dominios proneurales. Si bien aun no se ha
determinado si NaV1.2 de Xenopus posee un RE-1/NRSE, la naturaleza del
fenotipo observado junto con el patrón de expresión de XREST/NRSF, son
compatibles con la idea de que NaV1.2 es regulado directamente por
XREST/NRSF, tal como ha sido probado en fibroblastos de rata (Lunyak et al.,
2002) (Figura 29). Sin embargo, este resultado se contrapone a los
antecedentes en ESCs donde la expresión de un dominante negativo de
REST/NRSF, análogo al utilizado en Xenopus, induce la expresión prematura
de BDNF, Calbindina y Sinaptotagmina, pero no la de NaV1.2 (Ballas et al.,
2005), lo que sugiere que la regulación de la expresión de los genes neuronales
es diferente en ambos modelos de estudio.
99

100
2. La interferencia de la función de XREST/NRSF perturba el
establecimiento de los dominios neurogénicos.
La expresión de los genes neuronales estructurales es regulada
positivamente por los genes proneurales, los cuales definen los dominios del
neuroectodermo donde la neurogénesis toma lugar (revisado en Chitnis, 1999).
Nuestros resultados muestran que la interferencia de la función de
XREST/NRSF inhibe la expresión de X-ngnr-1, gen que determina el destino
neuronal (Ma et al., 1996), lo que sugiere que la disminución de la expresión de
los genes neuronales estructurales es producto de la alteración del programa
neurogénico. Además de promover la expresión de los genes neuronales la
actividad de X-ngnr-1 induce la expresión de X-Delta-1, el cual activa a Notch
en las células vecinas (Ma et al., 1996; Chitnis y Kintner, 1996). La señalización
de Notch induce la expresión de los genes Hes, Her y Esr, los cuales inhiben la
expresión de los genes proneurales (Chen et al., 1997; Ohsako et al., 1994; Van
Doren et al., 1994). Nuestro análisis muestra que al interferir con la función de
XREST/NRSF la expresión de X-Delta-1 es disminuida, lo que es compatible
con la inhibición de X-ngnr-1 y sugiere que el mecanismo de inhibición lateral no
estaría sobreactivado por una mayor disponibilidad de X-Delta-1. Junto con
ésto, la expresión de XHes-1 también se observó disminuida, lo que confirma
que la inhibición de X-ngnr-1 no es producto de la activación de la señalización
de Notch. Estas observaciones indican que la perturbación del programa
neurogénico en los embriones con pérdida de función de XREST/NRSF ocurre
a través de un mecanismo independiente de la inhibición lateral.
Zic2 se expresa en los dominios interneurogénicos y regula
negativamente la expresión y la actividad proneural de X-ngnr-1 (Brewster et al.,
1998). Nuestros resultados muestran que la interferencia de la función de
XREST/NRSF se asocia a la expansión de Zic2 hacia dorsal y ventral, lo que
sugiere que la actividad de este gen podría estar regulando negativamente la
neurogénesis a través de la inhibición del establecimiento de los dominios
neurogénicos. Sin embargo, observamos que los embriones con interferencia

