Participación del Factor Silenciador Neuronal Restrictivo - Tesis ...

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Los datos obtenidos a través del uso de transgénicos indican que: 1) la mutación en el RE-1/NRSE de diversos genes neuronales no es suficiente para activar su expresión en todos los tejidos no neuronales, 2) RE-1/NRSE es necesario para regular la expresion basal de genes neuronales en el sistema nervioso central y 3) RE-1/NRSE no sólo funciona como un silenciador de ciertos genes neuronales (L1 y β2nAChR) en tejido no neural durante el desarrollo temprano, sino que también puede funcionar como un enhancer de la expresión de estos genes en el sistema nervioso de animales en estadios postnatales y adultos. Los resultados contrapuestos de estos análisis son compatibles con otros estudios que han sugerido que la contribución relativa de REST/NRSF a la regulación transcripcional de un gen reportero en particular, depende de otros elementos reguladores presentes en su promotor además de RE-1/NRSE (Mieda y cols., 1997; Lonnerberg y cols., 1996) y también del contexto celular, lo que explicaría una regulación diferencial para diferentes genes en el mismo tejido. Sin embargo, este tipo de aproximación experimental no permite analizar los efectos de la pérdida de función de REST/NRSF en el control de la expresión de múltiples genes endógenos en su contexto cromosómico normal, ni tampoco analizar su efecto en el desarrollo embrionario. De esta manera, el diseño de estrategias que permitan obtener pérdida de función de REST/NRSF in vivo, es fundamental para determinar su papel funcional en el desarrollo neural. 4.3.2 Estudios de pérdida y ganancia de función de REST/NRSF durante el desarrollo embrionario. En ratón REST/NRSF se expresa de manera ubicua en estadio E8.5 y E9.5. Ratones homocigotos para una mutación nula (knock-out) mueren (100% penetrancia) en el dia embrionario (E) 11.5, mientras que los ratones heterocigotos son aparentemente normales. Hasta E9.25 (20 somitos) no se observan diferencias morfológicas entre los homocigotos y sus hermanos 39
silvestres. Sin embargo, en estadio 9.5 (25 somitos) cerca del 80% de los embriones mutantes son más pequeños y presentan vesículas telencefálicas malformadas, en estadio E10.5 todos presentan retardo del crecimiento. El análisis histológico en embriones de estadio E9.25-9.5 reveló desorganización celular en el mesénquima de la cabeza, en somitos y en el miotomo, el cual se encuentra separado del dermomiotomo. Junto con estos defectos, la letalidad embrionaria es precedida por muerte celular (apoptosis) desde E 9.5-10. El análisis de la expresión de genes neuronales indica un aumento de la expresión de βIII-tubulin (tubulina neuronal) en regiones de expresión transiente normotópica tales como el miotomo, ectodermo de las extremidades y en la región que rodea las placodas olfatorias. Se observa expresión ectópica en el ectodermo de la cabeza al nivel del cerebro profundo y en el epicardio. Sin embargo, otros genes que contienen el RE-1/NRSE en su promotor, tales como SCG10, synapsin, calbindin y NFM no son desreprimidos, resultado que es compatible con los descritos usando animales transgénicos. No se observa expresión prematura en el sistema nervioso central. La muerte de los embriones knock-out para REST/NRSF no permiten discriminar con certeza si los efectos observados durante la neurogénesis son en parte producto de los defectos en el desarrollo temprano (Chen et al., 1998). Una aproximación alternativa es el estudio de la función de REST/NRSF en otros modelos. En pollo y Xenopus se ha interferido con la función de REST/NRSF mediante la expresión de una forma dominante negativa que consiste sólo del dominio de unión a DNA (REST-DBD) (Chen et al., 1998; Armisen et al., 2002). La expresión de REST-DBD en somitos de pollo conduce a diferentes patrones de desrepresión de βIII-tubulin, NgCAM y SCG10 (Chen et al., 1998). La expresión de REST-DBD en el tubo neural causa la expresión prematura de genes neuronales estructurales blancos de RESTNRSF tales como SCG10 y NgCAM. Complementariamente, la expresión constitutiva de la isoforma murina en neuronas de embriones de pollo se asocia a la represión de tubulina neuronal y NgCAM y a defectos en la navegación axonal, sin embargo, 40
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