Participación del Factor Silenciador Neuronal Restrictivo - Tesis ...

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MATERIALES Y MÉTODOS Materiales Animales - Se mantuvo un vivero con Xenopus laevis silvestres adultos, hembras y machos, alimentados con corazón de vacuno tres veces por semana y con un ciclo luz-oscuridad de 12 horas. Reactivos para la obtención y mantención de embriones y explantes animales: -Cisteína (Merck, Darmstadt, Alemania). -Ficoll (Polisacarosa 400, Calbiochem, La Jolla, CA, EE.UU.). -Hormona Gonadotrofina Coriónica Humana (hHGC) (Chorulon, Intervet, Boxmeer, Holanda). -MBS 10x (Modified Barth´s Saline): NaCl 880 mM, KCl 10mM, MgSO4 10 mM, HEPES 50 mM pH 7,8, 25mM NaHCO3, pH 7,8 ajustado con NaOH 5M. -MBS 1x/Ca: MBS1x, CaCl2 0,7 mM. -MBS 0,1x: MBS 1x/Ca 0,1x -MBS 0,5x: MBS 1x/Ca 0,5x -MBS High-Salt: MBS1x/Ca, NaCl 108 mM. Cultivo Celular: -Medio de disección: MBS 0.5x -Medio de disociación: NaCl 116 mM, KCl 0,67 mM, EDTA 0,4 mM y Tris 4,6 mM, pH 7,8 ajustado con HCl. -Medio de cultivo: NaCl 116 mM, KCl 0,67 mM, MgSO4 1,31 mM, CaCl2 10 mM y Tris 4,6 mM, pH 7,8 ajustado con HCl. -Placas de cultivo Petri de plástico 35 mm de diametro (Falcon Primaria, Falcon, EE.UU.). 45
-Pinzas nº 5 (A. DUMONT y FILS, Suiza). Registros electrofisiológicos: -Capilares de vidrio para determinación de microhematocrito (BLU-TIP, OXFORD, St. Louis, EE.UU.). -Medio de registro extracelular para el registro de la corriente de sodio dependiente de potencial eléctrico (INa): 40 mM NaCl, 10 mM CoCl2, 3mM KCl, 80mM TEACl, 5mM HEPES, pH 7,4 ajustado con NaOH. -Solución <strong>del</strong> electrodo para el registro de la corriente de sodio dependiente de potencial eléctrico (INa): 100 mM CsCl, 10 mM TEACl, 10 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7,4 ajustado con CsOH. Biología Molecular Síntesis de ribosondas y mRNA: -Acetato de sodio (Merck, Darmstadt, Alemania). -Agarosa (Sigma, St. Louis, EE.UU.). -Cloroformo (Merck, Darmstadt, Alemania). -DEPC, Dietilpirocarbonato (Sigma, St. Louis, EE.UU.). -DTT (Promega, Madison, EE.UU.). -Etanol (Merck, Darmstadt, Alemania). -Fenol (Merck, Darmstadt, Alemania). -ATP, adenosina trifosfato (Roche, Alemania). -CTP, citosina trifosfato (Roche, Alemania). -GTP, guanosina trifosfato (Roche, Alemania). -UTP, uridina trifosfato (Roche, Alemania). -DIG-11-UTP, uridina trifosfato conjugado a digoxigenina (Roche, Alemania). -RNAsin, inhibidor de RNAsas (Roche, Alemania). -Amortiguador TE (TrisHCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4). 46
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Universidad de Chile, Facultad de M
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Quisiera agradecer muy especialment
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