101
de la función de XREST/NRSF desde la blástula temprana, además de
presentar inhibición de los genes neuronales estructurales y proneurales,
presentan desplazamiento lateral de sus dominios de expresión, lo que sugiere
que la expansión de Zic2 es un efecto secundario a una alteración generalizada
del patrón dorsoventral del ectodermo. Zic2 es activado por la vía de
señalización de Shh, y el aumento de la actividad de esta vía conduce a la
expansión del tejido neural (Franco et al., 1999; Brewster et al., 1998). Por otra
parte, RA regula negativamente la expresión de Shh y Zic2 durante la
neurogénesis (Franco et al., 1999; Sharpe y Goldstone, 2000), el tratamiento de
células troncales embrionarias con RA conduce a su diferenciación y la
regulación negativa a nivel postraduccional de REST/NRSF en el paso de
progenitor neural a neurona madura, junto con esto, se ha determinado que en
estas neuronas el complejo represor asociado al receptor de ácido retinoico se
encuentra unido al promotor de REST/NRSF donde reprimiría su transcripción
(Ballas et al., 2005). Estos antecedentes sugieren que XREST/NRSF podría
estar interactuando con estas vías de señalización, sin embargo aún no se han
analizado estas interacciones.
3. XREST/NRSF participa en el establecimiento del patrón
dorsoventral del ectodermo.
El patrón dorsoventral del ectodermo de Xenopus y Danio rerio es
establecido principalmente por la señalización en gradiente de BMP (Wilson et
al., 1997; Barth et al., 1999). Una alta senãlización de BMP induce el destino
epidérmico, una muy baja se asocia a la adquisición del destino neural y una
intermedia a los destinos celulares derivados del borde, tales como las crestas
neurales y las placodas sensoriales (revisado en Aybar y Mayor, 2002). La
señalización de BMP en el ectodermo ventral activa la expresión de genes con
actividad epidermalizante y/o que participan en la inducción de las crestas
neurales, como es el caso de msx-1 (Suzuki et al., 1997). Mientras que en la
región dorsal del ectodermo la señalización disminuida de BMP junto con la

102
actividad de Wnt y FGF inducen el tejido neural y contribuyen a la inducción de
los tejidos del borde a través de mecanismos que incluyen la activación de
genes con actividad neuralizante tales como los genes de la familia Sox
(revisado en Stern, 2005).
Con estos antecedentes analizamos los efectos de la interferencia y
ganancia de función de XREST/NRSF en el establecimiento del patrón
dorsoventral del ectodermo. Nuestros resultados muestran que la interferencia
de función de XREST/NRSF resulta en la expansión de genes con actividad
neuralizante sobre la región borde de la placa neural. De manera
complementaria observamos desplazamiento lateral y disminución de la
expresión de queratina epidermal y de los mensajeros de msx-1 y Slug, los
cuales se expresan en la región borde en estadio de néurula temprana y
participan activamente en la inducción primaria de las crestas neurales (Mayor
et al., 1995; Tribulo et al., 2004). Concordante con esto, recientemente hemos
determinado que la inhibición de la función de REST/NRSF en el pez cebra
resulta en defectos del desarrollo de la placoda de la línea lateral posterior al
igual que en Xenopus donde también se observaron defectos en ésta y otras
placodas sensoriales (Sarrazin y Olguin, datos no publicados, Figura 27). Estos
datos en conjunto indican que REST/NRSF es necesario para la formación del
patrón dorsoventral del ectodermo de Xenopus y aparentemente del pez cebra.

103
Figura 27. Análisis de la expresión de
marcadores moleculares de placodas en
embriones de Danio rerio y Xenopus
laevis con pérdida de función de REST.
A) Presencia del transcrito del marcador de
placodas eya1 en un embrión control en
estadio de 15 somitos. B) La expresión de
dnZREST resulta en la disminución de la
expresión de eya1 en la placoda que da
origen a la línea lateral posterior. (flecha
negra). El asterisco negro indica la posición
de la placoda ótica. C-H) La expresión de
dnXREST desde la néurula temprana
conduce a la desorganización de las
placodas de Xenopus laevis y a la
disminución de la expresión de X-ngnr-1 y
X-delta-1. Vistas laterales de la región
anterior de embriones de estadío 30-32
inyectados unilateralmente en estadio de
dos células con dnXREST. C, E, G) Lado
no inyectado (nis). D, F, H) Lado inyectado
(is dnXREST), notese la marca del trazador
de linaje (LacZ). Asterisco, vesícula ótica;
ePVII, placoda epibranquial facial; ePIX,
placoda epibranquial glosofaringea; ePX1,
primera placoda epibranquial vagal; pAD,
placoda de la línea lateral anterodorsal; pM,
placoda de la línea lateral media; pP,
placoda de la línea lateral posterior.
Es importante destacar que no se ha descrito esta función de
REST/NRSF en otras especies. Los embriones de ratón con una deleción nula
de REST/NRSF presentan letalidad en estadios tempranos y no se han
analizado en estadios embrionarios previos a que el organismo presente
malformaciones morfológicas difíciles de interpretar o claros signos de
desorganización y muerte celular (Chen et al., 1996). Los otros estudios in vivo
se han preocupado de develar la participación de REST/NRSF en la regulación
de la expresión de los genes neuronales en tejido neuronal y no neuronal y el
mecanismo molecular asociado (Paquette et al., 1998, Lunyak et al., 2002). La
interferencia de la función de REST/NRSF en Xenopus y pez cebra no causaron

