Participación del Factor Silenciador Neuronal Restrictivo - Tesis ...

anti-digoxigenina conjugado a fosfatasa alcalina en una dilución de 1/3.000 en
MAB/BMBR. Finalmente, se retiró el anticuerpo en exceso con seis lavados con
MAB de media hora cada uno. Para la detección de los RNA mensajeros de
interés, los embriones se ambientaron en solución AP con dos lavados de cinco
minutos cada uno, luego se agregaron los sustratos BCIP y NBT 35% y 45%
respectivamente en solución AP y se incubaron en oscuridad a 37°C durante al
menos una hora o hasta que el color púrpura del precipitado fuese visible (BCIP
es sustrato de la fosfatasa alcalina y NBT funciona como un aceptor de
electrones, ambos forman precipitados). Una vez realizada la detección, los
embriones se fijaron en una solución 4% formaldehído en PBS 1x durante una
hora. Posteriormente, se hicieron tres lavados de 5 minutos y un lavado de una
hora en PBS 1x, para finalmente blanquear los embriones durante 3 horas
expuestos a luz fluorescente en solución de blanqueo (ver Materiales). Los
embriones enteros se observaron y fotografiaron con luz incidente (lupa
estereoscópica Leica MZ12) y una cámara digital Nikon Coolpix 5000, Japón.
Las imágenes fueron procesadas con el programa Adobe Photoshop 7.0.
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