104
letalidad, probablemente porque las estrategias experimentales utilizadas sólo
resultan en la disminución de los niveles de la proteína o de la función de ésta
en el tejido al que da origen región inyectada y no en la ausencia total de la
proteína en todo el organismo como en el caso de una mutación nula.
La sobreexpresión de XREST/NRSF o zREST/NRSF no resultó en
defectos aparentes en la formación del patrón dorsoventral ni en la expresión de
los genes neuronales estructurales (datos no mostrados). Esto podría
explicarse por la disponibilidad de corepresores en los distintos tejidos, o bien
porque el estado de la cromatina en tejidos donde XREST/NRSF ha dejado de
expresarse durante el desarrollo no es susceptible de ser regulada por
XREST/NRSF. Por otra parte, se ha descrito que durante el tránsito de las
células troncales embrionarias a progenitores neurales, REST/NRSF es
regulado negativamente a nivel postraduccional via proteosoma (Ballas et al.,
2005) lo que podría enmascarar los efectos potenciales de la sobreexpresión
del mRNA de XREST/NRSF en el ectodermo neural.
La activación de dnXREST en la gástrula tardía resulta en fenotipos de
menor expresividad y penetrancia, lo que sugiere que una vez que las células
del ectodermo han sido determinadas a adoptar un destino específico, la
inhibición de la función de XREST/NRSF no perturba la adquisición del destino
celular. A nivel molecular este resultado es concordante con los datos que
muestran que en células no neuronales diferenciadas REST/NRSF en conjunto
con la metilación del DNA recluta maquinaria silenciadora que conduce a la
condensación de la cromatina blanco restándole competencia a estas células
de ser reguladas por REST/NRSF una vez que se han diferenciado (Lunyak et
al., 2002). Si bien se ha demostrado que la inhibición de REST/NRSF en
somitos de embriones de pollo resulta en la expresión ectópica de algunos
marcadores neuronales aun no se ha probado si estas células adquieren el
destino neuronal (Chen et al., 1998).

105
Junto con la expansión del territorio neural y el desplazamiento ventral de
los marcadores del borde, la interferencia de la función de XREST/NRSF desde
la blástula tardía resulta en una fuerte disminución de la expresión de msx-1 y
Slug cuando el marcador de linaje se encuentra justo sobre la región borde, no
así o en menor intensidad cuando dnXREST es activado en la gástrula tardía,
una vez ya iniciado el proceso de inducción primaria de las crestas neurales
(Aybar y Mayor, 2002). Estos datos que sugieren que XREST/NRSF es
necesario para la inducción de las crestas neurales probablemente a través de
un mecanismo autónomo celular. Por ejemplo, la disminución de la función de
XREST/NRSF podría hacer a las células del pliegue neural refractarias a la
señalización de BMP, el cual sería necesario en una concentración crítica para
inducir msx-1 en el borde y así gatillar la inducción de las crestas neurales
(Tríbulo et al., 2004). Si bien msx-1 se encuentra rio arriba en la cascada de
inducción de las crestas neurales, no se han analizado otros marcadores
tempranos del borde de la placa que responden a BMP tales como Dlx-3 y Dlx-
5, los cuales son necesarios para la inducción de las crestas neurales (Luo et
al., 2001; Woda et al., 2003; McLarren et al., 2003).
4. XREST/NRSF participa en el establecimiento del patrón
dorsoventral del ectodermo a través de la modulación de la señalización
de BMP.
Los efectos asociados a la interferencia de la función de XREST/NRSF,
tales como la inhibición de la expresión de los genes neuronales y la expansión
de la placa neural son semejantes a los fenotipos asociados a la inhibición de la
señalización de BMP en Xenopus y el pez cebra (Wawersik et al., 2005; Barth
et al., 1999). La interferencia de la función de XREST/NRSF en el ectodermo
ventral de embriones completos o en explantes animales resulta en la pérdida
de expresión de queratina epidermal colocalizada con el marcador de linaje, lo
que indica que la función de XREST/NRSF es necesaria para la adquisición del
destino epidermal. De manera complementaria, la interferencia de la función de

106
XREST/NRSF neuraliza los explantes animales, pero no el ectodermo ventral
de embriones completos. Estos resultados son similares a los datos que
muestran que la disminución de la señalización de BMP inhibe la expresión de
queratina epidermal pero no induce la expresión de marcadores neurales en el
ectodermo ventral a menos que se active la vía de señalización de FGF
(Delaune et al., 2005). De acuerdo con estos resultados, determinamos que la
activación de dnXREST en explantes animales resulta en la disminución de la
expresión vent2 y msx-1, los cuales son directamente regulados por la vía de
señalización de BMP, sin embargo, no observamos disminución de los niveles
del mensajero de Bmp4 (datos no mostrados). Finalmente, mostramos que la
interferencia de la función de dnXREST revierte la contracción de la placa
neural asociada a la sobreexpresión de Bmp4, sin embargo, la sobreexpresión
de Bmp4 no revierte la inhibición de la expresión de queratina epidermal de los
embriones con función disminuida de XREST/NRSF. Estos resultados en
conjunto sugieren que XREST/NRSF modula positivamente la señalización de
BMP, aparentemente a través del control de su actividad y no de la regulación
de la expresión de Bmp4.
La actividad de la vía de señalización de BMP puede ser regulada en
diferentes niveles a través de múltiples mecanismos (Figura 28). En el espacio
extracelular, Noggin, Chordin, Follistatin, Cerberus y Xnr3 antagonizan la
señalización de BMP uniendo a las BMPs antes de ligar al receptor o
compitiendo por la unión a éste (Harland, 2000). Río abajo de la unión del
ligando, BAMBI, un pseudoreceptor de BMP, inhibe la activación del receptor de
tipo I (Onichtchouk et al., 1999). La activación de la vía conduce a la
fosforilación de las proteínas Smads reguladas por receptor (rSmads,
Smad1/5). Una vez activadas, las rSmads forman un complejo con Smad4/10
(coSmads) el cual es translocado al núcleo donde activa la expresión de los
genes blanco. En el citosol, las proteínas Smads inhibitorias (iSmads, Smad6/7)
regulan negativamente la vía: Smad6 compite con Smad4 por la unión a Smad1
fosforilada, mientras que Smad7 inhibiría la fosforilación de Smad1. Junto con

107
esto Smurf1, una ubiquitin-ligasa, promueve la degradación de Smad1/5 y del
receptor de BMP de tipo I a través de su interacción con las iSmads (Muñoz-
Sanjuán y Brivanlou, 2002; Zhu et al., 1999; Murakami et al., 2003). Finalmente,
en el núcleo la señalización de BMP puede ser inhibida por la actividad de los
complejos represores reclutados por la oncoproteína Ski (Wang et al., 2000).
Nuestros resultados muestran que la interferencia de la función de
XREST/NRSF no conduce a la expresión ectópica de chordin en el ectodermo
ni a la formación de dobles ejes cuando la inyección de dnXREST es dirigida al
mesodermo ventral (no mostrado), lo que sugiere que XREST/NRSF modula la
vía de señalización río abajo de la acción de los inductores neurales
especificamente en el ectodermo. A partir de nuestros datos y estos
antecedentes, hipotetizamos que uno o varios de los genes que codifican para
estas proteínas inhibitorias podrían ser regulados negativamente por
XREST/NRSF en el ectodermo durante el desarrollo. Resultados recientes de
nuestro laboratorio muestran que la abundancia relativa de los mensajeros de
Smad6, Smad7 y Smurf1 no aumentan en explantes animales con pérdida de
función de XREST/NRSF (datos no mostrados) ni tampoco disminuyen como
msx-1 o vent-2. Smad6 y Smad7 son regulados positivamente por la señal de
BMP (Karaulanov et al., 2004) por lo que una mantención del nivel de expresión
en embriones con pérdida de función de XREST/NRSF podría ser interpretada
como un aumento con respecto a los otros genes que responden a BMP y de
esta manera dar cuenta de la disminución de la actividad de la vía. Otro
mecanismo de regulación de la actividad de la vía de BMP es a través de su
interacción con la vía de las proteínas quinasas activadas por mitógenos
(MAPKs). La activación de esta vía de señalización por factores de crecimiento
tales como FGF o IGF conduce a la fosforilación de la región linker de Smad1
(Pera et al., 2003). Lo que se ha asociado a la inhibición de la acumulación
nuclear de Smad1 en cultivos celulares tratados con EGF o HGF (Kretzschmar
et al., 1997; Massagué, 2003). La sobreexpresión de Smad1 en embriones de
Xenopus ventraliza discretamente, sin embargo al sobreexpresar una forma

108
mutada en los dominios de fosforilación de la región linker se obtienen fenotipos
fuertemente ventralizados (Pera et al., 2003, Sater et al., 2003). Estos datos
indican que la vía de las MAPKs esta presente en el embrión y regula la
actividad de la vía de BMP inhibiendo la traslocación de Smad1 al núcleo
(Figura 28). Nuestros resultados muestran que la interferencia de la función de
XREST/NRSF inhibe la expresión de queratina epidermal de manera semejante
que al inhibir la señalización de BMP, pero no induce la expresión de
marcadores neurales, como ocurre al activar la vía de las MAPKs e inhibir BMP
(Delaune et al., 2005). Lo que sugiere que la aparente inhibición de la vía de
BMP en embriones con pérdida de función de XREST/NRSF no ocurre a través
de la activación de la vía de señalización de las MAPKs. Sin embargo, es
necesario estudiar con mayor detalle la activación de la via de señalización de
BMP en diferentes niveles para determinar qué mecanismos inhibitorios podrían
ser modulados por XREST/NRSF.

109
Figura 28. Esquema simplificado de los mecanismos de antagonismo intracelular
de la vía de señalización de BMP. BMP (rojo) une al receptor de tipo II y I. La
actividad del receptor de tipo I propaga la señal hacia el citosol a través de la
fosforilación de las rSmads. BAMBI inhibe la activación del receptor de BMP de tipo I
actuando como un dominante negativo del receptor de tipo II. Las rSmads en ausencia
de señalización de BMP son inducidas a su degradación a través de la interacción con
Smurf 1. En presencia de la señal de BMP, Smurf interctúa con las iSmads para inducir
la degradación del receptor de tipo I y de las rSmads. Las iSmads, Smad6 y 7, pueden
inhibir la interacción de las rSmads con el complejo receptor o inhibir la interacción de
las rSmads con las coSmads en el caso de Smad6. La actividad de la vía de las
MAPKs, iducida por ejemplo por FGF u otros factores de crecimiento, conduce a la
fosforilación la región linker de las rSmads inhibiendo su acumulación nuclear. Una vez
en el núcleo el complejo rSmad-coSmad puede interactuar con represores de la
transcripción como Ski e inhibir la transcripción de los genes blanco.

110
5. XREST/NRSF modula la adquisición de la corriente de sodio
dependiente de potencial eléctrico en neuronas espinales de Xenopus.
Durante su diferenciación, las neuronas primarias espinales de Xenopus
transitan de un estado electricamente silente a uno activo (Spitzer y
Lamborghini, 1976). Esta característica propia de las células excitables, es
determinada por la expresión de canales de iones, los cuales en el caso de las
neuronas, confieren la capacidad de disparar potenciales de acción y así
conducir el impulso nervioso. La fase de ascención rápida del potencial de
acción es determinada por la apertura de la conductancia de sodio, que en
neuronas ocurre a través de los canales de sodio dependientes de potencial
eléctrico. Previamente en nuestro laboratorio se aisló parte de la secuencia
nucleotídica de la subunidad α del canal de sodio dependiente de potencial
eléctrico y de expresión neuronal NaV1.2 (Armisen et al., 2002). El transcrito de
NaV1.2 es detectado desde estadio de néurula media (14- 15) en los dominios
neurogénicos de la placa neural de Xenopus, precediendo al inicio de la
expresión de la corriente de sodio, la cual es detectada dos horas después en
cultivos primarios de células del neuroepitelio (Olson., 1996). En embriones de
rata los transcritos de NaV1.2 y 1.3 son recién detectados en estadio
embrionario 12, tardiamente en la diferenciación neuronal (Goldin et al., 1992;
Mandel et al., 1992). En embriones de Xenopus la densidad de corriente de
sodio de las neuronas espinales aumenta dos veces de 6 (estadio 18) a 29
horas en cultivo (estadio 30 o de organogénesis tardía) (O’Dowd et al., 1988).
Este fenómeno podría ser producto de un incremento del número de canales,
de la conductancia de los canales unitarios y/o de la probabilidad de apertura,
sin embargo, se ha descrito que existe una relación directa entre los niveles de
transcrito y la expresión funcional de los canales de sodio (Catterall, 1992), lo
que sugiere que el aumento de la densidad es producto de un incremento del
número de canales. En células no-neuronales diferenciadas la expresión de
Nav1.2 y NaV1.3 es regulada negativamente por REST/NRSF (Chong et al.,
1995; Lunyak et al., 2002), sin embargo no existen antecedentes acerca de la

111
regulación de NaV1.2 en neuronas posmitóticas en diferenciación.
XREST/NRSF se expresa en neuronas espinales aisladas de Xenopus en bajos
niveles (Armisen et al., 2002) por lo que en esta tesis pusimos a prueba la idea
de que XREST/NRSF controla los niveles de expresión de la corriente de sodio
durante la diferenciación neuronal terminal. Las neuronas con pérdida de
función de XREST/NRSF desde estadio 15 presentaron en etapa de
organogénesis temprana un aumento significativo de la densidad de corriente
de sodio en comparación a las neuronas no tratadas. Ésto indica que en las
neuronas espinales en desarrollo XREST/NRSF modula la adquisición de la
corriente de sodio. Este resultado junto con los datos que muestran que la
interferencia de la función de XREST/NRSF durante la néurula temprana
conduce a la expresión ectópica y prematura de Nav1.2 en el ectodermo, son
compatibles con la hipótesis de que la regulación de la corriente de sodio
mediada por XREST/NRSF en neuronas posmitóticas es un efecto de la
regulación transcripcional de NaV1.2. A partir de estos resultados en conjunto
con la evidencia que indica que la expresión de REST/NRSF es regulada
negativamente a nivel postraduccional durante el tránsito de progenitor neural a
neurona diferenciada y a nivel transcripcional en neuronas diferenciación
(Ballas et al., 2005), se propone un modelo de regulación de la expresión de
NaV1.2 durante el desarrollo de Xenopus (Figura 29). En la néurula temprana
(estadio 13-14) la expresión de XNaV1.2 es inhibida por la actividad de
XREST/NRSF tanto en el ectodermo neural como en el no neural. Durante este
período la expresión de XREST/NRSF disminuye en el neuroepitelio. Luego en
la néurula media, XNaV1.2 se expresa en los dominios neurogénicos,
probablemente producto de la actividad de los genes proneurales y sus
efectores. En esta etapa XREST/NRSF aun se expresa en estas células en
bajos niveles y funcionaría modulando la expresión de XNaV1.2 en las
neuronas espinales durante la diferenciación neuronal. Finalmente la actividad y
expresión de XREST/NRSF es disminuida en las neuronas, restringiéndose al
tejido muscular, y la expresión de XNaV1.2 es lo suficientemente alta para dar

112
cuenta de un potencial de acción maduro y de la respuesta de escape del
renacuajo temprano (Figura 29).
Figura 29. Modelo de la regulación de la expresión de NaV1.2 durante la
neurogénesis de Xenopus laevis. Arriba se muestra una caracterización del patrón
de expresión de NaV1.2 (rojo), XREST/NRSF (azul) y de los dominios proneurales
(amarillo) durante el desarrollo embrionario de Xenopus. Sobre y bajo las flechas se
indica el aumento y la disminución de la expresión de NaV1.2 (rojo), XREST/NRSF
(azul), respectivamente. En estadio 13 la actividad de los genes proneurales (PNr,
amarillo) no es suficiente para activar la la expresión NaV1.2 (rojo) a niveles
detectables por hibridación in situ, la cual es inhibida por XREST/NRSF (azul) en todo
el ectodermo. En estadio 15 la expresión de XREST/NRSF (azul) disminuye en el
ectodermo neural permitiendo la expresión de NaV1.2 (rojo) en los dominios
neurogénicos (amarillo). Sin embargo, los niveles de actividad de XREST/NRSF
modula el incremento de la expresión de XNaV1.2 (rojo) en las neuronas espinales
desde la néurula temprana (st. 15) hasta la organogénesis (st. 27), estadio en el cual la
expresión de XREST/NRSF se restringe a los somitos.

113
6. Función de XCoREST en el la especificación del neuroectodermo de
Xenopus.
REST/NRSF reprime o silencia la expresión de sus genes blanco a
través en un mecanismo dependiente de la interacción de su dominio carboxilo
terminal con CoREST (Andrés et al., 1999). El complejo REST/NRSF-CoREST
recluta desacetilasas de histona 1 y 2 (HDAC1 y 2), el complejo remodelador de
la cromatina hSWI-SNF y maquinaria silenciadora de largo plazo a los RE-1 de
sus genes blanco (Ballas et al., 2001; Battaglioli et al., 2002; Lunyak et al.,
2002). En embriones de Xenopus de estadio 13 el transcrito de XCoREST es
detectado mediante hibridación in situ en el ectodermo como dos bandas
longitudinales a cada lado de la línea media (de la Calle-Mustienes et al., 2002).
El dominio más lateral parece corresponder al dominio de más alta expresión de
XREST/NRSF en el borde de la placa neural. La disminución de los niveles de
XCoREST en el neuroectodermo, mediante la inyección de MoXCoREST,
resulta en una discreta expansión de la placa neural sobre el límite con el
ectodermo no neural de una manera similar a lo que ocurre con la disminución
de los niveles de XREST/NRSF en este territorio. Junto con esto y a diferencia
del fenotipo asociado a la interferencia de la función de XREST/NRSF, las
células con niveles disminuidos de XCoREST muestran disminución de la
expresión del marcador neural Sox2 y no de los marcadores de crestas
neurales Slug y msx-1. La disminución de los niveles de XREST/NRSF y de
XCoREST en conjunto, resultan en un aumento del grado de expansión de la
placa neural y aparentemente en la inhibición total de la expresión de Sox2. Sin
embargo, no se observó disminución de la expresión de los marcadores de
crestas neurales. Estos resultados indican que XREST/NRSF interactúa
geneticamente con XCoREST en el establecimiento de la placa neural, lo que
sugiere que la participación de XREST/NRSF en este proceso es dependiente
de su interacción con XCoREST. Sin embargo, la participación de
XREST/NRSF en la especificación de las crestas neurales parece no requerir
de la actividad de XCoREST, lo que es coincidente con su expresión restringida

114
al neuroectodermo. La inhibición de la expresión del marcador neural Sox2
sugiere que XCoREST participa en la especificación del neuroectodermo. Sox2
participa en la mantención de los progenitores neurales (Mizuseki et al., 1998),
por lo que una inhibición de su expresión podría estar asociada a la
diferenciación prematura de las células del neuroectodermo, sin embargo aún
no se ha analizado el destino que adoptan estas células. El aumento de la
expresividad de este fenotipo en los embriones con disminución de los niveles
de XREST/NRSF y XCoREST sugieren que ambas proteínas son necesarias
para la mantención de los progenitores neurales. El hecho de que este fenotipo
no se observe al sólo interferir con la función de XREST/NRSF sugiere que
XCoREST podría estar funcionando independientemente de XREST/NRSF. Se
ha descrito que CoREST puede ser reclutado a los RE-1/NRSE
independientemente de su unión a REST/NRSF a través de MeCP2 (Ballas et
al., 2005) o a otras regiones genómicas formando complejos con HDAC1 y 2 y
con el factor transcripcional de dedos de zinc ZNF217 (You et al., 2001).

CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
115
Nuestros resultados en conjunto muestran que la función de
XREST/NRSF durante el desarrollo embrionario va más allá de la regulación de
los genes neuronales estructurales en células no neuronales. La interferencia
de la función de XREST/NRSF utilizando dos estrategias experimentales
diferentes conduce a la alteración del establecimiento del tejido neural y en
general del patrón dorsoventral del ectodermo y no a la desrepresión masiva de
los genes blanco descritos, lo que está acuerdo con los estudios de ratones con
una deleción nula de REST/NRSF (Chen et al., 1998). La actividad de
XREST/NRSF es necesaria para la adquisición de los destinos epidermal y de
cresta neural, lo que indica que XREST/NRSF no sólo participa en la
adquisición de los destinos ectodérmicos no neurales de manera pasiva, es
decir regulando negativamente la expresión de los genes neuronales
estructurales, sino que también participa como un factor permisivo de los
procesos inductivos de estos tejidos aparentemente modulando la vía de
señalización de BMP de manera autónoma celular.
Por otra parte observamos que XREST/NRSF es necesario para inhibir la
expresión del canal de sodio dependiente de potencial eléctrico NaV1.2 en las
células del ectodermo que aún no alcanzan su destino final. Una vez que estas
células se comprometen con su destino, como es el caso de la epidermis,
XREST/NRSF parece no ser necesario para regular la expresión de NaV1.2,
mientras que en neuronas en diferenciación los niveles mínimos de
XREST/NRSF parecen modular el aumento progresivo de la expresión de
NaV1.2.
Junto con esto, mostramos evidencia preliminar e indirecta que indica
que la participación de XREST/NRSF en el establecimiento de la placa neural
ocurre a través de la interacción con XCoREST, que su función en la
especificación de las crestas neurales es independiente de esta interacción y
que XCoREST participaría en la especificación del ectodermo neural. Sin

116
embargo, estos resultados deben ser confirmados, por ejemplo, a través de la
expresión de dominantes negativos de XCoREST y de la expresión de una
forma trunca en el carboxilo terminal de XREST/NRSF.
Si bien casi todos los fenotipos asociados a la pérdida de función de
XREST/NRSF parecen estar relacionados con su participación en la formación
del patrón dorsoventral del embrión a través de la modulación de la vía de BMP,
aún es necesario determinar cual es el mecanismo molecular a través del cual
esto ocurre y si XREST/NRSF interactúa con otras vías de señalización. Por
ejemplo, se ha descrito que REST/NRSF es regulado positivamente por la vía
de Wnt canónica en células de carcinoma embrionario de humano y en la región
ventricular del tubo neural de embriones de pollo (Willert et al., 2002; Nishihara
et al., 2003). En progenitores neurales de ratón acido retinoico (RA) induce la
degradación de REST/NRSF, y en neuronas posmitóticas la actividad del
complejo represor asociado al receptor de ácido retinoico (RAR), el cual
funciona en ausencia de RA e incluye a CoREST y Sin3a, reprime la expresión
de XREST/NRSF (Ballas et al., 2005). Con estos antecedentes es posible
diseñar experimentos que permitan determinar en que etapa del desarrollo y en
que tejidos estas señales regularían la expresión de XREST/NRSF.
Finalmente, el estudio de los mecanismos moleculares asociados a la
función de REST/NRSF en el desarrollo embrionario hace necesario conocer
los genes regulados directamente por este factor transcripcional. La utilización
de modelos animales de secuencia genómica conocida como el pez cebra
permiten conocer las unidades transcripcionales que poseen un RE-1/NRSE en
su región reguladora y así determinar si REST/NRSF se encuentra asociado a
estas secuencias en etapas particulares del desarrollo y tejidos específicos.
Estudios preliminares muestran que parte de las funciones de XREST/NRSF
observadas en Xenopus se conservan en el pez cebra, lo que hace de este
modelo una herramienta fundamental para el estudio de la función de
REST/NRSF durante el desarrollo embrionario de los vertebrados.

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